我设计引物设计改变了一个序列中的2个碱基。...

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2011-10-01 21:15 标签： 引物设计
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从这个质粒图上看，想用XbaI做酶切位点的话，设计引物是不是要补两个碱基？
质粒融合表达部分的序列
我想用EcoRI和XbaI做酶切位点
EcoRI是不是需要在我设计的引物的GAATTC后面补一个碱基，再加我的目的基因呢？
还有后面的XbaI，为什么要设计成这个样子，这样的话要想表达出后面的his标签，是不是需要在TCTAGA前面补两个碱基？
但是我一个师姐完全没管后面的XbaI，直接按照表达的氨基酸设计的引物序列，也就是目的基因是三的倍数
然后过镍柱也纯化出来了？所以说到底加不加碱基也搞不懂了···
望了解的朋友赐教！非常感谢
她用的第一个限制酶是XhoI，然后加了一段就是质粒上面的序列，到多克隆位点前面，也就是质粒图上翻译出的那个Ala（GCA）就加自己的目的基因了
首先我不清楚那个ClaI指着的框，框住6个碱基是啥意思，她这样会不会断开某个表达的序列
单说上游表达应该是没问题
但是下游她也是用的XbaI，没多加碱基，就那么表达的，她现在毕业一年多了也找不到当时测序回来的邮件了，按理说她这样的话后面应该表达不出his标签啊···
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随时随地聊科研PCR引物设计中,引物上是否需要每个碱基都与模板链结合?为了得到想要的Tm值,或是保证长度,不产生二聚体等,可不可以有在引物上添加一些不配对的碱基?如下图：可以的话,会对扩增有影响么?如果不可以,为什么?
可以在引物上添加不配对的碱基,但是在引物的3‘端,至少有三个碱基是严格配对的.但是这样的操作主要是为了添加酶切位点或者flag等.Tm值是根据两条链的退火情况来计算,不配对的碱基不算在内,所以你添加不配对的碱基对于Tm值几乎没有影响.保证长度--没有必要添加不配对的碱基.不产生二聚体--也没有必要,引物自身的碱基配对对于扩增影响不大,引物间的二聚体可以根据引物位置的选择来避免,无法避免时要保证3’端无配对.所以不建议添加不必要的碱基来设计引物.（某些干扰实验除外）
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我觉得不一定需要，但是不配对的碱基数量要尽可能的少，而且关键位置如酶切位点或是活性位点等要尽可能保守。
引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。
引物上的碱基不是每一个都必须与模板链互补配对的，但是像你图上所示的那种设计是不行的，一般引物的5‘端可以完全不与模板一样，这样你可以在PCR中引物酶切位点等，但是3’端必须是与模板链结合的，因为Taq酶是按5-3方向延伸的，3‘端如果翘起的话，是不能延伸下去的，如果你的引物3’端一段与模板下游某处能结合，那就变成了deletion某段的PCR了...
扫描下载二维码PCR中引物是和谁要互补1.PCR中引物是要和哪条链互补?是我要测目的基因的链,还是其互补链?2.设计的引物可以通过序列库查到其碱基的表达,那么过去设计引物,有很多未知的序列,过去的人怎么设计的?
1、目的基因序列对应氨基酸序列,为正义连,上游引物即正向引物是该链中的序列,与反义链互补.下游引物是反义链中的序列,与正义链--目的基因序列互补.2、这个问题问得不太清楚.对于某物种未知基因的序列：查找同源基因序列,设计简并引物.
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模版链上的目的基因。引物的互补链就在模板上。引物是针对目的基因上下游序列设计的，而引物的序列不影响表达。
1.引物有双向，即正向和反向引物，分别和反义链和正义链互补，产物为包括引物序列在内的中间序列，如果你是单练底物，引物就和该单练互补。2.如果对未知序列扩增，通常使用随机引物，这样可以得到全长序列。
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设计引物如何设计酶切位点
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&&设​计​引​物​如​何​设​计​酶​切​位​点​,​做​分​子​研​究​的​宝​典​。
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你可能喜欢再设计引物时,添加酶切位点和标签后,正反两个引物相差20个碱基,但在添加前相差不大,
标签是指的表达标签么?如果是表达标签的话,载体上没有么?通常表达标签不是通过引物引入的,而是载体本来带有的,这个需要确认一下.另外,引物的使用主要是看Tm值的差异,如果设计后,两条引物的Tm值相差过大,是不能够使用的,因为在退火时,找不到合适的退火温度.因此不能简单通过长短进行判断,需要根据两条的Tm值比较.一般引物设计软件上都有,如果相差太大,没法用.另外,引物的长度也是有一定的限制的,20-35的长度比较理想,过长和过短都会个扩增带来麻烦,限制相差就差了20个,感觉有条引物太长了.确认下,标签是不是一定要带在上面.
恩，表达载体上没有，Tm相差应该在什么范围内呢？
以前自己设计的时候，都是尽量控制在5C以内。不过有的时候确实很难满足要求，如果一端引物太长了，另一端的引物为了配合也要相应延长的。20个bp没法补过来。如果设计完，一条引物Tm值是70多，另一条只有40，PCR就得靠运气了。或者是买那种扩增能力和抗干扰能力都比较强的酶来做。
你看看现在软件上给出的评分怎么样。有时候还是得通过PCR才能判断引物到底合不合适。尤其这样要加入比较长的序列的。先试试看。
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相差20个那得有40多bp？ 太长了吧。。。。
6Xhis，再加上酶切位点就有27个碱基了
载体上没带标签么 你应该先把标签插进去 再把片段插后面
个人经验,其实无所谓.我在后面加过18bp的一段序列，没问题。 前面10个循环把退火温度适当的低一点,用你没加标签,没加位点的退火温度,然后再用高的退火温度扩20-30个循环,一般是没有什么问题的。引物只能这样设计了，不好用也只能用这个了。...
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