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即送15丁当
【求助】western曝光后蛋白处是空的
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这个帖子发布于5年零117天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
这两天做了western，结果奇怪，曝光显影后发现有的条带清楚，有的在本该有蛋白的地方不显影，周围却是黑的，好像空出来一样，蛋白上样时我都是调成相同浓度的，请问各位这是什么原因呢?
不知道邀请谁？试试他们
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照片传上来看看，估计是转印的问题。
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maxwell25169 照片传上来看看，估计是转印的问题。蛋白都是同时转的，在同一张膜上呢，有的好，有的就是空的
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没有数码相机，只能用手机拍了。。。不是很清楚。。。前面三个条带还算正常，后面4个在蛋白部位是空白的，周围是黑的。。。
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怎么没有人回答呀？
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有跑beta-actin 什么的吗?
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tk57ml 有跑beta-actin 什么的吗?跑了，内参是GAPDH，还是蛮好的
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所有的材料和工具都是正规途径买的吧? 转膜的膜, 抗体, 啥的.再跑一次看看吧. 也许是偶然事件.
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同意楼上。再重复一次，可能的话加跑一个阳性对照看看。
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上样量多少？估计不是上样量太高，就是抗体效价太高，试试降低点2者。空心是信号太强，把ECL耗尽的结果。
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关于丁香园关于Western中提取蛋白和曝光压片的问题！ - 实验交流 - 生物秀
标题: 关于Western中提取蛋白和曝光压片的问题！
摘要: [关于Western中提取蛋白和曝光压片的问题！] 各位战友，大家帮帮我吧，马上要毕业了，Western这部分还没着落，这年都不回家过了，本实验室没有人做过Western，也没老师指点，跑了几次电泳，发现一些问题，请战友帮帮忙！1 我是从细胞中提取的蛋白，蛋白提好后冻于-20冰箱，拿出来解冻后发现有很多絮状沉淀，我保证提取蛋白的时候经过高速离心了，吸的也是上清，为什么会有沉淀呢？当初能被裂解液溶解，应该都是可溶蛋白吧！后来测了蛋白浓度，浓度很低，不 关键词:[条带 暗室 考马斯亮蓝 絮状沉淀 跑胶 高速离心 裂解液]……
各位朋友，大家帮帮我吧，马上要毕业了，Western这部分还没着落，这年都不回家过了，本实验室没有人做过Western，也没老师指点，跑了几次电泳，发现一些问题，请朋友帮帮忙！1.我是从细胞中提取的蛋白，蛋白提好后冻于-20冰箱，拿出来解冻后发现有很多絮状沉淀，我保证提取蛋白的时候经过高速离心了，吸的也是上清，为什么会有沉淀呢？当初能被裂解液溶解，应该都是可溶蛋白吧！后来测了蛋白浓度，浓度很低，不知道是不是与絮状沉淀有关？提取蛋白以后最好是先定量、变性还是冻起来也无所谓呢？2.蛋白浓度很低，上样量是6微克蛋白，跑胶完后做了考马斯亮蓝染色，条带都可见，转膜后经丽春红染色条带就只是隐约可见了，做完封闭、孵育、显色，暗室里看不到条带。ECL的灵敏度不是比考马斯亮蓝染色的灵敏度高很多吗？一抗浓度也比较高1：500。3.压片后曝光出一次有条带的膜，当时底色很亮，应该是抗体浓度过高了，可同样的膜我曝第二次的时候却什么都没出来，胶片是蓝绿色的，从那以后都没曝出过片子，是我的胶片出问题了吗？蓝绿色透明的。暗室里我用的红光灯，是不是红光灯过亮的话也会让胶片曝光？先谢谢大家了！！！
1.絮状沉淀不是蛋白,造成.8絮状沉淀的原因是裂解液的成分导致的,有可能裂解液中含有SDS,冻融后温度低出现沉淀,这个对测定蛋白浓度没有影响,只要用移液枪将蛋白液吹打均匀再测浓度即可.至于蛋白浓度低你可以匀浆时少放些裂解掖2.考马斯亮蓝染色,丽春红染色没有任何特异性,所有蛋白都被染出,你所看到的条带可能根本不是你想要的.3.底色很亮有可能是一抗或二抗浓度高了,,如果存在目的条带的话,要减少暴光时间.
太谢谢actin2008了！我知道考马斯亮蓝和丽春红是没有特异性的，但考马斯亮蓝的检出极限是0.3~1微克/蛋白条带，所以我幻想可能经抗体结合后，应该不至于一点光都看不到吧？我还想问一下，红光灯过亮会不会让胶片曝光呢？我的胶片拿出来是什么颜色，显影定影后还是什么颜色。胶片曝光后颜色会变吧？
太强的红光会不会让胶片曝光这个问题我也不是很清楚。尽管这些问题我都不是十分清楚，但是看到都快过年了，还有人这么辛苦做试验，我就谈谈我自己的感受，有多少说多少，希望你也能赶紧回家了，呵呵。我是今天才开始正式放假的，哈哈。我用的是普通的台灯，不可调强弱的，还是我以前在安大的时候买的10块钱的。在暗室里感觉也还是很强的。看到有人说可能会曝光，所以我还是很小心的。如果说你担心是你的胶片的问题，我觉得你可以牺牲一点点你的二抗了，取少量稀释的二抗混合ECL，曝光看看。另外就是说，如果你的目的条带的亮度高于背景色的话，我觉得一样可以照出来片子的。因为光会逐渐淡下去，背景很亮只是一时的。我做过的片子有的当时就觉得北京很深，但是压了几次片子之后，光逐渐淡了，洗出来的片子也就只有我的条带了。不过前提是你的条带比较亮。另外你说到有一次是有条带的膜，但是我不是很理解。因为背景高了的话，有可能有很多条带，还是说特异的条带呢？如果说你的东西很淡的话，甚至看不到条带，也有人说过可以压片过夜的，我也用过。因为我们实验室没有暗室，我只能等24小时到夜里，呵呵，效果也不错。有什么问题可以给我发消息，闲在家里没事干，呵呵。祝你好运。
红光灯过亮会不会让胶片曝光呢？我的胶片拿出来是什么颜色，显影定影后还是什么颜色。胶片曝光后颜色会变吧?一般情况来讲,红光不会让胶片暴光,但是,要小心,胶片是特别敏感的,如果门缝过大,透进自然光太多,也会导致洗完后胶片发污,所以在暴光的过程中动作要快,在取胶片或剪裁胶片时要尽量背对灯光.胶片拿出来是什么颜色，显影定影后还是什么颜色造成这种现象的原因是显影液或定影液失效了,该更换了一般如果有条带的话,经过显影后可以出现黑带,在放入定影液后摇晃几下胶片立刻就透明了.
感谢tanzhen613，感谢你如此同情我，呵呵，还告诉我你宝贵的经验坦白的说，我不知道那次的条带是不是我的目的条带。因为我是想试一试我的一抗有没有问题，所以三个蛋白（包括内参）的一抗都高浓度加进去了。看到的条带只能大致和marker比较，范围正确。不知道如何鉴别这是不是非特异性条带呢？当我想要做个梯度，摸一下一抗的浓度时，转膜后的PVDF膜丽春红染色看不到条带了。蛋白浓度太低，因为我的蛋白是原代培养的细胞，所以目前正在重提蛋白。现在困扰我的问题还有一个，哪位朋友做过与骨代谢相关的RANKL蛋白？抗体说明书上说RANKL有两种，一种可溶的，一种跨膜的，不知道我应该检测的是哪种？还是两个都应该比较？文献中都不写蛋白大小，应该是太基本了……我也查了些学位论文，那更是五花八门，请朋友赐教！！！或者我还可以通过什么途径获取信息呢？
actin2008朋友，您说我的显影液或者定影液失效了？我只显出一次影就失效了啊……会不会是因为我显影定影的容器没有盖盖子？或者是不能放在塑料盒子里？应该不会这么娇贵吧，我看里大家说好像可以用蛮久的嘛？
胶片放进去什么样,出来还是什么样,基本就是就是显,定影液不灵导致的如果胶片暴光了,洗出来就是大黑板一张至于显影液或者定影液失效,肯定不是塑料盒子的原因,也应该不是盖子的原因,是不是你配置的有问题,或者别的什么原因这个我就不得而知了,但是我个人认为问题应该出在显影或定影液上,定影液有问题的可能性更大
你的抗体是自己做的吧？哈哈，估计跟我一样。我用别人买的一抗都特别舍不得。。。用自己制的兔抗挺舍得的。。高浓度加入肯定会有背景色的。我自己做两种抗体，开始摸稀释倍数的时候都是同时做好几个条带，分别做好之后再把两种抗体加一起看看效果如何。另外看你在说显影液的问题，显影液应该避光保存。我看显影液放在外面就变黑了。显影液也不值钱，我们用的是一块钱一包的，还可以用好几次呢。实在不行就换一个呗。你做的蛋白好歹知道分子量。我做的蛋白连分子量都不知道，只知道大概。。。结果第一批做的全是30kd左右，第二批做出来都是40kd，郁闷啊，呵呵。前阵子跑sds-page都跑不好了，索性就决定放假了。
显影液定影液我都避光保存了，但有可能天气太冷析出了？这个我没查看。下次重新配了再看看，又或者50度重新溶解不知可否？抗体我是买的……我没办法，说明书上推荐的比这个浓度还高，无知无畏……多克隆抗体的浓度大家多用什么范围？另外TBST漂洗抗体的时候我总怕洗不净，摇床晃的挺快的，哎Western细节太多，又是新手，完全没指导，所以出了问题不知道怎样分析，我关注的问题可能大家都觉得太基本，完全没必要考虑。还请朋友们耐心解答，我会继续努力的！感谢及时反馈信息使讨论得以深入，加分鼓励，欢迎继续讨论！
抗体的稀释倍数不是一个固定的数。不过好像同一家公司的多半都差不多。我看你用的好像比较浪费，所以以为你是自己制备的多抗。我们有个老师买的是国外的一家公司的抗体，2000块钱就50ul。只能用10次而已。TBST洗涤的时候速度不用特别快，当然快了对试验有无影响我不是很清楚。大概的转速应该在摇床来说，大概就是80转每分钟，因为我们的摇床曾经坏了一次，我用摇细菌的那个摇床摇了，转速显示大概是80转。显影液定影液我们用的没有析出的感觉，怕效果不好就不如重新配置。另外孵育一抗二抗我都是一个小时，开空调开的温度挺高的。25度以上。孵育的速度也无需太快。我觉得要是看不到条带的话，可以加一个点样孔，上样多一点，希望可以通过增加量来使条带可见吧。每天都做这个试验实在是很枯燥，呵呵。祝新年愉快。
感觉是你loading的太少了。染膜看不到就不大正常，反正要不是你loading少了，要不是你转膜不成功。反正建议你下次loading多点，染膜后看看效果，不行的话重新跑胶，就不要浪费抗体了。证明抗体的特异性有多种方法，常规方法是构建该蛋白的载体（比如GFP etc）在细胞中过表达，或者RNAi，和control对比下就知道那个是你的目的蛋白了。当然如果你有条件来generate KO mice 也可以，不过国内一般没这个条件。新抗体一般都要做梯度实验的，工作浓度没有统一标准，能work就行了。你洗胶片应该没问题，其实你大可以自己做个实验证明下：剪刀剪一小块下来，直接打开灯或者门看看，这样曝光应该是黑的。
蛋白提取后尽量-80度保存，甚至液氮。提取过程中的絮状物可能是DNA级蛋白的结合中，采用最小号的注射器抽打后好些，转印的时间可以考虑长些，一抗的浓度提高点，二抗浓度减低些，红光不要开的太亮、时间不要太长，胶片不回曝光。压片显影的过程动作要熟练，曝光不要过度，显影要恰合适。
蛋白提取后最好先变性后保存
1.蛋白提取出来之后最好冻存于-80度冰箱，并且1个月内用完；也可加loading buffer煮过之后冻存于-20度，都不要超过一个月2。加大上样量，转膜条件可能不行。110V转2个小时试一试，转膜完毕后的转膜液温度应在45度左右。暗室里看不到条带的话压片半小时以上。3.胶片蓝绿色透明的话是定影液的问题，换新的就好了。
1 胶片问题：未曝光胶片：蓝色透明。 完全曝光胶片：黑色。 建议：剪一小条胶片（黑暗条件下），余下封好（千万千万），开照明灯（不是红光灯）5分钟，然后按常规显定影，如为全黑，说明你的显影、定影过程无问题。否则，更换显、定影液或反思整个操作过程有无问题。你的底片为蓝绿色，如果描述准确的话，可能是定影不充分，你可以延长一下显定影时间，首先不求效果很好，先有个结果以后后再慢慢改进吧。 完成上述过程，确定显定影液无问题后，另剪一条胶片（黑暗条件下），直接进行显定影，如为蓝色透明，说明你的胶片无问题。如为黑色或灰色，说明胶片已经不同程度的曝光，建议更换胶片。2 不知道你想检测什么蛋白，在细胞中的丰度如何？从你说的情况，上样量似乎太少。我们一般用50-60微克，丰度高的蛋白也上30微克。3 你可以先试着做下actin，这个应该很好做。如果能出条带，说明你的整个体系问题不大，增加上样量试试。如没有条带，说明你的整个体系有问题，参考楼上的意见改进吧。
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电话：021-& 【求助】WESTERN图象的显影和定影问题
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【求助】WESTERN图象的显影和定影问题
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【求助】WESTERN图象的显影和定影问题
向高人请教——western blotting发光液孵育后有强荧光，在无光源条件下于暗室内可以清楚地看到膜上的条带，但X光片上却没有任何图象。
我们使用的是CELL SIGNALING的发光液。工作液与膜接触后立即发出荧光，条带非常清晰，离工作台稍远也能看得很清楚，但荧光持续时间不长，约5分钟就开始出现肉眼可以察觉地衰减，约20分钟即已淬灭。我们一共压了两张片。第一张曝光约5分钟，显影2~3分钟后定影，看不到任何条带。压第二张片时因为荧光已经开始衰减，延长曝光时间至10分钟左右，显影定影时间与第一次相同，但X光片上仍然没有任何影象。我们对此百思不得其解。向各位前辈专家求助，请大家帮我们找找原因，到底是压片压得不好还是显影定影有问题？（P.S.：我们定影后的X光片都是透明的，这应该是合格的吧？不至于曝光不足吧？）
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肉眼都能看到荧光,压片应该条带很强的了,是X光片有问题吗?你用的X光片有人用过确定是能用的吗?我们实验室用的柯达的感光片.就是照相馆用的那种
要不就是显影液的问题了,只能一个一个排除,祝你好运了
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回复 #2 bs4665 的帖子
这么快就有同道回复，真是感动啊……
我们的X光片以前有用过，压得出图象（那次我也在场，看了）。我们前一次实验也用过，虽然当时做得不是很成功，只有些非特异性条带，但也压出来了。所以这次才会觉得头大，不明白为什么会一无所见。
不过也想请问前辈，能不能分享一下压片以及显影定影方面的心得，我们以后也好加以改进。先谢谢你！
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如果在暗室肉眼都能直接看到荧光的话，那么问题很可能出在你配制的显影液和定影液上了！
当然，还要排除X片曝光的可能。
不知道你们显影的时候是否有荧光标签？这个可以作为阳性对照（相当于质控）！
这个标签很便宜，但是对于你的显影系统是否正常很有必要，可以检测显影体系是否出现问题。
是一种非同位素的自发荧光标签，可粘贴在X-线曝光暗盒内、蛋白或核酸杂交印迹膜上或包被膜的塑料保鲜膜上；曝光显影在X光胶片精确显示一条5厘米长的标尺和文字，帮助指示X-光胶片上的蛋白条带位置、大小，以及指示显影液是否失效。也可用作荧光成像系统的荧光标志或放射科X-线胶片曝光标志。是Western Blot排忧解难的得力助手，并至少可以使用10年以上。
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请问这种标签你们有没用过？价格便宜到什么程度？（非常抱歉，你提供的那个链接我无法打开，图片我这里也不知为何看不到，所以没办法自己去看上面的内容。能不能把网页的内容贴在这里？另外就是，在下只是个研究生，钱自然用的老板的经费，不免有所顾虑。请原谅我唐突的问题
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原帖由 jujuba 于
17:47 发表
请问这种标签你们有没用过？价格便宜到什么程度？（非常抱歉，你提供的那个链接我无法打开，图片我这里也不知为何看不到，所以没办法自己去看上面的内容。能不能把网页的内容贴在这里？另外就是，在下只是个研究生，钱自然用的老板的经 ...
呵呵，记得买成75元。
我用了快一年了，荧光强度一直很好，在白天激发5分钟后即可使用，曝光30秒X片上就非常清晰了
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这个……大人请告诉我在哪里有得卖（无法可想了，连广告词也用上）。因为我们实验室是公共实验室，什么专业的人都有，因此并非以WESTERN这类实验为主，公司自然不会很勤快地送目录过来给我们……还望赐教，多谢多谢！
P.S.：劳烦大人把这种产品的完整名称告诉我一下。正如刚才说的，我既开不了网页也看不见图片（你贴的几幅图上好象只有公司的LOGO，不知我有没看错），连产品名称都不知道实在难以购买。再次感谢！
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我以前也出现过你同样的问题，肉眼可以看到条带，但是压片什么都没有，而且片子看起来是透明的，没有曝过光的样子。你最好是检查一下你的显影液的使用期，一般来说，不超过6个月（工作液），还要比较低的温度。我们实验室配一批一般使用不超过1个月，如果显影液呈现深红色，则肯定不能用了，立即抛弃。
还有一个可能就是你配显影液的时候出现问题，过于稀释，一般来说浓缩液显影可以在2-3s之内让胶片变黑，我们一般就把这样的显影液按照1：3的比例稀释，然后就能很好的控制显影过程，一般肉眼可看到条带的情况压片10s-30s即可，拿出来显影液中漂洗，一般在红灯下看，最多1min就可以看到条带了。但是，如果你继续稀释显影液，就会需要将胶片泡在显影液中更长的时间，如果你的显影液失效了，你泡半小时也没有用，只会让胶片变得比较黑（仍然透明）。
检查你的显影液，增加显影时间应该能解决你的问题。祝好运！希望及时回馈实验结果。
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先谢谢你。
我们这次的情况比较特殊，因为原来的显影液和定影液过期了（之前的实验用感觉还是很好的），订的新的还没到（我们钱不多，买的是国产货，要自己按说明书配的），就问实验室的朋友借了。据她说还是能用的，前几天就压过片，效果良好，不知道为什么过了2、3天而已就似乎失效了。想请教大人：
1、假如将配好的显影液和定影液放在棕色不透明的瓶子里，室温下保存（好象没有刻意放在柜子里避光），会不会失效得快些？你说的比较低的温度大概是多少，能不能说个具体数字？
2、我们这次显影，X光片放在显影液里面2、3分钟都没看到上面有痕迹（在调到最暗的红灯下看。应该没问题吧？但这个时候片子不是透明的，感觉有点像那些没使用过就被放到强光下而曝光的片子。），把片子放进定影液里，立刻就变成均一蓝色透明的（不发黑，整张片最后看起来就完全是一张蓝色的透明塑料片的样子）。这样的情况能不能判断为显影液或者定影液有问题？
3、按照大人介绍的做法，是不是新的显影液配好以后应该拿X光片来试一试，看看要不要稀释？
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1 用放射自显影标签是个很好的办法，那个链接是对的，3-5天会到货的
2 过2、3天不会过期的，我的就用了几个月，春节前用到春节后，前后好像有3月余
3 我是室温棕色瓶中放置的
4 根据你的描述，可能是显影液有问题，定影液是好的
5 显影液配置按说明配置，没有特别的
6 你的膜用保鲜膜包起来的，是吧？
7 我的显影液是从大的摄影器材店里买个，两包8元钱，配了1000ml，用了3月余小木虫 --- 500万硕博科研人员喜爱的学术科研平台
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【求助/交流】western blot 显影后发现条带中空，求解答。
昨天做western blot ，显影后发现个奇怪的现象。
我的目的蛋白条带不错，但是内参条带却出现中空的状态。而且是刚刚显影十分钟后才出现的，之前的时间条带都好。求高手解答。多谢多谢。
哦，原来是这样。。。多谢多谢~~~
“大量的一抗二抗，发光液消耗得快，很快把发光第底物消耗干净，”
发光液被消耗怎么理解呢？
发光液是酶促反应的底物
哦，谢谢啊
再补充询问一下，我的一抗浓度以及蛋白浓度和以前用的都相同，而且同时做的两张膜，一张就好好的，一张内侧的条带中空，除了一抗浓度还可能是什么问题呢？
影响因素太多，你知道怎么去解决就好。
把膜多洗几次再曝光就好了。
能低温的话尽量低温。
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Western-Blot显影常见现象、原因及解决方案
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