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蛋白质复性方法
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蛋白质复性方法
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蛋白质复性的蛋白复性
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包涵体复性，蛋白质折叠如果变性条件剧烈持久，蛋白质的变性是不可逆的。如果变性条件不剧烈，这种变性作用是可逆的，说明蛋白质分子内部结构的变化不大。这时，如果除去变性因素，在适当条件下变性蛋白质可恢复其天然构象和生物活性，这种现象称为蛋白质的复性（renaturation）。例如胃蛋白酶加热至80～90℃时，失去溶解性，也无消化蛋白质的能力，如将温度再降低到37℃，则又可恢复溶解性和消化蛋白质的能力。
问错地方了。这么专业的生物知识，最好去搜索文献。关于包涵体的文献太多了。基本上做蛋白的都有涉及。 不要在这问，自己多下载一些文献，比这里的回答强的多。
简单找了点。
1. 对于尿素和盐酸胍该怎么选择?
尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰...
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蛋白复性缓冲液的使用
蛋白复性缓冲液的使用
来源：互联网
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wangcaixia1：我是第一次做蛋白表达，所表达的蛋白是以包涵体形式存在的，包涵体经过洗涤、溶解后进行复性，采用不同尿素浓度（4.5、3.5、2.5、1.5、0.5、0）的复性缓冲液进行复性，我想请教的问题是这一系列不同尿素浓度的复性缓冲液可以重复使用吗？如果是不同的蛋白可以重复使用吗？丁香园网友panmo2006认为：不知道你用的是哪一种表达载体，如果是融合表达载体pGEX时候，在透析复性的时候只需要采用4M，2M的两个梯度就可以直接上亲和柱子；如果是pET载体，可以在变性条件下直接上Ni柱，然后在柱上复性.丁香园网友wangcaixia1认为：我用的是pGEX-6p-1载体，我想问的是复性缓冲液可以重复利用吗？也就是可以用过一次后，再用来复性其他蛋白吗？丁香园网友panmo2006认为：完全可以啊，但是你不要忽视了使用后的复性液里面各种成分的浓度（如尿素、氧化型还原型谷胱甘肽的等）都要发生变化，那你下次再处理该蛋白时，你的条件怎么确定呢，就是说重复性很难把握。
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DXY All Rights Reserved.为什么表达的蛋白会变性沉淀？
帮别人问的，大致上如下：蛋白是放线菌里面的一个酶，催化核苷肽类抗生素合成途径中的一步。现在放在大肠杆菌里面表达。产物提取后完全沉淀，上清完全无活性。缓冲是模拟放线菌内环境的某种缓冲液（我不太懂）。难以复性。产物大概确定是目标蛋白。那么问题是：为什么会出现这种情况？把表达载体从大肠换成放线菌，会不会有改善？
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泻药。 并不是做微生物的，只能简单的猜测一下。 放线菌跟细菌还是不一样的，放线菌中的转录翻译蛋白质折叠可能跟大肠杆菌的还是有区别的，最后导致产生的蛋白质可能并不是你所需要的蛋白质或者蛋白质不能正常的折叠导致蛋白质发生沉淀。 第一个问题你需要确认下你的蛋白质是不是正确的转录翻译，这时候你可以用一下免疫荧光，看看所需要的蛋白质是否正常的表达。注意这时候需要加好阳性对照。或者你可以抽R N A，然后看看所需的蛋白质是不是正常的转录，转录的位置是不是你需要的位置。这是转录翻译的问题。 再者你转入的基因因为是个抗生素产生过程中需要的酶，所以你可以检测下是不是有抗生素的合成。第二个问题：蛋白质是不是在细菌之内没有正常的折叠，导致蛋白质变性，然后抽提的时候就不溶解。当然最简单的方法还是查文献，查查别人以前是怎么设计的质粒，是怎么抽提的。
有可能是表达的环境不合适，如PH等，或者缺乏合适的辅因子等等导致蛋白不能正确折叠，形成了包涵体沉淀。表达量太高也会形成包涵体。翻译后缺少修饰系统导致中间体过多也会出现这种情况。问题太多了，你要一个一个排除掉
沉淀最可能的原因：1.确定你的蛋白质在不工作状态下是可溶的吗？2.蛋白空间结构不正确。3.蛋白发生二聚或者多聚。可以跑Native-PAGE，看看。出现这种情况的原因：1.基因构建，可以尝试截短或者加长构建的边界，是否需要对密码进行优化，将你拿到的基因序列优化成大肠杆菌所常用的密码子。2.载体选择。尝试更换载体。3.表达条件。诱导表达时的表达菌株，表达温度，加诱导剂时菌的OD600的值，诱导剂的浓度，诱导时间。表达时是否需要加入特殊的添加剂，如本蛋白需要的金属离子。4.蛋白质纯化过程中的各种影响因子。缓冲液(包括盐离子浓度，pH等)，温度等。5.蛋白质复性过程中，尿素的浓度，缓冲液，添加顺序，每个步骤的功效是什么，都弄清楚了吗？
我就把毕业论文里的部分内容贴出来吧，不足、错误之处敬请批评指正，欢迎交流——————————————
以下是论文综述部分内容
—————————————1.3.1.2 表达方式的选择根据蛋白表达的存在形式可将表达方式分为可溶性表达和包涵体表达，可溶性表达又包括胞内表达、周质空间表达、分泌表达，而包涵体则主要存在于大肠杆菌表达过程中。蛋白表达是否可溶是多方面因素共同作用的结果， 除蛋白自身性质外， 大致还可分为三类因素： 1、蛋白表达宿主的选择，包括不同蛋白表达系统以及同一表达系统中的不同宿主菌(细胞)。 2、表达载体的选择，主要考虑表达载体中各元件的不同特性。 3、宿主菌(细胞)的培养条件。在昆虫细胞表达系统、哺乳动物细胞表达系统、动物乳腺生物反应器以及以分泌形式表达的酵母表达系统中，目的蛋白以分泌形式表达，此种形式表达出的蛋白必然是可溶性的， 且能够在宿主细胞中得到必要的加工修饰， 理论上蛋白产物都具有生物学活性。此外，胞内表达或周质表达也能产生可溶性蛋白，其目的蛋白分离纯化前需要破碎细胞结构，在一定程度上增加了蛋白纯化的复杂程度。但以非分泌形式表达的宿主菌可经离心等简单操作收集大量菌体后重悬于少量液体中进行细胞破壁处理，相当于进行了浓缩处理，利于蛋白富集。大肠杆菌蛋白表达系统因其培养简单、繁殖迅速、成本低廉而被实验室广泛应用[10]。然而大肠杆菌表达外源蛋白的过程中一大棘手问题便是包涵体的产生，文献报道，在不考虑其他因素的情况下，当自体或外源蛋白浓度超过菌体总蛋白浓度 2%时，包涵体便可产生。 除选择合适的表达系统之外， 如何避免大肠杆菌表达系统中包涵体的产生，增加外源蛋白在大肠杆菌表达系统中的可溶性也是值得关注和研究的方向之一，而增加大肠杆菌表达系统中蛋白质可溶性的方法， 可从以下几类因素中加以考虑。A. 选择合适的宿主菌宿主菌的选择一般要结合相应的表达系统的选择，在选择了合适的表达系统后，该表达系统所使用的宿主菌的类型以及遗传背景对外源蛋白的高效表达亦至关重要。在大肠杆菌表达系统中， 为防止蛋白酶对目的蛋白的水解作用，
lon、 OmpT 蛋白酶缺失型的 BL21 工程菌及其衍生菌株是理想选择。 此外， 选择合适的宿主菌很大程度上要参考目的蛋白的理化性质和编码基因的特点。 对于含有二硫键的蛋白， 选择有助于二硫键正确形成的 AD494 (DE3)pLysS 表达目的蛋白是一个理想的选择，此菌株含有 thioredoxin reductase (TrxB)突变，利于目的蛋白二硫键形成，帮助蛋白形成正确的空间结构，形成具有生物活性的蛋白，从而促进外源蛋白的可溶性表达。 Chen 等人利用此表系统成功表达了可溶形式的山羊乳铁蛋白(Lactoferricin)[11]。同样源于 K-12 菌的 Origami (DE3)菌株含有 Thioredoxin reductase (trxB)和 glutathione reductase (gor)双基因突变，这使得该菌株能够更加高效的促进含有二硫键的蛋白正确空间结构的形成。 对于表达含稀有密码子的外源基因则可以选择 Rosetta (DE3)、 BL21 (DE3)
CodonPlus-RIL 等菌株，它们通过补充表达针对稀有密码子的 tRNAs 来避免因大肠杆菌密码子使用频率导致的真核基因的表达限制。 在此角度讲，将目的基因按照相应宿主菌的密码子进行优化也是提高外源蛋白表达效率的重要手段之一。 有研究发现，利用 Rosetta (DE3) 表达人源白介素 11 要比利用 BL21 (DE3)表达更加高效，合适的宿主菌对在大肠杆菌中的重组蛋白的表达有重要影响。B． 选择合适的表达载体表达载体通常由复制起始位点 ori、启动子、核糖体结合位点、亲和标签、蛋白酶切位点、多克隆位点、终止子、 筛选标记等基本元素组成(图 1.4)。 从控制蛋白表达的角度，从表达载体各元素入手， 可通过影响目的蛋白表达过程或改变目的蛋白理化性质以促进外源蛋白的可溶性表达。 a) 相对均衡的质粒拷贝数。 根据质粒的复制特性，可将质粒分为严紧型和松弛型两类。质粒的拷贝数与宿主菌的遗传背景、质粒复制调控系统、生长繁殖条件和状态密切相关。例如有研究[12]显示， pT181 质粒通过控制伴随转录机制介导的对 pT181 起始物 RepC 的合成率来控制质粒复制数量。 Tsao 等[13]在大肠杆菌中采用独立载体替代双顺反调控子载体表达人 FTase 两个亚基的方法，使得编码序列得到了更佳的表达环境，并且通过调节其中某个质粒平衡了两种亚基的表达，从而使得可溶性人 FTase 产量提高了 10-100 倍。由此可见，质粒的拷贝数并非越多越好，过多的拷贝数可能超过宿主菌表达能力而影响宿主菌生长，尤其在共转化的宿主菌中还要考虑不同质粒的相容性等问题。b) 启动子的选择。 目前在大肠杆菌表达系统中多采用化学试剂或温度变化来诱导外源基因表达， 然而有研究表明，使用温和型组成表达的启动子可以促进外源蛋白的可溶性表达。 Cheong 等人利用来源于土壤宏基因组中含有组成型启动子的 G196 NA 片段构建了新型表达载体并进一步优化，外源蛋白可溶表达得到提升[14, 15]。 虽然使用强启动子，如 T7 启动子，增强了蛋白表达效率，但是过强的表达效率往往使得外源蛋白来不及正确折叠， 因而常常产生包涵体，因此为得到可溶性表达，可以考虑更换启动效率较弱的弱启动子。
c) 标签蛋白的选择。 将目的蛋白融合各种标签(蛋白或多肽)以促进外源蛋白表达、提高目的蛋白可溶性、便于后续的分离纯化或获得天然 N 端蛋白是在大肠杆菌表达系统中常用方法之一[10]。 选择具有促溶功能的分子伴侣(蛋白)、折叠酶作为标签蛋白进行融合表达或共表达是提高目的蛋白可溶性的有效方法， 常用的促溶标签蛋白有谷胱甘肽 S 转移酶(glutathione S transferase, GST)、麦芽糖结合蛋白
(maltose-binding protein , MBP)、硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)、 转录终止抗终止因子(N-Utilization substance, Nus)[16]、触发因子(trigger factor, TF)、二硫键折叠异构酶 A(Disulfide bondformation protein A ,DsbA)、 增加可溶性的 SET(solubility
enhancement tag)标签、超酸性融合标签(yjgD, rpoD, msyB)、本质无序蛋白
(intrinsically disordered proteins, IDPs)、 小泛素相关修饰物(small ubiquitin related
modifier, SUMO)蛋白等。
d) 对目的基因序列进行改造或选择性表达。 对于大肠杆菌表达系统，为得到可溶性表达，可考虑在目的基因适当位置添加合适的定位信号，如定位到大肠杆菌周质的信号序列或分泌信号。对目的基因的选择性表达是指，在不影响实验目的的前提下，可以截取目的基因部分序列进行表达。例如肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体 TRAIL 在体内仅以膜结合形式存在，但在体外实验中发现，其胞外段同样具有抗肿瘤活性。在目前 TRAIL 蛋白的原核表达中，绝大多数采用的是表达胞外段[17]。 此外还可以通过基因操作替换某些氨基酸以促进可溶性表达，这可能是由于改变了蛋白的某些理化性质，如疏水性等。 Jenkins 等将 HIV-1 整合酶的 Phe185 突变为 Lys185， Cys280 突变为 Ser280 后，其核心区蛋白以可溶形式表达且不影响生物学活性。C． 控制培养条件达到促溶作用
a) 诱导剂的浓度、 添加时机和作用时间同样影响外源蛋白的可溶性。 过低的诱导剂浓度不能有效诱导外源蛋白表达，而过高的诱导剂浓度不仅增加了经济成本，更可能对菌体产生毒性，影响菌体正常生长。Ramírez 等研究显示 IPTG 在 0-1mM之间不会影响大肠杆菌的生长。降低诱导剂浓度以提高蛋白可溶性的原因，可能是较低的诱导剂浓度降低了外源蛋白的表达效率； 较高的诱导剂浓度可能使得表达效率过高而易产生包涵体。 通常，诱导剂在大肠杆菌生长对数中期添加，此时的菌体生长速度以及蛋白合成速度达到最大。但有研究[18]指出，在早期静止期添加诱导剂在某些时候可以增加蛋白可溶性，这可能与菌体密度有关[19]。
b) 温度同时影响菌体生长和外源蛋白表达。 为更加高效表达外源蛋白，通常将表达过程分为两个部分。首先在适宜的(相对较高)温度下培养菌体以得到足够的生物量，此后添加适量诱导剂在某一合适温度(通常低于菌体最适生长温度)进行诱导表达。 降低温度有助于重组蛋白形成正确的空间构象，增加其可溶性；较高的温度虽然适于菌体生长，但却有可能造成质粒的丢失或蛋白质的错误表达。
c) 在培养体系中加入某些辅因子可促进蛋白可溶性表达。 Vincentelli 等[20]指出，不论对于真核蛋白还是原核蛋白，培养基成分并不是决定蛋白是否可溶的因素。某些辅因子的添加可通过影响菌体的生理生化状态进而促进外源蛋白的正确折叠。如添加较高浓度的甘露醇或蔗糖能够抑制分泌到周质空间中的蛋白聚集[21]。这些因素导致的渗透压的增加使得诸如甘氨酸、甜菜碱、海藻糖等细胞内渗透压调节剂积累，从而稳定了蛋白质的天然构象[21]。 乙醇的添加可以起大肠杆菌热休克蛋白的表达从而促进蛋白可溶；低分子量硫醇和硫化物的添加则可能通过改变周质空间中的氧化还原环境影响蛋白质二硫键的形成[22]。 此外调整培养基 pH 也可能因影响蛋白质等电点、菌体生长状态等因素促进蛋白可溶性表达。不超过半数的细菌蛋白以及小于 15%的非细菌蛋白在大肠杆菌表达系统中能以可溶形式表达[23]，蛋白表达，尤其是大肠杆菌表达系统中的可溶性表达，永远都是一个“试错”的过程，不可能有一个万能的、一劳永逸的方案。可以参考的只有一些原则和努力的方向，至于细节，因目的蛋白的不同、具体表达环境的不同而不同。包涵体的形成是原核表达系统表达外源蛋白过程中存在的主要障碍之一，虽然基于蛋白表达纯化的实践经验总结出了很多策略方法，但包涵体形成的确切原因仍然是未知的。 虽然在应用大肠杆菌表达系统时都通常尽力避免包涵体的产生，但伴随着对包涵体的研究，人们逐渐发现包涵体表达也并非一无是处。包涵体作为原核细胞菌体内非正常蛋白折叠的反应，参与蛋白聚集通路的控制，并有可能开发成天然的固定化酶或纳米材料[24]。表达菌中的包涵体所含蛋白能够达到外源蛋白的 80-95% [24]，这无疑相当于变相浓缩了目的蛋白。对于对蛋白活性无要求的研究或应用， 如蛋白 Marker 的生产、抗原的生产等， 包涵体表达无疑是个不错的选择，其瓶颈则转化为如何有效去除包涵体中的杂质。
一般大肠杆菌中的沉淀是形成了包涵体1.表达量过高，表达量越高越容易形成包涵体原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。2重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，真核糖蛋白无法糖基化使中问体溶解度下降，导致不溶解包涵体形成 。3.重组蛋白分泌序列的存在阻碍折叠，导致错误折叠分子的产生。4.重组蛋白的氨基酸组成，一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。5.包涵体形成动力学研究表明，包涵体是由部分变性的中阃体聚合而成。因此，任何影响中间体稳定的因素，如pH值(pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体)离子强度和温度都可以引起蛋白聚。一般形成包涵体都要进行包涵体复性不然没有活性，我之前看到的
重组蛋白形成包涵体的可能原因很多。首先，先确定一下，表达出来的蛋白，是目的蛋白么？SDS-PAGE先在蛋白大小上检测一下吧，分子量正确，再想解决方案。
大肠杆菌虽然表达高效，但毕竟是原核生物，没有蛋白后续的修饰功能，所有产生沉淀很正常。尝试改变表达温度，降低诱导剂浓度等条件试试吧
改表达温度，时间，感受态，载体，都不行的话，截短，再不行，少年，它性质不好，折叠不正确，没办法了，找个同源蛋白做吧
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包涵体复性常见问题分析
包涵体复性原则低浓度，平缓梯度，低温。 4
D;怎样洗涤包涵体？通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用 6M 盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到 4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脱效果好。对于尿素和盐酸胍该怎么选择尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素 8-10M，盐酸胍 6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为 70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。盐酸胍溶解能力达 95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。8M 尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?在 4 度放置半个月，都没什么问题
。在室温放置超过 48 小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，所以早些处理 BI 溶液比较好。复性时的蛋白浓度是？一般使用浓度为 0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。蛋白复性后浓度低蛋白可能是在复性的过程中发生降解了。可以将复性好的蛋白浓缩一下跑胶看看。复性过程一般都是低浓度蛋白，需要保证分子间有足够的折叠空间。一些未正确折叠的蛋白就存在于沉淀中，可能沉淀看不出来，复性后的蛋白高速离心看看。复性中蛋白析出是怎么回事？该怎么处理？出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和 PH 值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔 1 个 PH 或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。若加变性剂尿素可加到 2M，盐酸胍可加到 1-1.5M；另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样品中也可加适量甘油。复性效果的检测根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。1，凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。2，光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。3，色谱方法：如 IEX、RP-HPLC、CE 等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同，4，生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。5，黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。6，免疫学方法：如 ELISA、WESTERN 等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。变性的融合蛋白可以制备多抗或者单抗吗？变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。纯化后的可溶性融合蛋白可以直接用于制备多抗吗？免疫动物要求抗原体种尽量小。在这种小体积的情况下，缓冲液里的小分子成分只要没毒影响就不大，可以不用考虑。
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