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2015年 六校高三联合考试(第19题)
（10分）在梨、香蕉等水果中存在乙酸正丁酯，某化学学习小组欲以乙酸和正丁醇为原料合成乙酸正丁酯。Ⅰ．产品的粗制：在干燥的 圆底烧瓶中装入 （ ）正丁醇， （ ）冰醋酸，再加入 滴浓硫酸，摇匀，然后放入 颗沸石。按下图所示安装带分水器的回流反应装置，并在分水器中预先加入水，使水面略低于分水器的支管口，将圆底烧瓶放在石棉网上用小火加热。在反应过程中，通过分水器下部的旋塞分离出生成的水，注意保持分水器中水层液面原来的高度，使油层尽量回到圆底烧瓶中。反应达到终点后，停止加热。 Ⅱ．产品的精制：把分水器中的油层和圆底烧瓶中的反应液一起倒入分液偏斗中。在分液偏斗中加入 水洗涤，分去水层。油层用 的碳酸钠溶液洗涤至中性，再用 水洗涤，最后将有机层转移到锥形瓶中，再用无水硫酸镁干燥。将干燥后的乙酸正丁酯滤入 烧瓶中，进行常压蒸馏，收集 的馏分，得到 精制产品。请回答下列问题：（1）冷水应从冷凝管的_________（填“ ”或“ ”）管口通入。（2）判断反应到达终点的依据是________________。（3）本实验操作中提高产品产率的方法是_______________。（4）产品的精制过程中，第一次水洗的目的是___________，第二次水洗的目的是_________，洗涤完成后将有机层从分液偏斗的_________（填“上口”或“下口”）转移到锥形瓶中。（5）该实验中，乙酸正丁酯的产率是_________。
【正确答案】
（1） （1分）（2）分水器中的水层液面高度不再增加（1分）（3）使用分水器分离酯化反应生成的水，使平衡正向移动（2分）（4）除去乙酸及正丁醇（1分）&&除去溶于酯中的少量无机盐（1分）&&上口（1分）（5） （3分）
【命题立意】
本题主要考查乙酸正丁酯的实验室制备，意在考查考生的实验操作和探究能力。
【解题思路】（1）冷凝管从下管口进水，上管口出水，这样能提高冷凝效果。（2）乙酸和正丁醇发生酯化反应生成乙酸正丁酯和水，分水器中的水层液面高度会上升（此时通过旋塞来分离出生成的水），当分离器中的水层液面高度保持不变时，表明该酯化反应已经完成。（3）对于可逆反应，根据化学平衡移动原理，分离出生成物，平衡正向移动，能提高产品的产率。（4）由于酯化反应可逆，产品中有少量的乙酸和正丁醇，第一次水洗的目的是除去乙酸及正丁醇，第二次水洗的目的是除去溶于酯中的少量无机盐。酯的密度小于水，在水的上层，应从分液漏斗的上口倒出乙酸正丁酯。（5）理论上可生成乙酸正丁酯 ，质量为 ，则产率为 。(
17:27:12 )
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中药制剂分析（赵碧清）：第六章 中药制剂中各种化学成分分析
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1第六章 中药制剂中各类化学成分分析赵碧清2NOOO C H 3O C H 3+Cl-盐酸小檗碱（苄基异喹啉衍生物）麻黄碱（有机胺类）CHOH HCH 3C N H C H 33三妙丸中黄柏及小檗碱的鉴别组成,苍术 黄柏 牛膝鉴别,取三妙丸粉末 0.1g，加 乙醚 10mL,超声 15分钟，滤过，弃去 乙醚液。残渣加 甲醇 5mL,超声 15分钟，滤过,滤液 浓缩至 1mL，作为供试品溶液。黄柏对照药材盐酸小檗碱 0.5mg/mL硅胶 G板 苯 -醋酸乙酯 -甲醇 -异丙醇 -浓氨试液（ 12,6：3,3,1）,氨蒸气 预饱和紫外光灯 （ 365nm）检视，黄色荧光斑点小檗碱具季铵结构，不溶于乙醚，可溶于甲醇、乙醇4急支糖浆中麻黄碱的鉴别组成 鱼腥草、金荞麦、四季青、麻黄、紫菀、前胡、枳壳、甘草鉴别 取样 10mL，用 20mL水稀释，用 浓氨试液 调节 pH10～ 12，用 乙醚 提取 2次，每次 15mL,水浴挥干乙醚，残渣加甲醇溶解。盐酸麻黄碱 1mg/mL硅胶 G板，氯仿 -甲醇 -浓氨试液（ 40,10,1）,茚三酮 试液为显色剂,105℃ 加热至显色清晰麻黄碱为有机胺类，碱性较强，用浓氨试液调节可使其游离，转溶于乙醚。麻黄碱有 α -羟胺结构，可与茚三酮试剂反应。5第一节 含生物碱类成分的分析一、结构特征大多有 C,H,O,N元素组成（ 氮上有未共享电子对而大多显碱性 ）；大多结构复杂，结构类型多，主要有 杂环 类,大环 类,萜类,甾类 及 有机胺 类。结构中氮原子有多种形式,脂氮,芳氮 ； 季铵,叔胺,仲胺 及 伯胺 ； 游离 状态和 酸结合 状态；以 氮氧配位键 形式存在。6二、理化性质1、物理状态多数生物碱为 结晶型固体,少数为 无定形粉末,槟榔碱、烟碱等小分子生物碱为 液体 。麻黄碱等小分子生物碱具 挥发性,咖啡因等具 升华性 。一般生物碱为 无色或白色,结构中具有较长共轭体系，并具有助色团，可显 不同颜色 。具有手性碳原子或手性分子的具旋光性，且与其生理活性有光，通常左旋体比右旋体 生理活性强 。72、溶解性大多数生物碱成分 极性较小,游离状态 下难溶于水，易溶于氯仿、乙醚、乙醇、丙酮及苯等 有机溶剂 。与酸结合成生物 碱盐 后水溶性增加。季铵型生物碱、有氮氧配位键的生物碱 易溶 于水，液体生物碱及一些小分子固体生物碱既溶于 水 也可溶于 有机溶剂 。3、沉淀反应大多数生物碱在 酸性水溶液 中可与某些试剂生成不溶于水的 复盐 或分子 复合物 。生物碱沉淀剂 有碘化物复盐、重金属盐和大分子酸三大类。84、显色反应生物碱在一定 pH条件下可与 酸性染料 生成有色配合物，可被氯仿等定量提出。具有 酯键 的酯碱如乌头碱等可与 异羟肟酸铁 试剂反应生成紫红色。5、碱性大多数生物碱呈碱性反应，能使 红色 石蕊试纸 变蓝 。其分子中氮原子上的 孤对电子 对质子有一定程度的 亲和力,故显碱性。（强弱与孤对电子的 杂化方式,氮原子的 电子云密度分布 及 分子的空间效应 等因素有关）。96、紫外光谱特征吸收峰位置与 共轭系统 中 助色团 的种类、位置、数量有关外，结构中的 氮原子 与发色团直接连接或参与发色团的生物碱，其吸收峰位置还与测定时溶剂的 pH有关。喹啉中性 溶液中,λ max（ lgε ）为 227（ 4.56）,280（ 3.56）,314（ 3.56）；酸性 溶液中,λ max（ lgε ）为 236（ 4.45）,307（ 3.76） 313（ 3.79）。10三,定性鉴别(一 )生物碱的沉淀反应生物碱的酸性水溶液或稀醇 （ 小于 50%） 溶液中,滴加 硅钨酸,磷钨酸,磷钼酸 试剂数滴,生成 （ BH+） 4[Si（ W3O10） 4]沉淀 （ 淡黄色或灰白色 ）,3BHPO412WO32H2O沉淀 （ 白色至褐色 ）,3BH3PO412MoO32H2O 沉淀 （ 白色至黄褐色,加氨水转变为兰色 ） 。注,制备样品供试液时必须净化处理，除去蛋白质、多肽和鞣质等也可生成沉淀造成 假阳性 结果的组分；含有 两种以上 中药中含有生物碱成分，此定性方法不做考虑。11马钱子散中生物碱成分的鉴别组成 马钱子、地龙鉴别 取马钱子散 1g，加 浓氨试液 数滴及 氯仿 10mL，浸泡数小时，滤过，取滤液 1mL蒸干，残渣加 稀盐酸 1mL使溶解，加碘化铋钾试液 1～ 2滴，即生成黄棕色沉淀。12(二 ) 色谱鉴别1,薄层色谱法首先用适当的溶剂提取生物碱,提取液经浓缩后直接或经过必要的净化后,点在薄层板 （ 硅胶或氧化铝 ） 上,层析 （ 多为 氯仿,苯 等,加入其他溶解 调整极性 ）,后喷洒生物碱显色剂 （ 改良碘化铋钾 等 ）,再根据生物碱的特性,选择特异的颜色反应或荧光,并应用纯品对照,或标准药材对照,同时须作 阴性 对照后确定 。 如用硅胶为吸附剂时,一般应用 碱性系统展开剂 较多,或使生物碱的薄层分离在 碱性环境 下进行 。13小活络丸中川乌、草乌的鉴别组成 胆南星、制川乌、制草乌、地龙、乳香（制）、没药（制）鉴别 取小活络丸 15g，剪碎，加无水 乙醇 40mL，浸渍24h，滤过，滤渣用无水乙醇少许洗涤 2次，与滤液合并，水浴蒸干，残渣加 10%盐酸溶液 20mL使溶解，滤过，滤液滴加氨试液调节 pH值 9～ 10，用 氯仿 提取，提取液低温蒸干，残渣加氯仿 0.5mL使溶解，作为 供试品 溶液。乌头碱、乌头原碱 对照溶液滤纸,正丁醇 -醋酸乙酯 -无水乙醇（ 10,10,2），喷碘化铋钾 试液142．纸色谱法 用于 生物碱盐或游离碱 的鉴别鉴别 生物碱盐 时，生物碱以解离形式存在，极性大，以 水为固定相的正相色谱，以 极性强的酸性溶剂 为展开剂；常用 正丁醇 -醋酸 -水 （ BAW）系统。选用一定 pH的酸性缓冲液为固定相时，选用极性较小的溶剂系统为展开剂。生物碱以 游离 的形式存在时，常以 非水性 的亲水性溶剂如甲酰胺 为固定相，以甲酰胺饱和的 亲脂性 有机溶剂，如苯、氯仿或醋酸乙酯等为展开剂。显色剂与薄层色谱的相同，含 硫酸 的试剂除外。153．高效液相色谱法在恒定的高效液相色谱条件下，各种生物碱都具有一定的 保留时间,可作为定性鉴别的参数。一般要求取得两个色谱系统的保留时间，或应用二极管阵列检测器作出鉴定。供试品需经过 预处理,色谱柱前使用 保护柱 。16四、含量测定止咳灵注射液中总生物碱的含量测定组成 麻黄、洋金花、苦杏仁、连翘测定 精密量取止咳灵注射液 10mL，置分液漏斗中，加1moL/L氢氧化钠 溶液 0.5mL，用 氯仿 提取 4次（ 10mL,10mL,5mL、5mL），合并氯仿液，置具塞锥形瓶中，精密加 硫酸 滴定液（ 0.01moL/L） 10mL及新沸过的冷水 10mL，充分振摇，加 茜素磺酸钠 指示剂（ pH3.7～ 5.2，黄 → 紫 ） 1～ 2滴，用 氢氧化钠 滴定液（ 0.02moL/L）滴定至 淡红色,并将滴定结果用 空白实验 校正。每 1mL硫酸滴定液相当于 3.305mg的麻黄碱（ C10H15NO)。本品每 1mL含总生物碱以麻黄碱（ C10H15NO)计，应为 0.50～0.80mg。取样体积 ））含量（ FTVVmLmg 0(/17昆明山海棠片中总生物碱成分的含量测定组成 昆明山海棠测定 取昆明山海棠片 60片，除去糖衣，研细，精密称取适量（约相当于 25片），置 200mL锥形瓶中，加适量硅藻土，混匀，加 乙醇 70mL,加热回流 40min，放冷，滤过，滤渣再加 乙醇 50mL，加热回流 30min，放冷，滤过，合并滤液，置水浴上蒸干，残渣加 盐酸 溶液（ 1→100 ） 30mL，置水浴上搅拌使溶解，放冷，滤过，残渣再用盐酸溶液（ 1→200 ）同法提取 3次（ 20,15、15mL），合并滤液于分液漏斗中，加 氨试液 使溶液呈碱性，用乙醚 振摇提取 4次（ 40,30,25,25mL），合并乙醚液，用水振摇洗涤 2次，每次 10mL，乙醚液用滤纸滤过，醚液置于已 称定重量 的蒸发皿中，在低温水浴上蒸去乙醚，残渣中加入少许无水乙醇，蒸干，在 105℃ 干燥至恒重，称定重量，计算，即得。本品每片含生物碱不得少于 1.0mg。18(一 )经典化学方法1.重量法 重量法测定中药制剂中生物碱多为测定其总生物碱的含量。 本法可用于混合总碱、未知结构或分子量相差较大的生物碱的含量测定。 缺点 是 挥发性生物碱 不宜用此法，在蒸发提取溶剂或加热、干燥时能 分解破坏 以及加碱使生物碱游离时可发生 水解的生物碱 也不可用此法。本法 取样量大,得到的残渣在称量的准确度内方可应用。应用本法要求定量的将生物碱提取完全，并尽可能除去杂质，须注意 选择合适 的提取溶剂。192．容量分析法：a.游离生物碱不溶于水，可先将生物碱溶于 过量标准酸 溶液中，再用 标准碱溶液回滴 。b.游离生物碱能 溶于水 或水 -乙醇溶液中的可 直接滴定 。c.生物碱盐在水或乙醇介质中，用 强碱溶液 滴定。一般使其溶于 90％乙醇溶液中，可用 标准碱乙醇液滴 定，用 酚酞 作指示剂。20(二 )分光光度法多用 单波长法 测定总生物碱的含量1、直接测定不经过化学反应，利用生物碱物质 自身的光吸收直接比色测定，用于药味较少，干扰不大的中药制剂中总生物碱的含量测定。如：戊己丸 （黄连、吴茱萸（制）、白芍（炒））中总生物碱含量索氏提取，过中性氧化铝柱，吸收系数法212、离子对萃取比色法(1)酸性染料比色法,在 一定 pH的介质中，生物碱 B与氢离子 H+结合成盐 (BH+)，与某些酸性染料的阴离子 In-结合成有色化合物 [BH+In-]，它能定量的被有机溶剂 提取 出来，此结合物碱化或酸化后，即定量放出染料可进行比色，或测定该有色的有机溶液。此方法的关键：选择 合适的 pH,合适的酸性染料 和 合适的有机溶剂 。含有 1个 N原子的生物碱与酸性染料 (溴酚蓝 )生成分子1∶l 的结合物，与 2个 N原子的生物碱生成分子 1∶2 的结合物 (pH应较低 pH3.0 ～ 5.8)。此外，应 防止操作时混入水分 。同时也须注意带入水相中过量染料影响测定的结果。例 风湿骨痛胶囊中 乌头总生物碱 的含量测定22(2)苦味酸盐比色法利用在 弱酸性 或 中性溶液 中生物碱可与苦味酸定量生成苦味酸盐 沉淀,该沉淀可溶于氯仿等有机溶剂，也可在碱性条件下解离释放出生物碱和苦味酸来进行含量测定。方法一,滤取生物碱苦味酸盐 沉淀,洗去多余试剂，加 碱使沉淀解离，以 有机溶剂萃取游离 出的生物碱，用含有苦味酸的 碱性水溶液 进行比色测定，再换算出生物碱的含量；方法二,直接在 pH4～ 5的缓冲溶液中加 氯仿 提取生物碱苦味酸盐，氯仿液在 360nm直接比色测定；23方法三,在 pH为 7的缓冲液中加试剂，使生物碱与苦味酸成盐,用 氯仿 提取该盐，再用 pH11的缓冲溶液使其溶解，苦味酸转溶到 碱水液 中进行比色，再换算出生物碱的含量。例 万氏牛黄清心丸中黄连总季铵碱的测定中国药典（ 2000年版 ），采用 方法二中国药典（ 2005年版 ），采用 薄层色谱法 测盐酸小檗碱的含量24(3)雷氏盐比色法：生物碱雷氏盐沉淀，易 溶于丙酮,可 直接比色 测定吸收度，换算生物碱的含量。而其丙酮溶液所呈现的吸收特征，是由于分子结构中的 硫代氰酸铬铵 部分，而不是结合的生物碱部分，其吸收值与样品或溶剂无关。 硫代氰酸铬铵 在丙酮中的克分子吸收系数为 106.5(单盐 )。故可根据其吸收值 A按下式直接测得样品重而不需绘制标准曲线。W =（ A/ε ） × M× V/1000本方法可不需要标准对照品,但需注意生物碱生成单盐或双盐,并要注意样品的净化 。例 产妇康颗粒中益母草 总生物碱 的含量测定25(3)异羟肟酸铁比色法含有 酯键 结构的生物碱，在碱性介质中加热时酯键水解，产生的 羧基 与 羟胺反应 生成 异羟肟酸,与 高铁离子 生成 紫红色配位化合物,可用比色法测其含量。26(三 )色谱法1．薄层色谱法在生物碱类成分分离和测定须结合生物碱的通性选择合适的提取溶剂，需要采用化学方法 提取和纯化,常用液 -液萃取或液 -固萃取，或结合生物碱的特性进行纯化。 常使用碱性展开剂或在碱性气氛中展开 。在薄层直接扫描定量时，须首先作一 工作曲线,目的是考察工作曲线是否为通过原点的直线，以便决定采用 外标一点法或外标两点法 进行定量，其次需要找出线性范围，以便摸索样品点样量。采用薄层直接扫描定量还需要随行对照品进行，同时要考察稳定性，同板、异板效应和精密度等。272．高效液相色谱 可采用正相、反相和离子对色谱，其中以反相高效液相色谱 应用较多。在 RP-HPLC中为了克服 游离硅醇基 的影响，采取了以下的措施，(1)流动相方面的改进：a.加入硅醇基抑制剂，最常用的硅醇基抑制剂是 三乙胺 ;b.在流动相中加入 离子对试剂 ;c.在流动相中加入 季铵盐试剂,例如在水 -甲醇流动相中加入 0.01mol／ L的溴化四甲基胺。机理是流动相不断地流入色谱柱后，即连续地添加 掩蔽性试剂 (季胺盐 )，被分离的碱性化合物和硅醇基之间的相互作用被阻碍，从而使生物碱类成分得到很好的分离。流动相中水 -甲醇比例的改变以及 pH的变化都不影响峰的对称性。28(2)固定相方面的改进：选择碳链较短的键合相硅胶填料，例如 C8比 C18好。(3)增加流动相的脂溶性(4)调整流动相的 pH值,pH & pKa+1或 & pKa-1条件下用离子对试剂。(5)升高柱温 。29基本流程1）样品供试液制备,样品根据生物碱通性提取、净化、定容制备供试液。（如利用生物碱溶于氯仿，生物碱盐不溶于氯仿，通过萃取与反萃取达到提取净化，再定容后制成样品供试液）。2）标准液配制,先配成标准储备液，再配制成系列标准液。3）系统适应性,色谱柱、流动相、流速、检测器、测试波长等。4）选择定量 方式，并相应进样、检测、计算含量。303．气相色谱法适用于有 挥发性 的,遇热不分解 的生物碱类。游离碱或盐都只能得到一个游离碱的色谱峰，但生物碱盐在急速加热器中产生的酸对色谱柱和检测器不利，所以 一般多经提取后进柱 。例如麻黄碱、苦参碱和颠茄类生物碱。31第二节 黄酮类成分分析一、结构特征黄酮苷元OABC123456781`2` 3`4`5`6`OO芦丁2-苯基色原酮C6-C3-C6OOOOOHOH OOH 3 C32基本母核为 2-苯基色原酮 的一类化合物，现泛指 两苯环通过中央三碳链相互联结而成 的一系列化合物。在植物体内大部分与 糖结合成苷,一部分以 游离形式 存在。根据基本结构分为 黄酮、黄酮醇、双黄酮、异黄酮、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查耳酮、橙酮、花青素、黄烷 等类型。多数黄酮结构中存在有 桂皮酰基 及 苯甲酰基 组成的 交叉共轭体系,在 200nm～ 400nm有强烈的吸收带。大多数黄酮及其苷类含有 游离酚羟基,可与 聚酰胺 形成氢键 。 ―― 色谱法33二、理化性质1、物理性质多为 结晶性固体,少数（如黄酮苷）为 无定形粉末 ；苷 类具有 旋光 性，多为 左 旋，游离的 苷元 中只二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇有旋光性。黄酮、黄酮醇及其苷类多显 灰黄色 至 黄色,查耳酮为 黄色至橙黄色,二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类，不组成交叉共轭体系或共轭很少，不 显色或微黄色 。342、溶解度一般 游离苷元 难溶于或不溶于 水,易溶于 甲醇,乙醇,醋酸乙酯,乙醚 等有机溶剂及 稀碱液 中，苷元分子中引入羟基数越多,水中溶解度越 大,羟基甲基化后，在有机溶剂中溶解度增大 。黄酮类的羟基糖苷化后，水溶解度增 大 。黄酮苷一般易溶于水,甲醇,乙醇 等强极性溶剂，难溶或不溶于 苯,氯仿 等有机溶剂。供试品的制备应视溶解特性而定。一般黄酮苷类及极性稍 大的苷元（羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查耳酮等），可用 丙酮,醋酸乙酯,乙醇,水 或极性较大的 混合溶剂 提取，常用 甲醇 -水（ 1,1）或 甲醇,多糖苷类可用 沸水 提取。大多数黄酮类苷元宜用 极性较小 的溶剂，如 氯仿,乙醚,醋酸乙酯,多甲氧基黄酮类游离苷元，可用 苯 提取。353、酸碱性（ 1）酸性多含有 酚羟基,显酸性，可溶于碱性水溶液、吡啶、甲酰胺、及二甲基甲酰胺。黄酮中，酚羟基酸性 强弱 顺序,7,4′ - 二羟基 & 7- 或4′ -羟基 & 一般酚的羟基 & 5-羟基（ 2）碱性氧原子的性质黄酮类分子中 γ -吡喃酮环上的 1-位氧原子,具有未共用的电子对，表现出 微弱的碱性,可与强无机酸生成 烊盐,有特殊的颜色，但不稳定，加水即分解。364、显色反应 与 酚羟基,γ -吡喃酮环 有关（ 1）还原反应 与盐酸 -镁粉（或锌粉）反应方法：将样品溶于 1mL甲醇 或 乙醇,加入少许 镁 （或锌）粉振摇，滴加几滴 浓盐酸,1至 2分钟内（必要时微热）即可出现颜色。多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、及二氢黄酮醇类化合物显 橙红色～紫红色,少数显 紫色～蓝色 。查耳酮、橙酮、儿茶素类 不显色 。37（ 2）金属盐类试剂的配合反应OH OOOOHOH铝盐,常用试剂为 1％三氯化铝 或 硝酸铝溶液 。生成的配合物多为 黄色 （ λ max＝ 415nm），并有 荧光 。可 定性、定量 。铅盐,常用 1％醋酸铅 及 碱式醋酸铅 水溶液，可生成 黄色至红色沉淀,可用于 鉴定、提取、分离 。锆盐,多用 2％二氯氧锆甲醇 液。黄酮类分子中有游离的 3-OH 或 5-OH，均可生成 黄色的 锆化合物，对酸稳定性不同，再加枸橼酸时，后者褪色，前者呈鲜黄色（ 锆 -枸橼酸反应 ）385、紫外光谱特征黄酮类具有 2-苯基色原酮 的基本结构，具有紫外吸收峰，有两个较强的吸收带。300nm～ 400nm，由 B环 桂皮酰基 引起240 nm～ 285nm，由 A环上的 苯甲酰基 引起可加入 位移试剂 如甲醇钠、醋酸钠、氯化铝等，使 最大吸收波长 发生位移，选择性提高，可消除杂质干扰，利于含测。39三、定性鉴别主要有 化学显色反应,纸色谱 和 薄层色谱 。(一 )化学显色反应1,盐酸 - 镁粉反应,生成了阳碳离子。例 牛黄解毒片（黄芩） 的鉴别：取本品 6片，研细，加 乙醇 10mL,温热 10分钟，滤过，取滤液 5mL，加 盐酸 0.5mL与少量 镁粉,加热，溶液显 红色 。40方法,将中药制剂用适当方法提取分离。组分较少的制剂可用有机溶剂提取，常用的溶剂有 甲醇,乙醇或乙酸乙酯 ；取样品液 5～ 10mL，加入数滴盐酸，然后加入少许镁粉，如果有黄酮、黄酮醇或其二氢化合物存在，数分钟后则可产生 红色～紫红色 。可观察 泡沫 颜色。必要时，需作 空白试验 。41例 黄芩提取物 的鉴别取本品少量，加水 2mL，滴加 氢氧化钠 试液 1滴，溶液显 橙黄色,滴加 稀醋酸 使溶液颜色基本褪去，然后再滴加 5%二氯化氧锆 溶液 1滴，溶液显 黄色,加稀盐酸颜色不褪。42黄酮类成分能与金属离子如 Al3＋,Zr4＋ 等产生络合作用，产生荧光或颜色加深等。络合作用的条件是黄酮类成分 必须具备 下述条件之一者，即 5-OH(a)、3-OH(b)或邻二酚羟基 (c),(a),(b)都是 羟基与 4位羰基 共同与金属离子形成络合物的。三氯化铝、硝酸铝和二氯氧锆的醇溶液常作为黄酮类成分的重要 定性 试剂及 薄层 与 纸层析 的显色剂。2．与金属盐类试剂的络合反应43(二 )纸色谱法黄酮类成分纸色谱的溶剂系统可归纳为 酸性溶剂 与 中性溶剂 系统两个方面 。酸性溶剂系统 是多种不同比例量的混合酸性溶剂,对绝大多数黄酮成分的分离,均能取得适当的 Rf值,分离较好,色点扩散也小,尤以 正丁醇 -乙酸 -水 (4∶ 1∶ 5)应用最为普遍 。 此外,适当浓度的稀释乙酸如 乙酸 -水 (6∶ 4)也能得到较满意的分离,尤以黄酮苷类结果更好 。 假若增加乙酸浓度,一般可以使游离黄酮类的 Rf值增大 。中性溶剂系统 是用水和有机溶剂组成的。利用水对各种黄酮及其苷类不同的溶解度，易于产生化合物间分配系数的差别。乙酸乙酯 -水,氯仿 -水,正丁醇 -水 等，都是实用的溶剂系统。44(三 )薄层色谱法黄酮类成分的薄层定性，一般采用 吸附薄层,常用的吸附剂有 硅胶与聚酰胺,也有用纤维素、硅酸镁、氧化镁。 硅胶色谱 分离 弱极性化合物 较好；聚酰胺 色谱分离含 游离酚羟基 的黄酮及其苷颇为理想；而 纤维素 薄层则适用于分离 多糖苷 混合物。展开后的显色反应可采用在紫外光下观察荧光和喷显色剂相配合的方法。451．硅胶薄层色谱 用硅胶分离黄酮成分遵循 正相色谱 层析规律，化合物极性 越强,所需溶剂的极性 越大 。常用的 溶剂系统 有：甲苯 -甲酸乙酯 -甲酸 (5∶4∶1),分离黄酮苷元 ；苯 -甲醇 (95∶5),分离 黄酮 苷 元 ；苯 -甲醇 -乙酸(35∶5∶5),分离 黄酮苷 ；氯仿 -甲醇 (8∶2),分离 黄酮苷元及苷 ；苯 -乙酸乙酯 (7.5∶2.5) 或苯 -丙酮 (9∶1),分离 黄酮苷元衍生物 如甲醚或乙酸酯中性成分；甲苯 -甲酸乙酯 -甲酸(5∶4∶1),分离 双黄酮 成分。溶剂系统中各组分的配比可根据薄层色谱的需要加以调整。46实例 淫羊藿的鉴别供试液制备 取本品粉末 0.5g，加 50％乙醇 30mL置水浴上 回流 30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干乙醇后，加水少量溶解，加至 聚酰胺 小柱上，先后用水，乙醇各 lOOmL洗脱，收集乙醇洗脱液，蒸干，残渣用乙醇溶解，使成 1mL，作为供试品溶液。对照液制备 取淫羊藿苷对照品，制成 0.5mg/mL的 乙醇 溶液。薄层板 硅胶 G加 0.1mol/L Na2HPO4的 0.3％ CMC-Na+自制板；厚度,250μm硅胶除对黄酮类成分产生吸附外，还与游离酚羟基极性较大的黄酮化合物产生 氢键,从而产生拖尾现象。制备 碱性 的硅胶 G板，可有效减少黄酮类成分在硅胶板上的拖尾现象。47点样 供试品溶液 10μL，对照品溶液 2μL；条带状点样。展开剂 醋酸丁酯 -甲酸 -水 (1.3∶1∶1)10℃ 以下放置后的上层溶液。展开方式 展开剂预平衡 15分钟；上行展开；展距,8cm。显色 喷以 5％ AlCl3乙醇溶液,105℃ 加热约数分钟后，置紫外光灯 (365nm)下检视。色谱识别 供试品色谱中，在与淫羊藿苷对照品色谱相应的位置上，显相同的黄色荧光斑点。注意事项 温度在 25℃ 以上；控制湿度在 18-47％范围内色谱效果较好。481 2 3 4 5 6样品,1.淫羊藿苷 2.淫羊藿 3.箭叶淫羊藿4.朝鲜淫羊藿 5.柔毛淫羊藿 6.巫山淫羊藿492．聚酰胺薄层色谱用于分离含 游离酚羟基的黄酮苷与苷元 较好。由于各种黄酮类成分取代基团的性质、多少和位置的不同，与聚酰胺形成氢键的能力 有所差异而得到分离。一般说来，展开剂中大多含醇、酸、水，或二者兼有。常用的溶剂系统有：甲醇 -水 (8∶2),分离 黄酮苷元及苷,乙醇 -水 -乙酰丙酮 (2∶4∶1),水 -乙醇 -丁酮 -乙酰丙酮(13∶3∶3∶1),苯 -丁酮 -甲醇 (6∶2∶2),分离 黄酮苷元 ；甲酸 -甲醇 -乙酸乙酯 (1∶21∶8),乙酸 -水 (1∶2),分离 黄酮苷 。50例 双黄连口服液中黄芩苷、绿原酸鉴别组成 金银花、黄芩、连翘鉴别 取本品 1mL，加 75％乙醇 溶液 5mL，摇匀，作为供试品溶液。另取黄芩苷、绿原酸对照品，分别加 75％乙醇制成每 1mL含 0.1mg的溶液。吸取上述三种溶液各 1～ 2μ L，分别点于同一 聚酰胺薄膜 上，以 醋酸 为展开剂，展开，取出，晾干，置 紫外光灯 （ 365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的 荧光斑点 。513．纤维素薄层色谱用于分离 黄酮苷类成分 效果较好，原理与纸色谱相同，色谱流动相可套用纸色谱所有的流动相。常用的展开剂有：(1)正丁醇 -乙酸 -水 (4∶1∶5) 。(2)2％甲酸；不同浓度的乙酸 (6％,10％,40％,60％ )；乙酸乙酯 -甲酸 -水 (8∶2∶3,上层 )。(3)异丙醇 -氢氧化铵 -水 (8∶1∶1) 。52a.黄酮类成分的纤维素色谱行为是：分子中 酚羟基增多时，无论用上述任意一溶剂系统 Rf值均减少 ；当分子中羟基为 甲基 或甲氧基所取代时,Rf值增加 ；b.黄酮苷分子中 醇羟基 增多，用不同浓度的乙酸展开，Rf值增加，而用正丁醇乙酸水系统则相反。极性,石油醚 & 环己烷 & 四氯化碳 & 三氯乙烯 &苯 & 甲苯 &二氯甲烷 & 乙醚 & 氯仿 & 乙酸乙酯 & 丙酮 &正丁醇 & 乙醇 & 甲醇 & 水 &乙酸53四、黄酮类成分定量分析(一 )比色法最常用的是与铝盐反应，试剂为三氯化铝和硝酸铝。测定 总黄酮 时常用芦丁作对照品。实例 消咳喘糖浆中 总黄酮含量测定标准曲线制备 精密吸取 60μg/mL的无水 芦丁 对照液 0.5、1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL分置于 10mL量瓶中，各加入0.1mol/L三氯化铝 溶液 2mL,1mol/L 醋酸钾 溶液 3mL,加 60%乙醇至刻度，混匀，放置 30分钟。以相应的溶液为空白，在420nm处分别测吸收度。以吸收度为纵坐标，对浓度为横坐标绘制标准曲线。54测定法 精密量取本品 2mL，置 50mL量瓶中，加 60%乙醇至刻度，摇匀，精密量取 1mL，置 10mL量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自,加 0.1mol/L三氯化铝 溶液 ……” 起依法操作，制成供试品溶液。另 精密量取本品 2mL，置 50mL量瓶中，加 60%乙醇稀释至刻度，精密量取 1mL，置 10mL量瓶中，加 60%乙醇至刻度，摇匀,作空白,依法测定吸收度。从标准曲线上读出供试品溶液中芦丁的浓度，计算，即得。本品每 1mL含总黄酮以无水芦丁（ C27H30O16)计，不得少于2.0mg。VCmLmg 稀释倍数）＝含量（?/55（二 )紫外分光光度法a.黄酮、黄酮醇I带为 330～ 350nm,Ⅱ 带均在 250～ 270nm；b.双氢黄酮I带吸收弱，在 310～ 330nm,Ⅱ 带在 275～ 290nm；c.异黄酮无 I带吸收,Ⅱ 带在 250～ 270nm；d.查耳酮I带为 360～ 390nm,Ⅱ 带吸收较弱，在 240～ 260nm。一般随 共轭程度 和 羟基数目 的增加，吸收带向 长波 移动。中药制剂的成分复杂，一般需经过适当的提取分离 (如正丁醇、乙酸乙酯萃取，聚酰胺柱,C18柱分离）后，才能进行定量分析。56(三 )薄层色谱法薄层色谱法测定中药制剂中单体黄酮类成分的 关键是分离 。样品经有机溶剂或水提取后，可用硅胶、纤维素或聚酰胺进行层析，以达到分离的目的。层析后可 TLC-比色法测定；也可以用薄层扫描仪直接测定。57(四 )高效液相色谱法黄酮类成分的 Np-HPLC：a.无羟基 的黄酮类化合物或乙酰化黄酮类化合物，固定相为硅胶，流动相可套用薄层色谱条件，但极性要相对小一点。b.乙酰化 黄酮、有一个羟基的黄酮类成分，采用 -CN键合相色谱，流动相为乙烷 -氯仿。c.含有 2个以上羟基 的黄酮类成分可选用 -NH2键合相，流动相可选用二氧六环 -二氯甲烷 (1∶9) 。黄酮类成分的 Rp-HPLC,大多用 C18键合相，流动相常用甲醇 -水 -乙酸 (或磷酸缓冲液 )及乙腈 -水。58例 心通口服液中葛根素含量测定组成 黄芪、党参、淫羊藿、野葛等色谱条件,C18柱，甲醇 -水（ 21,79），检测波长 250nm59第三节 三萜皂苷类制剂的分析OOHOHOHHHOOOOCH 3H O C H 2HO人参皂苷 Re6个 异戊二烯 单位联结而成游离三萜类 化合物多不溶于水，与糖结合成 苷 后，大多可溶于水，振摇成 胶体溶液,并有持久性似肥皂溶液的泡沫60性质：1,皂苷 可 溶于 水,易溶 于热水、含水稀醇、热甲醇和热乙醇,难溶 于极性小的溶剂。 三萜皂苷元 能 溶于 石油醚、苯、乙醚、氯仿等有机溶剂,不溶于 水。2,皂苷 在 正丁醇 或戊醇中溶解度好（可用正丁醇提取水溶液中的皂苷，与糖、蛋白质分离）。3,三萜化合物 在无水条件下，可与强酸、中等强酸（三氯乙酸）或 Lewis酸（氯化锌、三氯化铝、三氯化锑）作用，显色或呈荧光,放久后分子间缩合而 褪色 。61猪牙皂的鉴别,（ 3）取本品粉末 1g，加 水 10mL,煮沸 10分钟，滤过，滤液强烈振摇，即产生持久的 泡沫 （持续 15分钟以上）62一、皂苷类成分的定性分析(一 )泡沫反应取中药材粉末约 1g，加 水 10mL，煮沸 10分钟后 过滤,将滤液于试管内 强烈振摇,如产生 持久性泡沫 (15分钟以上 )即为 阳性 反应。所产生的泡沫多少与 pH有关，取 2支试管，一管加入0.1mol/L盐酸液 5mL，另一管加入 0.1 mol/L氢氧化钠液 5mL，再各加入中药水溶液，使酸管的 pH为 1，碱管 pH为 13，强烈振摇，如两管所形成的 泡沫高度相同,则中药中含 三萜皂苷,如碱管 泡沫较 酸管 泡沫 高 数倍，则中药中含 甾体皂苷 。63(二 )显色反应1．醋酐 -浓硫酸反应 取含皂苷样品置试管中，加 醋酐 1mL溶解后，沿试管壁加入少量 浓硫酸,在两液层中间出现色环，甾体皂苷 生成蓝色或蓝黑色，而 三萜皂苷 则出现红、粉红或紫色。642．三氯醋酸反应 取皂苷溶液滴在滤纸条上，滴三氯醋酸试剂，加热到 60℃,若斑点生成红色渐变为紫色，则样品为 甾体皂苷 ；若需加热到 100℃ 才出现以上颜色变化，则样品为 三萜皂苷 。3．氯仿 -浓硫酸反应 样品溶解于氯仿，沿管壁滴加浓硫酸后，在氯仿层呈现 红或蓝色,并有绿色 荧光 出现。4．冰醋酸 -乙酰氯反应 样品溶于冰醋酸中，加入乙酰氯数滴及氯化锌结晶数粒，稍加热，则呈现 淡红色或紫红色 。5．五氯化锑反应 样品加五氯化锑的氯仿液呈 紫蓝色 。65例 启脾丸中人参皂苷 Re、人参皂苷 Rg1的鉴别组成,人参、白术、茯苓、甘草、陈皮、山药等鉴别：取样品 9g，加 硅藻土 5g，研匀,氯仿 40mL超声提取 30分钟，滤过，药渣挥干溶剂，加 甲醇 50mL加热回流 1h，滤过，滤渣蒸干，残渣加甲醇 5mL溶解，过 中性氧化铝 柱，用 40%甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加 30mL水溶解，用水饱和的正丁醇振摇提取，合并 正丁醇 液，蒸干，残渣加甲醇 0.5mL溶解，作为供试品溶液。66人参对照 药材：人参皂苷 Re、人参皂苷 Rg1对照品：硅胶 G薄层板,氯仿 -醋酸乙酯 -甲醇 -水 （ 15,40,22：10） 10℃ 以下放置后的 下层溶液 为展开剂，喷 10%硫酸乙醇,105℃ 加热至斑点显色清晰，紫外灯下检视，供试品色谱中，分别在对照药材色谱和对照品色谱相应位置上，显相同颜色的 荧光斑点 。67供试液制备 取本品粉末 1g，加 氯仿 40mL，置水浴回流 1小时，弃氯仿液，药渣挥干，加 水饱和正丁醇 10mL，超声处理 30min，取上清液，加氨试液三倍量，摇匀，放置分层，取上层 正丁醇液 蒸干，加甲醇溶解制成 1mL供试液。对照液制备 取人参皂苷 Rb1,Rb2,Rc,Re,Rd,Rg1,Rf对照品和伪人参皂苷 F11对照品，加甲醇制成每 lmL各含 2mg的混合溶液，作为对照品溶液。薄层板 硅胶 G薄层板点样 供试液与对照液分别点样 1μl实例 人参、三七、西洋参 的薄层鉴别68展开剂 氯仿 -醋酸乙酯 -甲醇 -水 (15? 40? 22?10)10℃ 以下放置后的下层溶液。展开方式 展开剂预平衡 15分钟；上行展开；展距：12-14cm显色 喷以 10%硫酸乙醇 溶液,105℃ 加热数分钟至斑点显色清晰,置紫外光灯 (365nm)下检视荧光色谱。69色谱识别,1.人参皂苷 Rf为人参含有，西洋参不含，可作为人参与西洋参的区别依据之一；2．西洋参含的人参皂苷 Fll，人参不含，可作为西洋参的鉴别特征；3.生晒参与红参之区别，在于 Rgl以上的,微量皂苷,,红参较生晒参明显。4.三七色谱较简单，最明显的是 Rbl,Re,Rgl三个主斑。需注意的是 Re斑点与三七皂苷 R1重叠。70样品,1-2．生晒参； 3-5．红参； 6-9．朝鲜红参； 10-12．西洋参 (进口 )；13-14．西洋参 (国产 )； 15．三七；16．人参皂苷对照品 Rb1(S1),Rb2(S2),Rc(S3),Re(S4),Rd(S5)，Rg1(S6),Rf(S7),Fll(S8)。71(三 )薄层色谱三萜皂苷类成分进行薄层分离时采用吸附剂常用的是 硅胶 或 氧化铝 以及特殊需要的 硅藻土 。亲水性强的皂苷通常 要求硅胶的吸附活性较弱些,展开剂的极性要大些,才能得到较好的分离效果。常用的溶剂系统有,氯仿 -甲醇 -水 (13∶7∶2,下层 ),正丁醇 -乙酸乙酯 -水 (4∶1∶5,上层 )等。72三萜皂苷元的极性较小,如以硅胶为吸附剂,展开剂的亲脂性要求强烈,所用的溶剂系统常以苯、氯仿、己烷等为主要组分，再加以少量其他极性溶剂。常用的溶剂系统有 环己烷 -乙酸乙酯 (1∶1),苯 -乙酸乙酯 (1∶1),氯仿 -乙酸乙酯 (1∶1) 等。73薄层色谱后，三萜皂苷类化合物常用的显色剂：(1)25％磷钼酸乙醇溶液,喷后置 140℃ 加热 5～ 10分钟，皂苷元均呈 深蓝色,灵敏度高 (0.5μg 即能显色 )，不易褪色。(2)三氯化锑的浓盐酸或氯仿溶液,喷后在 90℃ 烤 10分钟，因有 毒性,应在通风橱中进行，加热后不同的皂苷元在可见光或紫外光下显出不同种颜色，有助于鉴别皂苷元。(3)硫酸 -甲醇 (1∶1),喷后加热，显红褐色、紫色、黄色或黑色，与加热温度有关。74(4)氯磺酸 -乙酸 (1∶2) 溶液,喷后 130℃ 加热 5分钟，各种皂苷元显不同颜色，如天蓝、紫、粉红、淡棕色等，在紫外光灯下也显不同荧光，比较灵敏，可检出 10-1～ 10-3μg,可用于鉴别 和 定量 。(5)碘蒸气,灵敏度约为 1～ 2μg,碘的优点是易挥发，显色后挥去碘，斑点可作定量分析，常用于确定斑点位置。注,皂苷类化合物的薄层色谱鉴别往往要求控制 相对湿度与 温度,如三七皂苷在 10℃ 以下展开，可与人参皂苷 Re分开，在室温展开则不能使两者分开。 一般可控制展开温度在 20 ℃以下，相对湿度在 47%左右。75二、皂苷类成分的定量分析总皂苷 的含量测定一般需用适当的 溶剂提取,如甲醇 (80％～ 95％ )、乙醇等，提取后经 分离 （如水饱和的正丁醇萃取，大孔吸附树脂经处理后溶剂洗脱）得到 总皂苷成分,再根据皂苷类化合物的各自特征来选择含量测定方法。最常用的方法是 比色法 。76皂苷元 的含量测定时可按总皂苷的提取分离方法得到 总皂苷,再 加酸 (如硫酸、盐酸 )加热水解,得到皂苷元；也可以将样品 先行水解,再用有机溶剂从水解后的混合液中 提取皂苷元。测定皂苷元含量的方法主要有 薄层色谱法、高效液相色谱法 和 比色法 。单体皂苷 的含量测定方法主要为 薄层色谱法 和 高效液相色谱法 。77例 复方丹参片中三七皂苷的含量测定（大孔树脂分离－比色法）组成,丹参、三七、冰片标准曲线的绘制：5～ 7份不同浓度的 人参二醇 甲醇液；新鲜配制的 5％ 香荚兰醛试液 和 高氯酸,560nm测定人参二醇对三七皂苷换算系数（可测）78样品测定：取样品 10片，按平均片重称取一片的重量，先用 乙醚提取，残渣挥去乙醚后加 甲醇 提取，提取液蒸干，用 水 溶解后移至 大孔树脂,先水洗脱 糖类 再用 70％乙醇 洗脱，洗脱液水浴蒸干，残渣用 甲醇 溶解，精密移取定量，按标准曲线法测定吸光度。79(一 )比色法常利用皂苷能与某些试剂反应后产生颜色，然后于可见光区进行比色测定常用的皂苷显色试剂 有：浓硫酸 可以作为测定皂苷元的一种 通用试剂,甾体皂苷元与浓硫酸反应常显 黄 色，但需在较高温度 (80～ 90℃) 反应30～ 60分钟。硫酸 -醋酐、硫酸 -冰醋酸试剂 主要用于检测 甾体皂苷 。芳香醛 -硫酸或芳香醛 -高氯酸 是常用的皂苷类显色剂。对 -二甲氨基苯甲醛 主要用于检测 三萜皂苷 。80(二 )薄层色谱法样品经适当的溶剂提取，用薄层色谱法分离定量。定量方法 可用薄层洗脱 -比色法或薄层扫描法。81薄层色谱 -比色法的一般步骤,1,供试品的制备,包括样品的提取与预处理。2,对照品溶液的配制3.薄层板的制备4.点样 取适量的供试品溶液容定量毛细管或半自动点样器在薄层板距底边 1-1.5cm处点样（斑点状或条带状），同时点上对照品的应用溶液作随行对照。对照品与供试品交叉点样。5.展开,包括预平衡与样品展开、展开方式，展开剂，展距。826.定位,日光下、紫外灯下观察或碘蒸气定位。7.斑点捕集8.洗脱与定量,用合适的溶剂洗脱后加显色剂显色，或加显色剂显色后离心取上清，以相同大小的固定相为空白同法操作，于合适波长处比色定量。83薄层扫描法的一般步骤：1,供试品的制备,包括样品的提取与预处理。2,对照品溶液的配制3.薄层板的制备4.点样 取适量的供试品溶液容定量毛细管或半自动点样器在薄层板距底边 1-1.5cm处点样（斑点状或条带状），同时点上对照品的应用溶液作随行对照。对照品与供试品交叉点样。展开,包括预平衡与样品展开、展开方式，展开剂，展距。846.显色,采用合适的显色剂喷雾显色或衍生化显色，与合适的温度下烤干。7.扫描定量,在稳定显色的时间内，采用薄层扫描仪选择合适的参数扫描定量。85（三）高效液相色谱法主要用于 单体皂苷和皂苷元 的含量测定。具有 较强紫外吸收的 皂苷类成分可用 HPLC法分离测定并用 紫外检测器,无紫外吸收 或紫外吸收较弱的皂苷类成分可用 HPLC法分离测定并用 蒸发光散射检测器 。86例 三七片中人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1、三七皂苷 R1含量测定C18柱,乙腈 -水（ 梯度洗脱 ）,203nm例 乙肝宁颗粒中黄芪甲苷含量测定组成,黄芪、白花蛇舌草、茵陈等C18柱,甲醇 -水 （ 75,25）,蒸发光散射检测器87第四节 醌类成分的分析CH 3OH OOOHOH大黄素OOO丹参酮 IIA88中药中存在的蒽醌衍生物多为 羟基蒽醌 和它们的 苷 。常用的含蒽醌类化合物的中药，首推 大黄,此外还有芦荟、决明、茜草、虎杖、何首乌、番泻叶、萱草等。含有醌类成分的中成药制剂比较多见，以含 大黄,何首乌,紫草,丹参 的中药制剂为代表。89性质：1,游离醌类多具 升华性,小分子苯醌、萘醌有 挥发性 （水蒸气蒸馏）；2.游离醌 类 溶于 乙醇、乙醚、苯等有机溶剂，微溶于水；成苷 后易 溶于 甲醇、乙醇，热水可溶，不溶于苯等非极性溶剂。3,酸碱性,蒽醌类含有 酚羟基,碱水中易溶，加酸酸化时又可重新沉淀析出（ 碱提取－酸沉淀 ）4,显色反应,羟基蒽醌类在 碱性溶液 中会引起颜色变化并加深。9091例 天麻片中何首乌的鉴别取本品 20片，除去包衣，研碎，加 乙醚 20mL，振摇10分钟，放置 20min，滤过，滤液呈黄色，取 滤液 10mL，置分液漏斗中,加氢氧化钠试液 5mL，轻轻振摇，水层显红色,再加稀 盐酸 5mL，使水层呈酸性，振摇后水层由红色变为 无色 。92一、蒽醌类成分的定性分析(一 )化学显色反应1,羟基蒽醌类化合物遇碱显红～紫红色932.有 α -酚羟基 或 邻二酚羟基 结构的蒽醌类化合物可与 Mg2+形成橙红、紫红、橙黄、蓝紫等颜色的络合物。生成的产物具有下列结构：94例 大黄流浸膏的鉴别取本品 1mL，至瓷坩埚中，在水浴上蒸干后，坩埚上覆以载玻片，置石棉网上直火徐徐加热，至载玻片上呈现 升华物后，取下载玻片，放冷，置显微镜下观察，有棱形针状，羽状和不规则晶体，滴加氢氧化钠试液，结晶溶解，溶液显紫红色。(二 )升华法游离的蒽醌及其他醌类衍生物多具有升华性。中药制剂中如含有这类成分量较大，可采用升华法得到升华物，可见光下观察或加碱性试液显色定性。95例 乐脉颗粒中丹参酮 IIA的鉴别（ TLC）组成,丹参、川芎、赤芍、红花、香附、木香、山楂鉴别,取本品 5g，置 分液漏斗 中，加水 30mL，振摇，加 乙醚 40mL，振摇提取 3分钟，离心分离，分取乙醚液，加无水硫酸钠 1g，振摇，滤过，残渣用乙醚 10mL分两次洗涤，滤液与洗液合并，挥干，残渣加乙醚 1mL使溶解，作为 供试品溶液。 另取 丹参酮 IIA对照品,加乙醚制成每 1mL含 0.7mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各 10～ 15μL，分别点于同一 硅胶 G薄层板上，以 氯仿 为展开剂，展开，取出，晾干,日光 下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的 红色斑点 。96(三 )薄层色谱法是鉴别含蒽醌类成分的中药制剂的最主要的定性方法，吸附剂多用 硅胶 。展开溶剂系统：a.用于蒽醌类成分的大都是各种溶剂的混合系统，而且大多含有 水 或 甲醇 。b.乙酸乙酯 -甲醇 -水 (100∶16.5∶13,5或相近的配比 )是用途最广的展开剂，适于分离 蒽醌苷元 和 蒽醌苷 。c.正丙醇 -乙酸乙酯 -水 (4∶4∶3) 和异丙醇 -乙酸乙酯 -水(9∶9∶4) 适于分离 番泻苷 和 二蒽酮苷 。显色方法主要有喷 碱性试剂 或 醋酸镁甲醇 液,氨气 熏及在紫外灯下观察荧光，亦可在可见光下直接观察色斑。97例 牛黄解毒片中游离蒽醌和总蒽醌的测定（混合碱液比色法）组成,石膏、大黄、黄芩、金银花等对照品,取 100μg/mL的 1,8-二羟基蒽醌 对照液于 10mL量瓶，在水浴上蒸干，加 5%氢氧化钠 -2%氢氧化铵混合碱 液溶解并稀释，放置 1h，以 5%氢氧化钠 -2%氢氧化铵混合碱液为空白,510nm测吸光度。98游离蒽醌的测定：取样品 10片，取糖衣，称重，研细，称取一片重，置具塞三角瓶中，精密加入 氯仿 100mL，称重，水浴回流 4h，冷去，补足损失的氯仿。滤过，吸取滤液 50mL于分液漏斗，用蒸馏水洗涤至水层无色。氯仿层用 5%氢氧化钠 -2%氢氧化铵混合碱 液振摇萃取数次，直至混合碱液无色，合并碱液，用 20mL氯仿洗涤数次，至氯仿层无色，弃去氯仿层。将混合碱液在水浴上加热数分钟至氯仿挥尽，冷却，移入 100mL量瓶，稀释至刻度，放置 1h，以 5%氢氧化钠 -2%氢氧化铵混合碱液 为空白,510nm测吸光度 。））（游离蒽醌含量（平均片重每片含游离蒽醌量）（）（游离蒽醌含量样品对照阴性对照样品对照WWWAAACWW/%%1 0 02 0 0/%99总蒽醌的测定,精密称取一片重样品，置于 150mL烧瓶中，加 2.5moL/L硫酸 30mL直火回流 4h，放冷，加入 氯仿 20mL，水浴回流 0.5h，放冷，吸出氯仿液，再加氯仿，反复操作至氯仿无色为止。合并氯仿层液，用蒸馏水洗涤数次，至水层无色，弃去水液。氯仿液用 5%氢氧化钠 -2%氢氧化铵混合碱液 振摇萃取数次，至碱液无色，合并，用 20mL氯仿洗涤数次，至氯仿层无色，弃去氯仿液。将碱液置水浴上加热至氯仿挥尽，冷却，移入50mL量瓶中，用混合碱液稀释至刻度，放置 1h，以 5%氢氧化钠 -2%氢氧化铵混合碱液 为空白,510nm测吸光度 。%81%1 0 05 0 0/%81二羟基蒽醌含量，相当于平均每片重每片总蒽醌量）（总蒽醌含量）：（二羟基蒽醌含量），总蒽醌含量（相当于样品对照品阴性样品样品对照WAAACWW100二、蒽醌类成分的定量分析(一 )比色法1.加碱比色法1）游离蒽醌的测定 称取中药制剂粉末适量，在 索氏提取器 中用氯仿回流提取至无色。氯仿提取液移入分液漏斗中，以 5％氢氧化钠 -2％氢氧化铵 混合碱液 分次提取至无色，合并碱液，用少量氯仿洗涤，氯仿弃去，碱液调整至一定体积，若不澄清，可用 垂熔漏斗 过滤，滤液在沸水浴中加热 4分钟，用冷水冷却至室温,30分钟后在 490nm处比色，以 1,8-二羟基蒽醌为对照品，计算含量。1012）总蒽醌的测定称取中药制剂粉末适量，先用盐酸或硫酸水解蒽醌苷。然后用非极性溶剂如氯仿提取苷元后同上法测定。3）结合蒽醌的测定a,结合蒽醌 =总蒽醌 -游离蒽醌b.极性溶剂提取 蒽醌苷，水解成苷元后用 1）法测定。1022.醋酸镁比色法1）游离蒽醌的测定 称取中药制剂粉末适量，在索氏提取器中用氯仿回流提取至无色。将氯仿提取液蒸干，残渣加0.5%醋酸镁甲醇液溶解，并定容。在 498nm处比色，以 1,8-二羟基蒽醌为对照品，计算含量。2）总蒽醌的测定 称取中药制剂粉末适量，先用盐酸或硫酸水解蒽醌苷。然后用非极性溶剂如氯仿提取苷元后同上法测定。103例 天麻首乌片中大黄素含量测定（ TLC）组成,天麻、白芷、何首乌、熟地黄、丹参等取本品 40片，除包衣，称重，研细，取适量（约 15片量），加 5mol/L硫酸溶液 30mL，加热回流 1.5h，放冷，加 氯仿 80mL，加热回流 1.5h，放冷，分取氯仿层，酸水层用氯仿提取，合并氯仿 液，加无水硫酸钠脱水后，至水浴上蒸干，残渣加 甲醇 溶解，定容至 5mL，作为供试品液。0.1mg/mL的 大黄素对照液 ;硅胶 G薄层板,正己烷 -醋酸乙酯 -甲酸 （ 6,2,0.1）为展开剂,测定波长 445nm，参比波长 700nm104二 )薄层色谱法薄层色谱法主要用于分离测定 单体蒽醌类化合物 。蒽醌类化合物的薄层色谱条件和显色方法可参考定性分析部分 。(三 )高效液相色谱法高效液相色谱法也主要用于分离 单体蒽醌类化合物 。105例 三黄片中大黄素和大黄酚的含量测定 （ HPLC）组成,大黄、盐酸小檗碱、黄芩浸膏色谱条件与系统适用性试验,C18； 甲醇 -0.1％磷酸溶液 （ 85,15）为流动相；检测波长 254nm；0.01mg/mL大黄素 的无水乙醇 -醋酸乙酯（ 2,1）液；0.025mg/mL大黄酚 的无水乙醇 -醋酸乙酯（ 2,1）液。106供试溶液,取本品 20片，除包衣，称重，研细，精称一片重，置锥形瓶中，精密加 乙醇 25mL，密塞，称定重量，水浴回流 1h，放冷，加乙醇补足减失的重量，滤过，精密量取续滤液 10mL，置烧瓶中，水浴蒸干，加 30％ 乙醇 -盐酸 （ 10：1）溶液 15mL，置水浴中加热水解 1h，立即冷却，用氯仿强力振摇提取 4次，每次 15mL，合并 氯仿 液，置水浴上蒸干，残渣用无水乙醇 -醋酸乙酯（ 2,1）溶解，移至 25mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀。用微孔滤膜（ 0.45μ m） 过滤，取续滤液，即得。测定,分别进样，外标法定量。107第五节 挥发性成分分析挥发性成分是指中药中一类具有芳香气并易挥发的成分，其化学组成复杂,主要包括,1.挥发油类 成分； 2.其他 分子量较小、易挥发 的化合物。挥发油为可随水蒸汽蒸馏得到的易流动的 油状液体,具香味和挥发性，其中有些组分的纯品在常压下为固体。中草药 中的挥发油一般在 1%以下，亦有少数达 10%以上，如丁香中含挥发油可高达 14～ 21%。一种挥发油常含有几十种到一、二百种成分，但其中往往以某种或数种成分占较大的量。108O苍术酮OH薄荷醇OH龙脑109一、结构特征及理化性质挥发油中成分按化学结构分类，可分为 萜类 化合物,脂肪族 化合物及 芳香族 化合物。1.主要成分 ―― 单萜、倍半萜及其含氧衍生物其中含氧的衍生物大多 生物活性 较强，并具有芳香气味，如薄荷醇、薄荷酮、樟脑、龙脑、茴香酮、苍术酮2.脂肪族化合物 ―― 正庚烷、正癸烷、辛烯、异戊酸、异戊醛、甲基正壬酮等。3.芳香族化合物 ―― 如苯丙烷类衍生物，多具有 C6-C3骨架，多为苯酚化合物或其酯类，如桂皮醛、茴香脑、丁香酚110理化性质1,物理性状,挥发油在通常情况下为具有特殊而浓烈气味的油状液体，多数比重 小于 1，沸点 70～ 300℃ 之间；且具有强烈的 折光性 ；不溶于水而 易溶于 大多有机溶剂中，在 高浓度的乙醇 中能全部溶解。2.显色反应：酚类成分,加三氯化铁乙醇溶液，可产生蓝色、蓝紫色或绿色反应；羰基化合物,加苯肼或苯肼衍生物、羟胺等试剂，可生成结晶性的衍生物；不饱和化合物,样品中加入溴，红棕色褪去。111例 三妙丸中挥发油成分的鉴别组成,苍术、黄柏、牛膝鉴别,取样品 2g，置具塞试管中，加乙醚 10mL，振摇10分钟，取上清液 2mL，置具塞试管中，加 高锰酸钾试液 2滴，振摇 1分钟，红色即消失。112二、定性鉴别1.化学反应法根据制剂中所含挥发油组分的 结构 的化学性质进行鉴别。萜类成分 －多含有 双键,能与溴、氢卤酸等起加成反应；内酯类 －与 羟胺 反应生成羟肟酸，与三氯化铁呈颜色反应注意,中药复方制剂中成分复杂，干扰因素众多,专属性不强。113例 避瘟散中薄荷脑、冰片的定性鉴别（ TLC)组成,檀香、白芷、零陵香、姜黄、丁香、木香、冰片、薄荷脑等鉴别,取本品 0.5g，置具塞锥形瓶中，加 石油醚 （ 30℃ ～60℃ ） 10mL，振摇数分钟，滤过，滤液低温浓缩至约 2mL，作为供试品溶液。 0.5mg/mL薄荷脑,0.5mg/mL冰片 对照品混合溶液。各点样 10μ L，同一 硅胶 G薄层板,以 环己烷 -醋酸乙酯（ 17,3）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 5％香草醛硫酸溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。1142.薄层色谱法挥发油成分 TLC主要是根据 极性大小 加以分离。挥发油所含各类化合物的 极性顺序 为：烃（萜）＜醚＜酯＜醛、酮＜醇、酚＜酸可试用不同极性的展开剂在硅胶、氧化铝薄层上将各类化合物相互分开。最常用展开剂 －正己烷、石油醚，适于分离 极性小 的成分（不含氧的烃类成分）；石油醚或正己烷中加少量 醋酸乙酯 （或苯），增大极性后，则可用于分离 极性大 的成分（含氧化合物）；也可使用其他展开剂－如苯、乙醚、四氯化碳、氯仿、醋酸乙酯以及不同比例的混合展开剂。1153.气相色谱法（ 1）常用 对照品对照法 进行定性鉴别，即在相同的色谱条件下测定供试品与对照品的保留时间，以确定某组分的存在与否；（ 2）可采用 加大峰面积 的方法作为对已知化合物的鉴别；一般应在 2种以上不同极性色谱柱上进行比较，结果才较可靠。（ 3）对于原料药材、注射剂的鉴别还可采用 GC-MS联用,GC-FTIR联用分析。116三、含量测定含量测定包括 总挥发油 和 单一成分 的测定总挥发油测定,采用 挥发油测定器,用 蒸馏法 测定，可分别测定相对密度在 1.0以下和 1.0以上的挥发油含量。 （按药典附录方法）单一成分测定,首选 气相色谱法其次 HPLC,TLCS,GC-MS关键是 分离,色谱法 是挥发油成分分析的主要方法117例 冠心苏合丸中冰片的含量测定（ GC）（ 挥发性成分）组成,苏合香、冰片、乳香、檀香、青木香色谱条件,以 聚乙二醇 （ PEG)－ 20M为固定相，涂布浓度为 10％；柱温 140℃,理论塔板数按十五烷峰计算应不低于1200。校正因子测定,取 十五烷 适量，用醋酸乙酯溶解并制成每1mL含 7mg的溶液，作为内标溶液。另取 冰片 对照品约 10mg，精密称定，置 5mL量瓶中，精密加入内标溶液 1mL，加醋酸乙酯至刻度，摇匀，进样，计算校正因子。118测定法,取样品细粉适量，精密称定，精密加入等量硅藻土，研匀。精密称取适量置具塞锥形瓶中，精密加入 内标溶液 1mL，与醋酸乙酯 4mL，密塞，振摇使 冰片 溶解，静置，取上清液进样，测定。1191.气相色谱法方法,一般气相色谱闪蒸气相色谱法顶空气相色谱法闪蒸气相色谱法,将样品置闪蒸器内，在一定温度下，挥发性成分气化，被载气带入色谱柱进行分析。顶空气相色谱,在热力学平衡的蒸气相与被分析样品同时存在于一个密闭恒温的样品瓶中，测定恒温后样品瓶蒸气相中挥发性成分的含量。120固定液,聚乙二醇类、聚酯类、硅氧烷类和阿皮松类等，大多采用 极性 固定液单萜,极性固定液倍半萜,极性、非极性固定液含氧萜类衍生物,如含醇、醛、酮、酯等挥发油类成分，极性固定液 聚乙二醇和聚酯类分离效果较好121色谱柱,石英毛细管柱检测器,氢火焰离子化检测器（ FID）定量方法：（ 1）测定已知成分，含量较高且分离度好，多用 内标法（ 2）有未知成分,不加校正因子的归一化法（ 3）外标法 准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响较大122供试品前处理原料药材,粉碎后，直接水蒸气蒸馏，所得挥发油用乙醚、石油醚提取制剂,有机溶剂提取1232.高效液相色谱法挥发性成分有些具有紫外吸收，如芳香族化合物类（桂皮醛、丹皮酚、丁香酚、茴香脑等），可用高效液相色谱法进行测定。3.薄层扫描法主要用于定性分析，定量较少。挥发油成分复杂，薄层分离困难，往往很难达到定量要求，仅用于主要成分含量高的挥发油的制剂分析；再者大多挥发油成分都需显色后才可测定，操作复杂，引入误差机会较多。124例 香砂养胃丸中厚朴酚的含量测定（ HPLC）（单体木脂素）组成,木香、砂仁、白术、陈皮、茯苓、半夏、香附（醋制）、枳实、豆蔻、厚朴（姜制）、广藿香、甘草C18柱 ； 乙腈 -水 -冰醋酸 （ 60,38,2）为流动相，检测波长 294nm。理论塔板数按厚朴酚峰计算应不低于 1500.0.1mg/mL厚朴酚 甲醇液对照品；供试品制备：精密称取 5g，加 石油醚 （ 30℃ ～ 60 ℃ ）,索氏提取 2h，取提取液，挥干，残渣用甲醇溶解至 50mL量瓶，定容，过滤，取续滤液，分别进样，测定。125例 大山楂丸中总酸性成分的含量测定（ 非水滴定法 ）（有机酸）组成,山楂、神曲、麦芽等供试品制备,称取 120℃ 干燥 2h以上的大山楂丸 7g，至索氏提取器内，用 100mL甲醇于 90 ℃ 水浴上提取 1.5h，回收甲醇至剩余体积约为 30mL，将其移入 50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得。精密吸取供试品溶液 25mL，置 100mL小烧杯中，用0.1moL/L甲醇钠 -甲醇 -苯液滴定。用 电位法 指示终点。被薄层取代（熊果酸）126END
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