二叔丁基过氧化物物酶活性为多少算正常

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2011-10-15 01:31 标签： 二叔丁基过氧化物
抗坏血酸过氧化物酶活性计算方法
抗坏血酸过氧化物酶活性计算方法
09-12-15 &匿名提问
一、抗坏血酸含量测定 【原理】 还原型抗坏血酸(AsA)可以把铁离子还原成亚铁离子，亚铁离子与红菲咯啉(4，7－二苯基－1，10－菲咯啉，BP)反应形成红色螯合物。在534nM波长的吸收值与AsA含量正相关，故可用比色法测定。脱氧抗坏血酸(DAsA)可由二硫苏糖醇(DTT)还原成AsA。测定AsA总量，从中减去还原型AsA，即为DAsA含量。 【仪器与用具】 离心机；分光光度计；研钵；试管。 【试剂】 5％三氯乙酸(TCA)； 20％TCA； 无水乙醇溶液； 0?4％磷酸—乙醇溶液； 0?5％BP—乙醇溶液； 0?03％FeCl3—乙醇溶液； 0?6g／L DTT； NA2HPO4—NAOH溶液：以0?2Mol／L NA2HPO4和1?2Mol／L NAOH等量混合； 60MMol／L DTT—乙醇。 【方法】 1.制作标准曲线配制浓度为2mg/L，4mg/L，6mg/L，8mg/L，10mg/L，12mg/L，14Mg／L的AsA系列标准液。取各浓度标准液1?0Ml于试管中，加入1?0Ml 5％TCA、1.0ml乙醇摇匀,再依次加入0?5Ml 0?4%H3PO4—乙醇、1?0Ml 0?5％BP—乙醇、0?5Ml 0?03%FeCl3—乙醇，总体积5?0Ml。将溶液置于30℃下反应90Min，然后测定A534。以AsA浓度为横坐标，以A534为纵坐标绘制标准曲线，求出线性方程。 2.提取取植物叶片1?0g，按1∶5(W／V)加入5%TCA研磨，4000r／Min离心10Min，上清液供测定。 3.测定 (1)AsA测定取1.0Ml样品提取液于试管中，按上述相同的方法进行测定，并根据标准曲线计算AsA含量。 (2)DAsA测定向1.0Ml样品液中加入0?5Ml 60MMol／L DTT—乙醇溶液，用NA2HPO4—NAOH混合液，将溶液PH调至7～8,置于室温下10Min，使DAsA还原。然后加入0?5Ml 20％TCA，把PH调至1～2。按AsA相同方法进行测定，计算出总AsA含量，从中减去AsA,即得DAsA含量。 二、抗坏血酸过氧化物酶(AsA－POD)活性 【原理】 AsA－POD催化AsA与H2O2反应，使AsA氧化成单脱氢抗坏血酸(MDAsA)。随着AsA被氧化，溶液中290nM波长下的消光值(A290)下降，根据单位时间内A290减少值，计算AsA－POD活性。AsA氧化量按消光系数2?8(MMol／L)／CM计算，酶活性可用每克鲜重每小时氧化AsA的微摩尔数μMol／g·H表示。 【仪器】 离心机；紫外分光光度计；研钵；试管。 【试剂】 50MMol／L K2PO4—KH2PO4缓冲液(PH7?0，内含0?1MMol／L EDTA－NA2)? 0?3MMol／L AsA； 20μMol／L AsA； 0?06MMol／L H2O2。 【方法】 1?酶液制备取1?0g植物叶片剪碎，按1∶3(W／V)加入预冷的50MMol／L K2HPO4—KH2PO4缓冲液进行研磨提取，用两层纱布过滤，滤液在4000r／Min下离心10Min，上清液作酶粗提液供测定。 2.酶活性测定3Ml反应混合液中含50MMol／L K2HPO4—KH2PO4缓冲液(PH7?0)，0.1MMol／L EDTA－NA2，0.3MMol／L AsA，0?06MMol／L H2O2和0.1Ml酶液。加入H2O2后立即在20℃下测定10～30s内的A290变化，计算单位时间内AsA减少量及酶活性。回答者：楠涛 - 高级魔法师 七级 5-22 13:12提问者对于答案的评价：虽然没有帮到我解答,但还是很感谢你的回答,
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不同的测定方法有不同的计算公式。
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过氧化物酶活性的测定
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ylIR99UH95
因为这个反应速度很快啊,傻孩子.三分钟就反应完了嘻嘻哈哈
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实验十、过氧化物酶活性测定
【实验目的】
掌握测定过氧化物酶活性常用的比色法及其原理
【实验原理】
过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，本实验以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚，此产物在470nm处有最大光吸收，因此可通过测量OD470，以每分钟OD变化值表示酶活性大小。
【实验试剂】
反应混合液：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0) 50ml于烧杯中，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19μl，混合均匀，保存于冰箱中。
【实验步骤】
l． 粗酶液的制备：取马铃薯块茎洗净去皮，称取2g，切碎置入研钵中，加20mmol/L KH2PO4 10ml研成匀浆转入离心管中，4000r/min离心10min，取上清液转入试管保存于冷处，残渣再用10mL KH2PO4提取1次，合并上清液并记录总体积（提取酶液的总体积），低温下保存备用。
2．酶活性测定：取4只试管编号，1号管加入反应混合液3ml+ KH2PO4 1ml作为参比；2号管、3号管、4号管均加入反应混合液6ml+提取的酶液2ml，立即测定2、3、4号管OD470值，然后将2号管放入4℃冰箱，3号管放于室温，4号管沸水浴，10min后再分别读数。
3．结果计算：
以每分钟内OD470变化0.0l为1个过氧化物酶活性单位(U)，分别计算2、3、4号管过氧化物酶的活性。 ?D?V[u/(g?min)] 式中， 过氧化物酶活性＝W?V?0.01?ts
△D470——反应时间内吸光度的变化；
W——马铃薯鲜重（g）；
t——反应时间（min）；
VT——提取酶液总体积（mL）；
VS——测定时取用酶液体积（mL）。
【注意事项】
酶液要低温保存。
【思考题】
酶活性的影响因素有哪些？分析温度对酶活性的影响？
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植物过氧化物酶活性测定方法优化
以水曲柳、小黑杨、白菜和马铃薯为材料比较了测定方法、测定时间、pH值及H2O2浓度对过氧化物酶活性测定的影响.结果表明:过氧化物酶活性测定的最佳时间为0～60 S;H2O2浓度为0.5%～2%;磷酸缓冲液pH值为5.7～7.0;联苯胺法比愈创木酚法更为灵敏.该研究结果为用同一提取液测定多项生理指标提供依据,对植物生理实验教学及相关科学研究有较大的参考价值.
WANG Wei-ling
WANG Jing-ying
作者单位：
东北林业大学,黑龙江,哈尔滨,150040
年，卷(期)：
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在线出版日期：
基金项目：
黑龙江省科技攻关项目，黑龙江省农垦总局资助项目
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