蛇葡萄素碱性氨基酸助溶体系及其抗肿瘤活性研究的制作方法
专利名称蛇葡萄素碱性氨基酸助溶体系及其抗肿瘤活性研究的制作方法
技术领域本发明涉及药物制剂领域。更具体而言，本发明涉及具有提高的溶解性和 稳定性的蛇葡萄素制剂。
背景技术蛇葡萄素(Ampel叩sin， AMP)为蛇葡萄属植物的提取物，属多酚羟基双氢 黄酮醇类，相对分子量356，分子式为(^H20，其纯品为淡黄色颗粒 状。AMP分子中含有6个酚羟基，具有弱酸性，等电点接近pH值5.0左右(孙文基 等主编，《天然活性成分简明手册》，中国医药科学出版社，)。
AMP具有毒性低、来源广泛、提取率高的优点，但其稳定性较差，易发生 氧化反应，不溶于氯仿、乙醚，易溶于乙醇、甲醇、二氯甲烷和二甲基亚砜 (DMSO)(刘德育等，蛇葡萄素微囊的制备，中药材，2003， 26(5):355-357.)。 AMP微溶于水，25。C时在水溶液中的溶解度仅为0.2mg/ml(Li-Ping Ruan等， Improving the solubility of ampelopsin by solid dispersions and inclusion complexes(通过固体分散和包埋复合物改善蛇葡萄素的溶解性)，尸/za，所omed *a/， 38(4)。
近年来，发现蛇葡萄素在小鼠体内有抑制B16黑色素瘤生长的作用(刘德育 等，无棘根中蛇葡萄素的提取及其对黑色素瘤的抑制作用，中国医科大学学报， 1999， 20(2) : 127-129)，在体外可显著抑制肿瘤细胞人鼻烟癌HK-1 、人乳腺癌 MCF-7细胞增殖(刘德育等，蛇葡萄素的抗肿瘤作用癌症，Chinese Journal of Cancer, 2001， 20(12):)、人早幼粒细胞白血病HL-60、 K562细胞(周 宁宁等，无刺根中蛇葡萄素体外抗肿瘤作用研究，广东药学，2000， 10(4):7-8)。 蛇葡萄素对人肺癌GLC-82裸鼠移植瘤具有显著的抑制作用，提示AMP可能是一 种广谱抗肿瘤药物，并且AMP是一种低毒的抗肿瘤药物，具有较好的开发前景 (曾飒等，蛇葡萄素对人肺癌GLC282裸鼠移植瘤的抑制作用，中药材，2004， 27(11):842-844.)。
4虽然已证实了蛇葡萄素有极强的抗肿瘤作用，但其在水中极微溶解，这使 其难用于临床。如何提高AMP溶解性和溶解稳定性，制备适于临床应用的药物 剂型，是目前蛇葡萄素研究中亟待解决的关键问题。
本发明正是针对上述的问题，提供了一种具有提高的稳定性和溶解性的蛇 葡萄素注射剂和粉针剂。
在本发明的第一方面，提供了一种蛇葡萄素组合物，其包含如下组分
a) 蛇葡萄素；和
b) 碱性氨基酸，其选自L-精氨酸、L-赖氨酸或它们的组合；
其中，组分a)与组分b)的重量比为i : i i : io，优选i : i i : 8，更优选i : 卜i : 6。
在一个优选例中，组分a)与组分b)的摩尔比为i : 2.5 1 :io，优选i : 3 1 : 8，更优选i : 3 1 : 6。
在一个实施方式中，所述组合物选自蛇葡萄素注射液或蛇葡萄素注射用无菌 粉末。
在一个优选例中，所述组合物为蛇葡萄素注射液，其中以注射液的体积为基
准计，蛇葡萄素的浓度为0.01 500mg/ml，优选0.03 400 mg/ml，更优选0.05 300 mg/ml 。
在另一个优选例中，所述注射液中的溶剂为注射用水、磷酸盐缓冲液、丙二 醇水溶液、枸橼酸缓冲液、醋酸缓冲液或它们的组合。
在另一个优选例中，所述组合物为蛇葡萄素注射用无菌粉末。 在另一个实施方式中，所述组合物还包括组分c)pH调节剂。
在另一个实施方式中，所述组分C)选自枸橼酸、盐酸、磷酸盐缓冲液、醋
酸缓冲液或它们的组合，从而使得组合物溶液的pH为5 9，优选pH为5.0 8.5。 在-一个优选例中，所述溶液的pH为5.5 8.0，优选6.0 7.5，更优选6.5 7.2。 在另一个实施方式中，所述组分c)为枸橼酸，且组分b)碱性氨基酸与组分c)枸
橼酸的重量比为i : o.05 i : i，优选i : o.i i : 0.8，更优选i : 0.15 1 : o.5。 在一个优选例中，所述组分b)碱性氨基酸与组分c)枸櫞酸的摩尔比为i : o.08 i : l，优选i : o.i i : 0.8，更优选i : o.i5 i : 0.5，最优选i : o.2 i :
0.4。在另一个实施方式中，所述组合物还包括d)除pH调节剂以外的其它药学上 可接受的载体和/或稀释剂。
在一个优选例中，所述药学上可接受的载体和/或稀释剂选自注射用水、 磷酸盐缓冲液、丙二醇水溶液、乳糖、枸橼酸缓冲液、甘露醇、蔗糖或葡萄糖。
在本发明的第二方面提供了一种蛇葡萄素组合物，其包括
a) l-5重量份的蛇葡萄素；
b) l-50重量份的碱性氨基酸，其选自L-精氨酸或L-赖氨酸；
C)0.05-l重量份的pH调节剂，其选自枸橼酸、磷酸盐缓冲液、醋酸或它们的 组合；和
d)除pH调节剂以外的其它药学上可接受的载体和/或稀释剂。 所述组合物的水溶液中蛇葡萄素浓度为0.01 500 mg/ml，且pH为5 9。 在本发明的第三方面提供了本发明蛇葡萄素组合物的制备方法，所述方法 包括步骤混合组分a)蛇葡萄素、组分b)碱性氨基酸以及任选的组分c)pH调节 剂和组分d)除pH调节剂以外的其它药学上可接受的载体和/或稀释剂D 在一个优选例中，所述步骤是在无菌条件下进行的。
在一个优选例中，所述方法还包括对得到的溶液进行冷冻干燥以获得注射 用无菌粉末。
在一个实施方式中，所述蛇葡萄素组合物是蛇葡萄素注射液，且该方法包
(i) 混合组分a)蛇葡萄素；b)碱性氨基酸；以及d)除pH调节剂以外的其它药
学上可接受的载体和/或稀释剂，以形成蛇葡萄素溶液；
(ii) 加入c)pH调节剂，调节溶液pH至5 9;和
(iii) 对步骤(ii)所得的溶液进行去除热原和灭菌，从而获得蛇葡萄素注射液， 其中以注射液的总体积为基准计，蛇葡萄素的浓度为0.01 300 mg/ml。
在一个优选例中，所述蛇葡萄素组合物是蛇葡萄素注射用无菌粉末，所述 方法包括
(i) 混合a)蛇葡萄素；b)碱性氨基酸；以及d)除pH调节剂以外的其它药学上
可接受的载体和/或稀释剂，形成蛇葡萄素溶液；
(ii) 任选地加入C)pH调节剂；
(iii) 对步骤(ii)所得的溶液进行去除热原和灭菌；和
(iv) 对步骤(iii)的溶液进行干燥，从而获得蛇葡萄素注射用无菌粉末，其中，所述无菌粉末在使用前可配制为pH为5 9的注射液。
在另一优选例中，所述蛇葡萄素组合物是蛇葡萄素注射用无菌粉末，所述
(i) 充分混合a)蛇葡萄素；b)碱性氨基酸；C)碱性氨基酸；以及任选的d)pH 调节剂；
(ii) 在无菌条件下将步骤(i)所得混合物制成无菌粉末；
(iii) 分装所述无菌粉末，
其中，所述无菌粉末在使用前可配制为pH为5 9的注射液。 在本发明的第四方面，提供了一种对肿瘤治疗具有协同作用的药盒，所述 药盒中包括
A) 治疗有效量的本发明的蛇葡萄素组合物；
B) 治疗有效量的卡铂。
在一个优选例中，所述药盒中蛇葡萄素组合物与卡铂的重量比为l : 10
io : i，优选i : 8 8 : i，更优选i : 5 5 : i。 在另一优选例中，药盒中还使用说明书。
在另一实施方式中，提供了本发明的蛇葡萄素组合物在制备用于协同治疗 肿瘤的药盒中的用途，其特征在于，所述药盒还包含卡铂。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而 易见的。
图l所示为酸葡萄素(AMP)和蛇葡萄素-精氨酸-枸橼酸(AAC)对人肺腺癌 SPCA-1细胞增殖的抑制作用。其中，横坐标为用药浓度，纵坐标为抑制率(IR %),细胞浓度为5.5Xl()4个细胞/ml。
图2所示为蛇葡萄素-精氨酸-枸橼酸(AAC)与卡铂在治疗荷有人肺癌 GLC-82的Balb/c nu.nu裸鼠时的协同作用。
图3所示为在蛇葡萄素-精氨酸-枸櫞酸(AAC)与卡铂协同治疗下的荷有人 肺癌GLC-82的Balb/cnu.nu裸鼠肿瘤照片。其中，第一组为对照组；第二组为卡 钼40 mg/kg组；第三组为AAC 200mg/kg组；第四组为卡铂40 mg/kg+ AAC 200mg/kg组。
具体实施例方式
蛇葡萄素有极强的抗肿瘤作用，但其在水中的溶解度仅为0.2mg/ml，这使 其难以应用于临床。本发明人通过长期而深入的研究发现采用碱性氨基酸助溶 可提高蛇葡萄素在水中的溶解性，并能使其溶液保持一定的溶解和化学稳定 性。本发明人还发现在碱性氨基酸助溶的蛇葡萄素溶液中进一步加入诸如枸橼 酸等的pH调节剂不仅可将pH调整至更适于生理应用的范围，还可进一歩提高蛇 葡萄素的溶解稳定性。在此基础上申请人完成了本发明。
具体而言，本发明的目的在于选择有效的助溶剂，并通过调整有效助溶 剂的用量和液体的pH值，从中筛选出适宜的助溶剂配方，从而获得溶解度高、 稳定性好且适于临床用药的蛇葡萄素组合物。
为此，本发明人在蛇葡萄素溶液的配制中加入不同摩尔比例的碱性氨基 酸，室温下观察A M P溶解性与溶解稳定性。通过该试验观察到L - A r g和L - L y s对 AMP均有助溶作用，而L-Arg对AMP的助溶作用优于L-Ly s 。
本发明人还进一步选用溶解性高，溶解稳定的氨基酸作为助溶剂，用不同 pH值的磷酸盐缓冲液配制高浓度的AMP-氨基酸溶液，观察溶解性、溶解稳定性 及其pH值，并用不同pH值的磷酸盐缓冲液稀释，观察稀释液的溶解性、溶解稳 定性及其pH值。通过比较显示，本发明的AMP-L-Arg的溶解性、溶解稳定性及 化学稳定性均由于现有的AMP-Na。
此外，本发明人还制备了蛇葡萄素-L-精氨酸-枸櫞酸(AAC)溶液，并观察 其溶解稳定性，用高效液相法测定其化学成分稳定性，确定其溶解及药效的稳 定性，为人体用药提供依据，由此获得了终浓度和pH更符合动物试验及临床应 用的制剂。
经肿瘤细胞模型和荷瘤裸鼠模型试验进一步验证了本发明蛇葡萄素组合 物的细胞毒作用和体内抑瘤作用，以及其与卡铂联用时的协同抗肿瘤作用。
本发明中，术语"蛇葡萄素"、"本发明的活性物质"和"活性药物"可 互换使用，均指作为组合物中活性成分的蛇葡萄素化合物。
本发明所用的蛇葡萄素，可从蛇葡萄属或其它含有该物质的植物中提取获 得，也可通过化学合成的方法合成。碱性氨基酸
本发明人通过研究发现碱性氨基酸可用于蛇葡萄素的助溶中。本发明中， 术语"碱性氨基酸"、"本发明的助溶剂"可互换使用，其加入可提高蛇葡萄 素溶液中活性物质的溶解性和稳定性。本发明所用的碱性氨基酸包括但不限 于L-精氨酸、L-赖氨酸或它们的组合，优选L-精氨酸。
本发明中，术语"药学上可接受的"成分是指适用于人和/或动物而无过 度不良副反应(如毒性、剌激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。 虽然本发明不希望受限于理论，但本发明中所用助溶剂的助溶机理可能是
由于AMP等电点接近pH值5.0左右，其分子中含有6个羟基，呈弱酸性；而碱性 氨基酸为两性电解质，赖氨酸的等电点为9. 74，精氨酸的等电点为IO. 76，可 在酸性溶液中与质子(H+)结合成带正电荷的阳离子(-NH3+) 。 AMP分子中羟基上 的H+与碱性氨基酸结合，从而使得蛇葡萄素的溶解度增加。
选用碱性氨基酸，尤其是精氨酸作为助溶剂具有如下优点l.碱性氨基酸 性质稳定，在水中溶解不产气(C02); 2.本发明所用的碱性氨基酸不含钠离子， 而且对患心脏病、高血压、肾病、肝腹水等需要限制钠离子摄入的患者使用更 安全；3.碱性氨基酸，尤其是精氨酸在人体内参予很多的生理作用例如肝脏 中氨的代谢、精子的形成、伤口的愈合与免疫系统的维持等，因此补充碱性氨 基酸还具有相关营养作用。
为了使本发明组合物的pH更符合动物试验和临床应用的要求，可在本发明 用碱性氨基酸助溶的蛇葡萄素组合物中进一步加入药学上可接受的pH调节剂。
本发明中，术语"pH调节剂"和"酸性pH调节剂"可互换使用。所述pH调 节剂优选不仅可调节pH，还可进一步起到助溶和稳定溶液的作用。可用于本发 明的pH调节剂包括但不限于枸橼酸、盐酸、憐酸盐、醋酸或它们的混合物， 优选枸橼酸。
选用枸橼酸作为pH调节剂，并同时起到助溶和稳定作用，具有很多优点 首先，枸橼酸化学性质稳定，对其液体制剂进行高温灭菌也不会破坏其化学结 构；其次，枸橼酸在常用注射用溶剂中较易溶解；此外，当与碱性氨基酸配合
使用时，还可加速碱性氨基酸的溶解。助溶剂组合
本发明还提供了一种"助溶剂组合"。本发明中，术语"助溶剂组合"和 "助溶体系"可互换使用，均指由本发明中碱性氨基酸与具有助溶作用的酸性 pH调节剂组成的助溶组合，其助溶效果优于单用碱性氨基酸或酸性pH调节剂本身。
不希望受限于任何理论，本发明助溶剂组合可获得更好的助溶效果可能是
因为虽然本发明助溶剂组合中的两种成分各自具有助溶作用，但单用本发明
的碱性氨基酸会导致溶液pH偏高，而单用酸性pH调节剂则会导致溶液pH偏低，
将两者组合使用可在助溶的同时获得可使活性成分稳定于溶液中的PH范围；并
且，本发明酸性pH调节剂还可进一步促进碱性氨基酸的溶解，以形成更稳定的 溶液体系。
虽然本发明中采用蛇葡萄素来证明本发明助溶体系的优异助溶作用，但本 领域技术人员应理解，该助溶体系也可用于其它类似的活性成分的助溶中。
本发明的助溶剂组合中，碱性氨基酸与酸性pH调节剂的比例优选使得所得 溶液的pH为5. 0 8. 5，优选5.5 8.0'更优选6.0 7.5，最优选6.5 7.2。其中， 优选的组合为L-精氨酸或L-赖氨酸与枸橼酸的组合，其重量比为l : 0.05 1 :
i，优选i : o.i i : 0.8，更优选i : o.i5 i : 0.5。
就蛇葡萄素溶液而言，虽然单独采用本发明的碱性氨基酸，可对人参皂苷
-Rd注射液起到一定的助溶作用，但更为优选的是采用碱性氨基酸与酸性pH调
节剂的助溶剂组合。
可在本发明的蛇葡萄素中按比例先加入碱性氨基酸或PH调节剂，或同时加
入这两种物质。 蛇葡萄素组合物
本发明提供了一种蛇葡萄素组合物，其至少包含活性成分蛇葡萄素和作为 助溶剂的碱性氨基酸。本发明中术语"蛇葡萄素组合物"和"含有蛇葡萄素的 组合物"可互换使用。活性成分和碱性氨基酸的重量比为i : i i : io，优选i : 1 1 : 8，更优选i : 1 1 : 6。在另一优选实施方式中，活性成分和碱性氨基酸 的的摩尔比为i : 2. 5 1 : 10,优选i : 3 1 : 8，更优选i : 3 1 : 6。
本发明的蛇葡萄素组合物还可包含上文所述的pH调节剂，优选为具有助溶 作用的pH调节剂，最优选枸橼酸，从而使得组合物溶液的pH为5. 0 8. 5，优选5. 5 8.0，更优选6.0 7. 5，最优选6.5 7. 2。碱性氨基酸与pH调节剂的重量比为l :
o. 05 1 : i，优选i : o. 1 1 : o. 8，更优选i : o. 15 1 : o. 5。在另一优选实施 方式中，碱性氨基酸与pH调节剂的摩尔比为i : o.08 i : i，优选i : o. i i : o. 8，更优选i : o. 15 1 : o. 5，最优选i : o. 2 1 : o. 4。
本发明的蛇葡萄素组合物还可包括除pH调节剂以外的药学上可接受的载
体和/或稀释剂，包括但不限于药学上常用的溶剂，如水、丙二醇、乙醇、 聚乙二醇等，优选水、丙二醇或它们的组合；渗透压调节剂，例如葡萄糖等； 抑菌剂，例如苯甲醇、羟苯丁酯等；抗氧化剂，例如硫脲等。在《雷明顿药物 科学》(Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack Pub. Co. ， N. J. 1991 年)中可找到关于药学上可接受的载体的充分讨论。本领域技术人员应理解， 所述药学上可接受的载体和/或稀释剂不会阻碍活性物质的药学活性和药效， 并可根据具体需要选择适当的载体和/或稀释剂，并确定它们的用量。
本发明的组合物在水中的溶解浓度可提高到50 500 mg蛇葡萄素/ml溶液，优 选75 400 mg蛇葡萄素/ml溶液，更优选100 300 mg蛇葡萄素/ml溶液。当然，在 使用中也可根据需要配制蛇葡萄素的稀溶液，例如配制浓度为0.01 50 mg蛇葡萄 素/ml溶液，优选O. 03 30 mg蛇葡萄素/ml溶液，更优选O. 05 20 mg蛇葡萄素/ml 溶液的蛇葡萄素稀溶液。
在使用前，本发明组合物中的各组分可单独或相互组合地置于不同容器 中，例如将蛇葡萄素和碱性氨基酸置于一个容器中，而将pH调节剂与药学上可 接受的稀释剂(如与水配制成溶液)置于另一容器中。本领域技术人员可根据具 体需要和应用来确定组合物的具体形式和分配。因此，本发明还包括包含本发 明组合物各组分的药盒。
本发明的组合物可以本领域已知的制剂形式存在，优选以注射液形式和注 射用无菌粉末形式存在。在一个具体实施方式
中，所述组合物为蛇葡萄素注射液， 其中以注射液的体积为基准计，蛇葡萄素的浓度为O. 01 500 mg/ml，优选O. 03
400 mg/ml，更优选O. 05 300 mg/ml，且pH为5 9,优选6. 0 7. 5。
在本发明的优选实施方式中提供了一种蛇葡萄素组合物，其中包括1-5 重量份的蛇葡萄素；l-50重量份的碱性氨基酸，其选自L-精氨酸或L-赖氨酸；0.05-1 重量份的pH调节剂，例如选自枸橼酸、磷酸盐缓冲液、或它们的组合；和药学 上可接受的载体和/或稀释剂，所述组合物的水溶液中蛇葡萄素浓度为0.01
300 mg/ml'且pH为5 9。本发明还进一步提供了蛇葡萄素组合物的制备方法，所述方法包括将蛇葡 萄素与碱性氨基酸以及任选的其它组分混合。本领域技术人员可根据具体需要 和制备条件选择具体的制备工艺和步骤以及各组分加入的先后顺序，这并不超 出本发明的范围。
蛇葡萄素组合物与卡铂抑制肿瘤的协同作用
本发明的蛇葡萄素组合物具有提高的溶解度和稳定性，以及适宜的pH，可 方便地用于临床肿瘤的治疗。此外，本发明人通过研究还发现本发明的蛇葡萄 素组合物与抗肿瘤药物卡铂联用可更为有效地抑制肿瘤生长，两者具有协同作 用。由此，本发明还提供了蛇葡萄素组合物和卡铂在联合治疗肿瘤中的用途， 以及这两种药物在制备治疗肿瘤的药盒中的用途。
在本发明的一个实施方式中还提供了一种对肿瘤治疗具有协同作用的药
盒，所述药盒中包括治疗有效量的本发明蛇葡萄素组合物和治疗有效量的卡
铂。在一个优选实施方式中，所述药盒中蛇葡萄素组合物与卡铂的重量比为i : io io : i，优选i : 8 8 : i，更优选i : 5 5 : i。所述药盒中还可包括说明书、 容器、缓冲液等，这可由本领域技术人员根据具体用途和需要确定。
在本发明的一个实施方式中，联合使用蛇葡萄素组合物和卡铂的治疗方案 可为先给予首剂卡铂和本发明的蛇葡萄素组合物，然后每日给予蛇葡萄素组合 物和隔日给予卡铂。具体的治疗方案可由临床医师根据病人的情况(例如年龄、 体重、病状等)、治疗的需要等确定。
本发明的优点
(1) 提供了具有提高溶解度和稳定性，以及适宜pH范围的蛇葡萄素组合物，
可将其作为临床用药用于肿瘤的治疗；
(2) 提供了一种助溶体系，所述系统包括碱性氨基酸和酸性pH调节剂，其可 用于提高蛇葡萄素或类似活性物质的溶解度和稳定性，并获得适宜的pH;
(3) 提供了一种临床治疗肿瘤的方法和药盒，其中采用了本发明的蛇葡萄素 组合物和常用抗肿瘤药物卡铂，获得了协同效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说
12明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百 分比和份数按重量计算。本发明实施例以及前文描述中的"室温"均指20 30
'c的温度。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
药品、试剂及仪器
蛇葡萄素(Ampel叩sin， AMP)由广东泰禾医药科技有限公司提供，纯度98. 8 °/0。 蛇葡萄素钠(AMP-Na)由广东泰禾医药科技有限公司提供，规格为lg/支，批 号 mg/支，批号051U5。 L-赖氨酸(L-Lys)上海康达氨基酸厂产品，批号8701 。
L-精氨酸(L-Arg)上海山蒲化工有限公司产品，批号，纸色谱合格。 枸橼酸为国产分析纯，上海试剂一厂生产，批号80-06-06。 卡铂(O. 1 g/支)齐鲁制药有限公司生产，批号5090061DA。 NaJHV 2H20为国产分析纯，北京红星化工厂生产，批号。 NaHA* 12H"为国产分析纯，西安化学试剂厂生产，批号920216。 0.2 mol/L的pH 5. 0磷酸盐缓冲液、0.1 mol/L的pH 6.0、 6.8的磷酸盐缓冲 液按中华人民共和国药典2005版二部(化学出版社，附录XVD缓冲液，2005. 1) 和《医用试剂与常用手册》(吉林科学技术出版社，1985年3月第1版)配制。
枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)、磷酸盐缓冲液(pH2.0):按中华人民共 和国药典2005版二部(化学出版社，附录XV D缓冲液，2005.1)(同上)配制。 Delta 320 pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品。 高效液相色谱仪，岛津公司LC-10AT。
实施例l.蛇葡萄素碱性氨基酸助溶体系的研究
通过比较L-赖氨酸(L-Lys)和L-精氨酸(L-Arg)对AMP的助溶作用及生成溶 液的溶解性和溶解稳定性，以确定一种能使AMP充分溶解且溶解性稳定并保留 原抗肿瘤活性的AMP制剂的制备方法。
13试邀方兹
AMP等电点接近pH值5.0左右，其分子中含有6个羟基，呈弱酸性；同时 L-Lys和L-Arg为碱性氨基酸，临床可用于人体，安全性可靠，为两性电解质， 等电点分别为9.74和10.76，可在酸性溶液中与质子(H+)结合成带正电荷的阳离 子(-NH3+)。为使AMP分子中羟基上的H与L-Lys或L-Arg结合，将AMP与L-Lys 或L-Arg按不同的摩尔浓度比(AMP : L-Lys二l :1、 1:2、 1:3、 1 : 4禾B1 : 5; 或AMP : L-Arg=l :1、 1 : 2和1 : 3)混合，加等体积的双蒸水，旋涡震荡使充 分溶解。观察在不同保存条件下，所制备的AMP溶液的溶解稳定性和pH值。
在上述试验的基础上用不同pH的缓冲盐(PBS)配制AMP-L-Arg溶液观察其 溶解稳定性和pH，或采用盐酸Arg配制AMP-盐酸精氨酸溶液，观察其水溶性的 变化。 试验兹菜
1.以50mg/ml计算AMP的用量，将AMP与不同摩尔浓度比的L-Lys混合配 制后，所得制剂在室温和4'C下的溶解性和稳定性如下表1中所示
表l.不同浓度L-Lys对50mg/ml AMP的助溶作用及溶液的溶解稳定性
AMP : L-Lys _溶液溶解性_
(M:M) 室温20 室温1.5h室温24 h
室温48 h 4 °C24 h
TT1 SS ii 未测
1 : 2 不溶 不溶未测未测 未测
1 : 3 不溶 溶解 少量药物析出药物析出药物析出
l:4 溶解 溶解未测 未测 未测
i : 5 溶解 溶解 溶解 溶解 溶解
表l显示AMP以50mg/ml计算用量，AMP与L-Lys按摩尔浓度比1 : 1、 1 : 2配制，室温条件下不能完全溶解；AMP与L-Lys按摩尔浓度比l : 3配制，室温 条件下需1.5 h才能溶解，室温及4匸保存，易于析出结晶；AMP与L-Lys按摩 尔浓度比l : 4配制时，室温条件下20min完全溶解；AMP与L-Lys按摩尔浓度比 l:5配制，室温条件下20min完全溶解，室温及4 'C保存，其溶解性稳定。
2.将AMP与L-Lys按摩尔浓度比l : 4混合配制，使溶液中AMP浓度为100、 200或300mg/ml，所得制剂在室温和4'C下的溶解性和稳定性如下表2中所示表2. L-Lys对不同浓度AMP的助溶作用及溶液的溶解稳定性
&table&table see original document page 15&/column&&/row&&table&表2显示当AMP与L-Lys按摩尔浓度比l : 4配制时，溶液中AMP的浓度为 100 mg/ml、 200 mg/ml，室温条件下20 min完全溶解，室温及4 'C保存，其溶 解性稳定；溶液中AMP的浓度为300 mg/ml，室温条件下需20 min完全溶解，室 温及4 i:保存，易于析出结晶。
3.以50mg/ml计算AMP用量，将AMP与不同摩尔浓度比的L-Arg混合配制 后，所得制剂在室温和4'C下的溶解性和稳定性如下表3中所示
表3.不同浓度L-Arg对50 mg/ml AMP的助溶作用及溶液的溶解稳定性
&table&table see original document page 15&/column&&/row&&table&
表3显示AMP与L-Arg按l : 1、 1 : 2摩尔比配制时，室温条件下不能完全溶 解；AMP与L-Arg按摩尔浓度比l : 3配制，室温条件下保存时其溶解性稳定， 所得溶液pH为8.89。
4.将AMP与L-Arg按l : 3摩尔比混合配制后，溶液中AMP浓度为50、 100 或200mg/ml，该溶液在室温和4。C下的溶解性和稳定性如下表2中所示
表4. L-Arg对不同浓度AMP的助溶作用及溶液的溶解稳定性
&table&table see original document page 15&/column&&/row&&table&表4显示AMP与L-Arg按l : 3的摩尔比配制后，溶液中AMP的浓度为50、 100和200 mg/ml，室温条件下20 min完全溶解，室温条件下保存，其溶解性稳定。
5.用不同pH值的PBS配制l : 3摩尔比的AMP : L-Arg，所得溶液的溶解稳 定性及pH值如表5所示
表5.用不同pH的PBS配制的AMP : L-Arg(M/M)=l : 3溶液的溶解稳定性及pH
用双蒸水(ml)1—1—
量PBS(pH 2.0)——0.51.5
PBS(pH 5.0)0.51.5——
溶液体积(ml)2.02.02.02.0
9.029.008.908.89
室温放置20 min溶解溶解溶解溶解
溶解稳定性室温放置4 h溶解溶解溶解溶解
室温放置24 h溶解溶解溶解溶解
承溶液中AMP的浓度为200 mg/ml，"一"为未加该成分，pH为25 'C测定。 由表5可见溶液中AMP的浓度为200 mg/ml，室温条件下20 min完全溶解，
室温条件下保存，其溶解性稳定。不同pH的磷酸缓冲液对其溶解性无明显影响，
25'C时的pH均为9.0左右。
6.配制AMP :盐酸-Arg的摩尔比为l : 3的溶液，以研究盐酸-Arg对100
mg/ml AMP水溶性的影响，结果如表6所示
表6盐酸-Arg对100mg/ml AMP水溶性的影响
浓度溶液溶解性
室温20 min室温4 h
室温24 h室温48 h
AMP 100 mg/ml不溶不溶 不溶未测
结果显示室温条件下，AMP在AMP :盐酸-Arg(M : M)=l : 3的溶液(AMP 的浓度为100 mg/ml)中不溶解。
祭菜分叛与/!/讼
蛇葡萄素(AMP)分子中含有6个酚羟基，具有弱酸性，AMP微溶于水，在水 溶液中的溶解度仅为0.2 mg/ml，研究显示蛇葡萄素在碱性溶液中的溶解度较 大，在水中溶解度较小，这可能是因为其结构中具有酚羟基，显弱酸性，能与 碱形成盐，从而增大溶解度。
本发明人利用碱性氨基酸L-Lys、 L-Arg的碱性性质，研究其对AMP的助溶 作用，结果显示AMP与L-Arg按摩尔浓度比l : 3配制，AMP浓度可达200 mg/ml，室温条件下20 min完全溶解，室温条件下保存，其溶解性稳定；AMP与L-Lys 按摩尔浓度比l : 3配制，AMP浓度达50mg/ml，室温条件下需1.5 h才能溶解， 室温及4 'C保存，易于析出结晶。但将AMP与L-Lys按摩尔浓度比l : 4配制， AMP浓度达200 mg/ml时，AMP溶解完全且所得溶液储存后溶解性稳定。
由上述可见，L-Arg与L-Lys对AMP均有助溶作用，但相比较而言，L-Arg 对AMP的助溶作用优于L-Ly s 。
实施例2.用不同pH缓冲液稀释的碱性氨基酸助溶蛇葡萄素溶液的溶解稳定性
注射液的pH值不能超过人的生理耐受范围， 一般pH可在4 9。小量静脉注 射液，由于血液有缓冲作用，pH可适当放宽， 一般可在3 10之间。而大量输 入时，如过酸过碱，将会引起酸碱中毒，故以接近血液pH(7.4)为宜。
AMP与L-Lys按摩尔浓度比l : 4配制，L-Arg按摩尔浓度比l : 3配制，AMP 浓度可达200 mg/ml， pH值在9.0左右，碱度偏高，为了更符合动物实验及临床 应用所需浓度及适宜的pH值，可对其进行稀释。因此，本实施例中通过比较L-赖氨酸(L-Lys)和L-精氨酸(L-Arg)对AMP助溶生成的溶液在不同pH值的磷酸缓 冲液中的溶解稳定性及pH值，以确定更符合动物实验需要及临床应用的AMP 制剂。 "'-發才兹
将AMP在L-Lys或L-Arg助溶作用下形成的溶液，用pH值5.0、 6.0、 6.8的磷
酸盐缓冲液稀释，观察在不同条件下保存，稀释液的溶解稳定性及25'C的pH值。
1.采用AMP: L-Lys二l:3或l:4配比的溶液，经pH5.0、 6.0或6.8的磷酸缓
冲液稀释后的溶解稳定性及pH值如表7和表8所示
表7. AMP丄-Lys二l:3(M/M)的AMP溶液经稀释后的溶解稳定性及pH值
稀释液(磷酸盐溶液的溶解性及pH值(25 °C)
缓沖液)的pH值室温20min室温2 h 室温24 h 室温48 h4 'C24 hPH
pH=5.0少量颗粒药物析出药物析出药物析出药物析出5.75
pH=6.0少量颗粒药物析出药物析出药物析出药物析出6.26
pH=6.8少量颗粒少量颗粒少量颗粒少量颗粒混浊7.01
AMP受试液浓度50 mg/ml， AMP终浓度为5 mg/ml
17表8. AMP:L-Lys= l:4(M/M)的AMP溶液经稀释后的溶解稳定性及pH值
稀释液(磷酸盐_溶液的溶解性及pH值(25 'C)_
缓冲液)的pH值 室温20min 室温6 h 室温24 h 室温48 h
4。C24h pH pH=5.0 少量颗粒 药物析出药物析出药物析出
药物析出 5.86
pH=6.0 少量颗粒 药物析出药物析出药物析出
药物析出 6.38
pH=6.8 溶解 溶解 溶解 溶解f^后認^ 7'27
AMP受试液浓度50 mg/ml， AMP终浓度为5 mg/ml
表7的结果显示AMP : L-Lys(M/M)=l : 3配制的溶液，在pH值5.0、 6.0、 6.8缓冲液中稀释，易于析出结晶。而表8则显示AMP : L-Lys(M/M)=l : 4配 制的溶液，在pH值5.0、 6.0的磷酸盐缓冲液中易于析出结晶，在pH值6.8的缓冲 液中溶解稳定，且25T时的pH为7.27。
2.将AMP与L-Arg摩尔比为l:3的助溶溶液用pH5.0、 6.0或6.8的缓冲液稀释
后，所得终浓度5mg/ml或1 Omg/ml的溶液的溶解稳定性及pH值如表9所示
表9.不同pH值缓冲液稀释后的L-Arg助溶的AMP溶液的溶解稳定性及pH值 —^MPAMP稀释稀释液(磷酸盐 溶液的溶解性及pH值(25 'C) =
浓度 后终浓度缓冲液)的pH值室温20min室温3 h
室温5 h室温24 h pH
pH==5.0溶解溶解药物析出药物析出5.93
c / , ,, 5 mg/ml mg/ml topH==6.0溶解溶解药物析出药物析出6.40
pH==6.8溶解溶解溶解药物析出7.26
pH==5.0溶解少量颗粒药物析出药物析出6.16
1A h ,■ 10 mg/ml mg/ml topH==6.0溶解溶解药物析出药物析出6.74
pH==6.8溶解溶解溶解药物析出7.9
表9显示AMP与L-Arg按摩尔浓度比l :3配帝U， AMP的浓度为200 mg/ml， 在pH值5.0、 6.0、 6.8的磷酸盐缓冲液中稀释为AMP终浓度5 mg/ml，在pH值5.0、 6.0磷酸盐缓冲液能溶解稳定3小时，pH值为5.9 6.4(25 。C)，在pH值6.8磷酸盐 缓冲液中能溶解稳定5小时，pH值为7.26(25 °C)。而AMP终浓度为10 mg/ml时， 在pH值5.0、 6.0磷酸盐缓冲液能溶解稳定3小时，pH值6.1 6.8(25'C)，在pH值 6.8磷酸盐缓冲液中能溶解稳定5小时，pH值7.91(25。C)。智荣分析与/!/论
AMP : L-Lys(M/M)=l : 4配制溶液，AMP受试液浓度50 mg/ml，在pH值6.8 缓冲液中稀释，AMP终浓度为5 mg/ml，在pH值6.8缓冲液中的溶解稳定，pH 7.27(25 。C)，十分适合动物实验及临床应用。AMP与L-Arg按摩尔浓度比l :3 配制，AMP的浓度为200 mg/ml，在pH值5.0、 6.0、 6.8磷酸盐缓冲液中稀释， AMP终浓度为5 mg/ml，在pH值5.0、 6.0磷酸盐缓冲液能溶解稳定3小时，pH值 5.9 6.4(25 。C);在pH值6.8磷酸盐缓冲液中能溶解稳定5小时，pH值7.26(25 'C)，适合临床和动物实验要求；AMP终浓度为10mg/ml，在pH值5.0、 6.0磷酸 盐缓冲液能溶解稳定3小时，pH值6.1 6.8(25 °C);适合动物实验及临床应用要 求。
L-Arg与L-Lys相比较，AMP与L-Arg、 L-Lys均按摩尔浓度比1 : 3配制的溶 液，在pH值5.0、 6.0、 6.8磷酸盐缓冲液中稀释，AMP终浓度为5 mg/ml时， AMP-L-Arg溶液比AMP-L-Ly s溶液更符合动物实验及临床应用的要求。
不足之处是L-Arg对AMP助溶制成的稀释溶液为AMP 5 mg/ml,只在数小时 内稳定，若要长期保存，则可将高浓度的原液制成冻干制剂，临用前用pH值5.0、 6.0、 6.8磷酸盐缓冲液稀释为所需浓度。
实施例3. AMP-L-Arg与AMP-Na溶解性、溶解稳定性及化学稳定性的比较
通过比较蛇葡萄素在L-精氨酸助溶形成的溶液(AMP-L-Arg， AA)与蛇葡萄 素钠(AMP-Na)的溶解性、溶解稳定性及化学成分稳定性，以便找到一种溶解性 更好，溶解稳定性更好的AMP制剂的制备方法，使AMP适宜进行动物实验并为 指导临床用药提供依据。 微方法
1. AMP-L-Arg与AMP-Na溶解性、溶解稳定性的比较 将AMP与L-Arg按摩尔浓度比l :3各自称重混合，在pH值5.0的PBS中溶解
得AMP-L-Arg(AA)溶液，将AMP-Na用pH值5.0的PBS溶解，比较两者溶解性、
溶解稳定性。
2. AMP-L-Arg与AMP-Na稀释液的溶解稳定性及pH值比较 按AMP浓度为200 mg/ml， AMP : L-Arg(M/M)=l : 3，力口pH 4.0枸橼酸-磷
酸氢二钠缓冲液1.5 ml溶解，再按L-Arg :枸橼酸(M/M)-1 : 0.2加入枸橼调pH值得200 mg/ml蛇葡萄素-L-精氨酸-枸橼酸(AAC)溶液，用NS分别稀释200 mg/m
的AAC溶液与200 mg/ml AMP-Na溶液(在pH值5.0的PBS中溶解)，比较两者稀释 液室温条件下的溶解稳定性及pH值。
3. AMP-L-Arg与AMP-Na的化学成分稳定性
按AMP浓度为200 mg/ml， AMP : L-Arg(M/M)=l : 3，力口pH 4.0枸橼酸-磷 酸氢二钠缓冲液1.5ml溶解，再按L-Arg :枸櫞酸(M/M"1 : 0.2加入枸橼酸调pH 值为7.2 7.4，所得AAC溶液取40 U 1用NS 3960 y l稀释为2 mg/取AMP-Na l支(50mg)用pH6.8的PBS稀释为8 mg/ml，再取l ml加1 ml pH6.8的PBS再力口2 ml NS得2 mg/ml。用高效液相法测定化学成分稳定性。
1. AA与AMP-Na的溶解性、溶解稳定性
表IO. AA与AMP-Na的溶解性、溶解稳定性&table&table see original document page 20&/column&&/row&&table&
表l的结果显示AMP与L-Arg按摩尔浓度比l : 3用pH值5.0的PBS溶解， AMP浓度可达200 mg/ml，室温条件下保存，48h溶解性稳定；AMP-Na用pH值 5.0的PBS溶解为50 mg/ml室温条件下保存，24 h溶解性稳定，100、 200mg/ml 配制时立即溶解，但室温条件下保存，30min即有药物析出。 2. AAC与AMP-Na稀释液的溶解稳定性及pH值
表l 1. AMP-Na溶解稳定性及pH值
&table&table see original document page 20&/column&&/row&&table&表12. AAC溶解稳定性及pH值 AAC(mg/ml)
pH值 30 min
Hi^ Tli 8h 24 h
如表11和12所示200 mg/ml的AAC 24 h溶解稳定，pH值7.37， 200 mg/ml AMP-Na用pH值5.0PBS溶解，当时立即溶解，pH值8.59，但室温条件下0.5 h药 物析出；40mg/ml AAC室温条件下8h溶解稳定，pH值7.13， 30 mg/ml AMP-Na 室温条件下24 h溶解稳定，pH值8.55; 30 mg/ml以下的AAC与AMP-Na的稀释液， 室温条件下保24 h溶解性均稳定；相同或相近浓度的AAC稀释液与AMP-Na稀 释液比较，AAC稀释液的pH值明显低于AMP-Na稀释液的pH值。 3. AAC与AMP-Na化学成分稳定性
表13.AMP-Na、 AAC溶液化学稳定性比较p士S)
测定时间AMP-Na(%) AAC(%)
24 h37.37±1.66** 50.25±0.62
表14.高效液相法测定AMP、 AAC出峰时间(min)测定时间AMP AAC
Oh 24 h13.64±0.01 13.62±0.05 13.76±0.05 13.70±0.02
如表13和14所示高效液相法测定24 h后AMP含量为2 mg/ml AAC溶液、 AMP-Na 2 mg/ml分别降解为0 h的50.25 %和37.37 %，化学成分稳定性明显降 低，但AMP含量为2 mg/ml的AAC溶液与AMP-Na 2 mg/ml比较AMP-Na 2 mg/ml 下降程度更大(PO.01);经高效液相法测定Oh、 24h的AAC和AMP-Na的出峰时 间，AAC与AMP-Na比较，无明显变化(PX).05)。 兹荣分析与^讼
本发明人在前期已成功地将AMP制备成钠盐(AMP-Na)，使AMP的溶解性 明显提高，溶解可达25 mg/ml(24 °C)，室温及4'C条件保存溶解性稳定。通过
解 少量颗粒 解 溶解 解 溶解 解 溶解 解 溶解
溶溶溶溶溶溶
萍萍挥萍萍牟
溶溶溶溶溶溶
早军军军库军
摔萍摔萍摔萍
角龟龟命角角
溶溶溶溶激溶
7 3 1 6 4 r
T T l c/^ 7. 7-
21AMP碱性氨基酸助溶体系的研究，发现AMP在碱性氨基酸助溶作用下，可大大 提高AMP的溶解性，溶解可达200 mg/ml。用pH 5.0的PBS分别溶解AMP-L-Arg 和AMP-Na，结果显示AMP在L-Arg的助溶作用下，溶解性明显提高，可达200 mg/ml，且溶解性稳定，而AMP-Na溶解性稳定只能溶解50 mg/ml。通过比较AAC 与AMP-Na的NS稀释液的溶解稳定性及pH值，结果显示两者溶解稳定性没有明 显差别，但与AMP-Na稀释液相同或相近浓度的AAC稀释液的pH值明显低于 AMP-Na稀释液的pH值，AAC不同浓度稀释液pH值范围为7.04 7.37，符合动 物实验及临床应用的要求，AMP-Na不同浓度稀释液pH值范围为7.99 8.59，酸 碱度偏高，不甚符合动物实验及临床应用的要求。
作为动物实验及临床应用的制剂，还需药物的有效化学成分稳定，因此对 2 mg/ml AAC溶液与2 mg/ml AMP-Na溶液作了比较，结果显示两者24 h分别降 解为O h的50.25 %和37.37 %，化学成分稳定性均明显降低，但AMP-Na 2 mg/ml 下降程度更大，已通过将AMP-Na作成冻干剂型克服了溶液化学不稳定的不足， 同样地，可以将AAC制备成冻干剂型克服此不足之处。
实施例4.蛇葡萄素-L-精氨酸-枸橼酸(AAC)溶液的稳定性
AMP-L-Arg(AA)溶液的pH值在9.0左右(25 。C)，通过在AMP-L-Arg溶液中 加入枸橼酸，使形成的AAC溶液的pH值在7.2 7.4左右(25。C)，符合动物实验 及临床应用的要求。再观察其溶解稳定性，用高效液相法测定其化学成分稳定 性，以确定其溶解及药效的稳定性，从而为人体用药提供依据。
1. 不同浓度枸櫞酸对AMP-L-Arg(AA)溶液稳定性及pH的影响 将AMP与L-Arg按摩尔浓度比l : 3各自称重混合，在pH 4.0的枸橼酸-磷酸
二氢钠缓冲液溶解，得到AMP-L-Arg(AA)溶液；然后在其中加入不同量的枸橼 酸，使形成的AAC溶液的pH值在7.2 7.4左右，室温下观察其溶解稳定性，用 生理盐水NS稀释，室温下观察稀释液稳定性及pH值(25 'C)。
2. 不同浓度蛇葡萄素-L-精氨酸-枸櫞酸(AAC)溶液的溶解稳定性和pH 按AMP浓度为200 mg/ml， AMP : L-Arg(M/M)=l : 3，力口pH4.0枸橼酸-磷酸
氢二钠缓冲液1.5 ml溶解，再按L-Arg :枸橼酸(M/M)-1 : 0.2加入枸橼酸71.7 mg 调pH值，所得AMP浓度为200 mg/ml的AAC溶液的配制方法，同比例称取AMP
2220mg， L-精氨酸29.4mg，加入1.5 ml枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.0)20倍稀 释液，溶解后得1.5ml，再加枸橼酸7.17mg，加入0.5mlNS溶液，得2 ml A AC 溶液，AMP浓度为10mg/ml，用NS稀释成不同浓度在室温条件下保存，观察其 溶解稳定性及pH值(25'C)。
3. 用高效液相测定其化学成分稳定性。
色谱柱为岛津VP-ODS C18(150X4.6 mm， 5 iim)柱，流动相为乙腈-2%乙 酸(l : 9)，流速l.O ml/min，检测波长2卯nm，柱温25 。C ，室温22-23 °C ，进 样量IO u 1。
4. 高浓度ACC对大鼠肌肉的刺激性 将200mg/ml的ACC和对照NS分别注射到大鼠肌肉中，一段时间后肉眼观察
和显微镜下观察肌肉有无异常。 試盈兹菜
1.不同浓度枸櫞酸对AMP-L-Arg(AA)溶液稳定性及pH的影响 AMP含量为200 mg/ml， AMP : L-Arg(M/M)=l : 3，力口pH 4.0枸橼酸-磷酸氢 二钠缓冲液溶解，再按L-Arg :枸橼酸(M/M)-1 : 0.2加入枸橼酸调pH值，所得 含AMP 200 mg/ml的AAC溶液在室温条件下保存，其溶解性稳定，pH值为7.2
7.4(见表15)。
表15.不同浓度的枸櫞酸对AA溶液pH值的影响
aaaac(amp :枸橼酸aac(amp :枸橼酸aac(amp :枸橼酸
溶液m/m=i :0.1)m/m=l : 0.15)m/m=l :0.2)
pH值(25 °c) 9.138.508.047.37
2.不同浓度蛇葡萄素-L-精氨酸-枸櫞酸(AAC)溶液的溶解稳定性和pH
含AMP 200 mg/ml的AAC溶液，用NS稀释成AMP 2 mg/ml以下的AAC水
溶液，在室温条件下保存，其溶解性稳定，pH值为7.05 7.06(25。C); AMP 40
mg/ml、 AMP 10mg/ml的AAC水溶液，在室温条件下保存，分别在8 h和24 h后
易析出结晶(见表16)。
表16.不同浓度AAC溶液的溶解稳定性及pH值
^ 溶液溶解性及pH (mg/ml)pH值(25。C)室温4 h
室温8 h室温24 h
解 溶解 溶解
解 微量药物析出药物析出 解 溶解 药物析出
4 1按含AMP 200 mg/ml的AAC溶液的配法，同比例配制AMP 10 mg/ml AAC
水溶液，室温条件下保存2h溶解性稳定，用NS稀释为AMP 5 mg/ml室温条件下
保存4 h溶解稳定；而稀释为AMP 2 mg/ml(包括2 mg/ml)以下室温条件下保存，
其溶解性稳定，pH值为6.44 6.53(25 'C)(见表17)。
表17. AMP 10 mg/ml AAC溶液稀释为不同浓度溶液溶解稳定性及pH值 體 溶液溶解性及pH (mg/ml) pH值(25。C)~~室温2 h
3. AAC水溶液的化学成分稳定性
高效液相法测定，AMP含量为40 mg/ml AAC溶液在6 h内化学成分稳定。 见(表18)。
_表18. AAC水溶液的化学成分稳定性_
时间(h) 0 12 6
峰面积: 495卯38
稳定性(％) 100
122.3 98.03397
高效液相法测定24 h后AMP含量为2 mg/ml AAC下降为O h的50.25 %，与
AMP2mg/ml比较稳定性明显下降，差别有显著性(PO.01)(见表19)
表19. AMP、 AAC溶液化学稳定性比较(^士S) —测定时间 AMP(%) AAC(%)
24 h 116.23士0.87 50.25士0.62**
经高效液相法测定O h、 24 h时AMP和AAC的出峰时间，AAC与AMP比较， 差别无显著性(PX).05)(见表20)。
0.06256.51
微小颗粒药物析出药物析出
溶解药物析出药物析出
溶解溶解溶解
溶解溶解溶解
溶解溶解溶解
溶解溶解溶解
溶解溶解溶解
溶解溶解溶解
溶解溶解溶解
萍萍萍军萍军萍萍军
溶溶溶溶溶溶溶溶溶
24表20.高效液相法测定AMP、 AAC出峰时间(min)
&table&table see original document page 25&/column&&/row&&table&
4.高浓度ACC对大鼠肌肉的刺激性
肉眼观察结果注射NS的大鼠肌肉无异常。而注射200 mg/ml AAC大鼠肌 肉中有色素沉着，部分肌肉颜色发黑。
显微镜下观察结果注射NS对照的大鼠肌肉肌束规则，紧密相接，细胞核 呈梭形，位于细胞边缘。而注射200 mg/ml AAC的大鼠肌束不规则，组织间隙 水肿、增宽，有少量炎性细胞。
结果提示高浓度AAC对肌肉有刺激性，不宜用其进行肌肉注射。 祭菜W讼与分^f
通过蛇葡萄素碱性氨基酸助溶体系的研究，发现AMP与L-Arg按摩尔浓度 比l : 3配制，AMP浓度可达200 mg/ml，室温条件下20 min完全溶解，室温条件 下保存，其溶解性稳定，双蒸水、磷酸盐缓冲液对其溶解性无明显影响，pH值 均在9.0左右(25 。C)，不能很好地满足动物实验及临床应用的要求。
按AMP含量为200 mg/ml， AMP : L-Arg(M/M)=l : 3，用pH4.0枸橼酸-磷酸 氢二钠缓冲液溶解，再按L-Arg :枸橼酸(M/M"1 : 0.2加入枸橼酸，所得AMP 含量为200 mg/ml的AAC溶液，pH值在7.2 7.4(25 'C)，符合临床和动物实验的 要求。
将200 mg/ml的AAC溶液用NS稀释为40 mg/ml,用高效液相法测定化学成 份稳定性，结果显示在6h内其化学成分稳定，pH值7.13(25 'C)，符合临床应用 及动物实验肌肉注射给药时浓度及pH值的要求。
研究表明高浓度体外抗肿瘤实验及临床大输液需要低浓度药物，因此将 200 mg/ml的AAC溶液用NS稀释为2 mg/ml。室温条件下保存，该稀释溶解性 稳定，pH〗直6.4 6.5(25 'C)，符合体外抗肿瘤实验和临床大输液应用要求，但 用高效液相法测定其化学成份24h降解为0h时的50.25 %，建议将200 mg/ml的 AAC溶液制成冻干制剂，临用时用NS稀释为2mg/ml使用即可克服此不足之处。
实施例5.蛇葡萄素(AMP)与蛇葡萄素-L-精氨酸-枸橼酸(AAC)溶液体外抗肿瘤 作用的比较微諸
比较AAC与AMP对人肺腺癌SPCA-1细胞的增殖抑制作用，初步探讨AAC 与AMP对SPCA-1细胞增殖具有明显抑制作用的细胞浓度，以考察AMP在制备 成AAC后其抗肿瘤活性有无明显变化。 试發方兹
1. 药物配制
AMP配制AMP粉末用5 。/。DMSO溶解并配成应用液浓度。 AAC酉己制称取AMP 20 mg， L-精氨酸29.4 mg，加入1.5 ml枸橼酸-磷酸氢 二钠缓冲液(pH4.0)20倍稀释液，溶解后得.5ml，再加枸橼酸7.17mg，加入0.5 mlNS溶液得2ml， AMP浓度为10mg/ml,用NS稀释成应用液浓度。
2. 细胞及培养
人肺腺癌SPCA-1细胞，购自中科院上海细胞生物研究所细胞库。细胞来源 于人原发性肺腺癌，为1980年培养并建系，形态为多形上皮样，群体倍增时间 约30小时。细胞用含IO °/。小牛血清和青、链霉素各IOO U/ml的RPMI 1640培养 液，置37 °C、 5%(]02的培养箱培养。
3. 比较试验
采用MTT法比较相同剂量A AC和AMP对人肺腺癌SPC A-1细胞增殖的抑制 作用。实验设阴性对照组、空白对照组、AMP组、AMP空白对照组、AAC组、 AAC空白对照组。每组中的各浓度设3个复孔。各组处理为，阴性对照组加 细胞不加药物；空白对照组加RPMI 1640不加细胞；AMP组细胞+AMP; AMP空白对照组RPMI 1640十AMP; AAC组细胞+AAC; AAC空白对照组 RPMI 1640+AAC。取对数生长期的SPCA-1细胞，用RPMI 1640培养液调整细胞 浓度至5.5X10MVml (5000个/孔)，在96孔培养板中以90 yl/孔加入细胞悬液， 10 "l/孔加入药物，培养48h。于实验终止前4h加入MTT(10 lU/孔)，实验终 止时加入IO % SDS(IOO yl/孔)，放置12h,震荡10分钟，于波长570 nm处测定 吸光值。根据下式计算抑制率(IR)，比较AMP和AAC对SPCA-l细胞的IR和ICso 值。
抑制率(，。"阴性0，^^gOD均值x證。
阴性OD均值
各组数据均为计量资料，用S士S表示，采用t-检验进行分析，用Excel-2003
26进行统计。 微淑
细胞浓度为5.5 X 10"个/ml，等剂量AMP和AAC对人肺腺癌SPCA-1细胞增殖 的抑制作用结果如图1和表21所示。
表21. AMP和AAC对人肺癌SPCA-1细胞增殖的抑制作用(48 h， n=3)
药物含量△OD570IR(%)昭/mlAMPAACAMPAAC
阴性0.442±0..010一一
250.411±0..
500.387±0...94
ic50——94.84 pg/ml86,74吗/ml
结果表明AMP和AAC对SPCA-1细胞均有明显地增殖抑制作用，处理时 间为48 h时，100吗/ml浓度时抑制作用最明显，AMP与AAC对SPCA-1细胞的 IR。/。分别为59.98 %、 61.86%, ICs。分别为96.18和86.74叱/ml，且在浓度为25
100 pg/ml的剂量范围内呈明显的剂量依赖性。相同剂量的AMP与AAC在570 nm 处的吸光值比较，无明显差异^&0.05)。 祭菜分^与/l/论
在本实施例中考察了将AMP制成AAC后，其抗肿瘤活性是否发生明显变 化，结果显示SPC-A-l细胞浓度为5.5Xl()4个/ml时，AMP、 AAC浓度为IOO吗/ml 时，对SPC-A-1细胞的增殖具有明显的抑制作用，AMP单独应用IR为59.98 0/0， 1(〕5。为96.18 (ig/ml， AMP在制备成AAC后，IR为61.68 %， 1(:5()为86,74 (ig/ml， 其抗肿瘤的药理活性无明显变化，且在25 100吗/ml剂量范围内的AAC单独应 用，对SPC-A-1细胞的增殖抑制作用存在量效关系。
实施例6.蛇葡萄素-L-精氨酸-枸橼酸(AAC)溶液体内抗肿瘤作用研究
研究AAC单独应用及与化疗药合用对人肺癌GLC-82细胞裸鼠皮下移植瘤 的抑制作用，确定AAC单独用药及与化疗药联合应用的体内抗肿瘤作用。 试验力一法
1.移植瘤种植收集处于对数生长期的GLC-82细胞(购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库)，用不含血清的RPMI 1640培养液调整细胞浓度至1.0X 1()7个/ml，按1.0乂106个细胞/只，在裸鼠(Balb/cnu.nu裸鼠，雌性，体重17
23 g,购自上海安本实验动物养殖厂)右侧背部皮下接种(O.l ml/只)。
2. 药物配制
200 mg/ml AAC的配制称取AMP 200 mg， L-精氨酸294mg,加入0.75 ml 枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH4.0)溶解后得l ml，再加枸橼酸71.7mg， pH值在 7.2-7.4(25 。C)。
40 mg/ml AAC的配制取200 mg/ml AAC 1 ml+4 ml NS， 0.22 u m微孔滤 器过滤除菌，pH值7.13(25 。C)。
卡铂的配制取注射用卡铂l支，加NS到25ml，即4.0mg/ml。 对照缓冲液的配制称取L-精氨酸294 mg，加入0.75 ml枸橼酸-磷酸氢二 钠缓冲液(pH4.0)，再加枸橼酸107.5mg(L-精氨酸枸櫞酸M : :M=1 : 0.3)溶解 后加4mlNS， 0.22 wm微孔滤器过滤除菌，pH值7.0左右(25 。C)。
3. 分组及给药
实验设PBS对照组，卡铂40 mg/kg(0.1ml/10g)组，单用AAC 200 mg/kg组和 AAC 200 mg/kg与卡钼40 mg/kg， 0.1 ml/10g联合用药组。裸小鼠于接种后瘤体 积平均长至100-300 mg时随机分组并给予药物治疗，给药方法为单用AAC 200 mg/kg， 0.05 ml/10 g，联合用药时，给予化疗药卡铂40 mg/kg， 0.1ml* 10 g-l， ip后30分钟再给AAC 200 mg' kg-l， 0.05 ml' 10g-l， im，卡铂隔日给药， AAC每日给药。每隔2日称体重1次。AAC配制后2h内使用，同时观察裸鼠有无 异常反应。
4. 观察指标和有效判定标准 抑瘤率(IR)及药物相互作用指数(CDI)的计算于末次给药后次日称体重，
处死动物，解剖剥取瘤块，称瘤重。按下式计算抑瘤率和药物相互作用指数 (CDI)。
抑瘤率(IR) % =,細糊g(gH合,翻,x!00% 、J 阴性对照组平均瘤重(g)
药物相互作用指数(CDI):」5
式中，AB为两药联合用药组与对照组瘤重的比值，A或B是各药单独用药 组与对照组瘤重的比值。当CDK1时，两药有协同作用；当CDK0.7时，协同
28作用非常显著。抑瘤率&30 %为无效；抑瘤率〉30 %并经统计学处理？&0.05
各组数据均为计量资料，用；士S表示，采用t-检验进行分析，用Excel-2003
进行统计。 试验錄菜
AAC的体内抗肿瘤作用研究结果见图2、图3以及表22:
表22. AAC与卡铂在治疗Balb/cnu.nu荷人肺癌GLC-82时的协同作用p士S， n=7) 组另寸 SIS 瘤重(g) IR(%) CDI
对照 —— 卡铀 40 mg/kg
AAC 200 mg/kg
AAC 200 mg/kg+卡钼40 mg/kg
与对照组比* P&0.0 5 ，与卡铂比AAP&0.01 。
1.10±0.77
0.58±0.14 47,78
0.93±0.60 15.84
0.32±0.06*AA 70.78 0.66
结果显示AAC 200 mg/kg单独用药组抑瘤率为15.84%，与对照组比可使 肿瘤重量减轻，但差别无显著性(pX).05)。卡铂组的抑瘤率为47.78%， AAC与 卡铂联合应用组抑瘤率为70.78%， AAC与卡铂联合应用组与对照组比较可使肿 瘤重量明显减轻(p〈0.05);与卡铂组相比可使肿瘤重量减轻(p〈0.01)，根据判定 标准AAC 200 mg' kg-l单独用药无效，但AAC 200 mg* kg-l与卡铂联合应用具 有明显协同抗肿瘤作用，CDI为0.66。
已有研究结果显示蛇葡萄素对人肺癌GLC-82裸鼠移植瘤具有显著的抑制 作用。本实施例研究了AAC单独应用及与化疗药合用对人肺癌GLC-82细胞裸鼠 皮下移植瘤的抑制作用，结果显示AAC 200 mg/kg单独用药可使肿瘤重量减轻， 抑瘤率为15.84%，根据判断标准，抑瘤率&30%为无效，但是AAC 200 mg/kg 与卡铂联合应用可使肿瘤重量明显减轻，抑瘤率为70.78%， CDI为0.66，提示 二者联合用药具有明显协同抗肿瘤作用，可将AAC作为抗肿瘤药在动物实验及 临床应用中与其他抗肿瘤药联合使用。
实施例7.蛇葡萄素-L-精氨酸(AMP-L-Arg)以及蛇葡萄素-L-精氨酸-枸橼酸 (AAC)注射剂以及冻干制剂的制备配方
AMP 200 mg
L-精氨酸294 mg
加入0.75 ml枸橼酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH 4.0) 溶解后得l ml
加枸橼酸71.7mg， pH值在7.2-7.4
按照以上配方制得的澄清溶液，经微孔滤膜过滤除菌，以l毫升为一个装 量单位，分装于容积为5毫升的管制瓶，置于冷冻干燥机中作脱水处理。冻干 时间为24-32小时。经冻干后的药品密封保存，注射前用无菌水溶解后直接使用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。
1.一种蛇葡萄素组合物，其包含如下组分a)蛇葡萄素；和b)碱性氨基酸，其选自L-精氨酸、L-赖氨酸或它们的组合；其中，组分a)与组分b)的重量比为1∶1～1∶10，优选1∶1～1∶8，更优选1∶1～1∶6。
2. 如权利要求l所述的蛇葡萄素组合物，其特征在于，所述组合物选自蛇葡萄 素注射液或蛇葡萄素注射用无菌粉末。
3. 如权利要求l所述的蛇葡萄素组合物，其特征在于，所述组合物还包括组分c) pH调节剂。
4. 如权利要求3所述的蛇葡萄素组合物，其特征在于，所述组分c)选自枸 橼酸、盐酸、磷酸盐缓冲液、醋酸缓冲液或它们的组合，从而使得组合物溶液的pH 为5 9，优选pH为5.0-8.5。
5. 如权利要求3所述的蛇葡萄素组合物，其特征在于，所述组分c)为枸櫞酸，且组分b)碱性氨基酸与组分c)枸橼酸的重量比为i : o.05 i : i，优选i : o.i i : 0.8，更优选i : o.i5 i : 0.5。
6. 如权利要求l所述的蛇葡萄素组合物，其特征在于，所述组合物还包括d) 除pH调节剂以外的其它药学上可接受的载体和/或稀释剂。
7. —种蛇葡萄素组合物，其包括a) l-5重量份的蛇葡萄素；b) l-50重量份的碱性氨基酸，其选自L-精氨酸或L-赖氨酸；c) 0.05-l重量份的pH调节剂，其选自枸橼酸、磷酸盐缓冲液、醋酸或它们的 组合；和d) 除pH调节剂以外的其它药学上可接受的载体和/或稀释剂， 所述组合物的水溶液中蛇葡萄素浓度为0.01 500 mg/ml，且pH为5 9。
8. 权利要求l-7中任一项所述的蛇葡萄素组合物的制备方法，所述方法包 括步骤混合组分a)蛇葡萄素、组分b)碱性氨基酸以及任选的组分c)pH调节剂 和组分d)除pH调节剂以外的其它药学上可接受的载体和/或稀释剂。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述蛇葡萄素组合物是蛇葡萄素注射液，且该方法包括(i) 混合组分a)蛇葡萄素；b)碱性氨基酸；以及d)除pH调节剂以外的其它药学上可接受的载体和/或稀释剂，以形成蛇葡萄素溶液；(ii) 加入c)pH调节剂，调节溶液pH至5 9;和(iii) 对步骤(ii)所得的溶液进行去除热原和灭菌，从而获得蛇葡萄素注射液，其中以注射液的总体积为基准计，蛇葡萄素的浓度为0.01 300 mg/ml。
10. —种对肿瘤治疗具有协同作用的药盒，所述药盒中包括A) 治疗有效量的权利要求l-7中任一项所述的蛇葡萄素组合物；B) 治疗有效量的卡铂。
本发明提供了一种蛇葡萄素组合物及其制备方法，其包含a)蛇葡萄素；和b)碱性氨基酸，其中，组分a)与组分b)的重量比为1∶1～1∶10。本发明的组合物中还可进一步包括c)pH调节剂；和/或d)药学上可接受的载体和/或稀释剂。本发明还涉及包含本发明蛇葡萄素组合物和卡铂的药盒。本发明的蛇葡萄素组合物具有提高的溶解度和稳定性以及适宜的pH范围，适合临床应用。
文档编号A61P35/00GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者余剑桥, 刘达清, 吴勇杰, 李志成, 梁健仪, 范富林 申请人:兰州大学;广东泰禾医药科技有限公司