& 【求助】蛋白质透析除咪唑大量沉淀
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
【求助】蛋白质透析除咪唑大量沉淀
UID 114506
信誉分 100
可用分 1064
阅读权限 255
注册 状态 离线
【求助】蛋白质透析除咪唑大量沉淀
目前我在表达一个26k左右的蛋白，pET32a载体，可溶性表达，带有Trx标签，500mM咪唑，20mM磷酸盐，PH 7.4洗脱，因为要做EK酶切，打算把体系置换为磷酸盐缓冲体系，然后过SP去除标签，可透析后出现大量沉淀，纯化下来的蛋白质浓度大概在2mg左右，但为了保证EK酶切的效率，就没有稀释。请问这种情况该如何处理？EK酶切在有咪唑存在的情况下是否可行？另外EK酶切的温度一般在多少为好?我用的推荐使用22度16小时，但对我的蛋白效果一般，请问37度对蛋白影响怎么样？
有点长，谢谢耐心看完，寻求帮助！
信誉分 100
可用分 5132
阅读权限 255
注册 状态 离线
1、酶切条件：20mM Tris pH8.0,35-37度，16小时，做酶切梯度，找出最佳酶量。
2、咪唑对EK活性有影响，应该去除。透析沉淀情况不明，可能和pH有关，可以考虑提高pH。
3、酶切是融合蛋白不用做稀释，我用20-30mg/ml的浓度也一样切。
4、市场上的EK有两种，一种是E.Coli.表达，活性低；一种是酵母表达，活性高。
5、37度对蛋白有没有影响是无法事先判读的，做一次看看不就可以了吗。
6、除酶切后的标签蛋白，可以考虑再用一次Ni柱。
UID 114506
信誉分 100
可用分 1064
阅读权限 255
注册 状态 离线
解答太详细了，多谢！透析我尝试了几个PH值，9.0,8.0,7.4，都不行，蛋白理论等电点是8.8,应该用多大PH。
另外盐浓度对EK酶切有影响没？谢谢！
信誉分 100
可用分 5132
阅读权限 255
注册 状态 离线
可溶上清表达，Ni柱纯化后透析去除咪唑产生大量沉淀，这在我的经验中从来没有遇到过。能否把整个试验流程的缓冲体系讲一讲，看看怎么回事。
盐浓度都酶切有影响，高浓度盐抑制EK活性。
UID 114506
信誉分 100
可用分 1064
阅读权限 255
注册 状态 离线
载体，pET32a，1mM IPTG诱导，超声破菌后离心保留上清（电泳验证目的蛋白在此）。上样buffer：20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，平衡镍柱，20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，20mM 咪唑洗脱杂蛋白，20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，500mM 咪唑洗脱目的蛋白，也尝试过不加NaCl的。
透析液：1、50mM tris， PH 8.0,9.0,7.4
2、20mM NaH2PO4 PH 8.0,9.0,7.4
都出现沉淀。蛋白等电点大概在8.8左右，还有要提的一点是，洗脱蛋白-20度冷冻保存复溶后也产生沉淀。洗脱蛋白浓度大概在2-3mg/ml，尝试过稀释到1mg/ml左右，也有沉淀。
请帮我分析一下。另外我看园子里有用“万金油”进行蛋白透析复性的，不知道用在我这上面是否可以啊？
UID 114506
信誉分 100
可用分 1064
阅读权限 255
注册 状态 离线
原帖由 nn255 于
15:56 发表
可溶上清表达，Ni柱纯化后透析去除咪唑产生大量沉淀，这在我的经验中从来没有遇到过。能否把整个试验流程的缓冲体系讲一讲，看看怎么回事。
盐浓度都酶切有影响，高浓度盐抑制EK活性。 ... 刚刚再次拜读了您之前发的帖子，发现我目前这个蛋白和你所纯化的蛋白A比较类似，我是否可以用类似的方法呢？另外就是我不知道我这个蛋白的可溶性怎么样，如果镍柱纯化下来以后脱盐置换缓冲体系，是否会沉淀在柱子上呢？
信誉分 100
可用分 5132
阅读权限 255
注册 状态 离线
1、超声破菌buffer同上样buffer？pH？
2、20mM NaH2PO4，0.5M NaCl，500mM 咪唑 这个溶液检测过pH没有？
如果回答都是yes的话，我也不知道沉淀的原因。
万金油中含有EDTA，对EK有抑制。
如果透析有沉淀，那么G25换液也很有可能沉淀。
[ 本帖最后由 nn255 于
16:02 编辑 ]
UID 114506
信誉分 100
可用分 1064
阅读权限 255
注册 状态 离线
回答都是yes,PH值都是7.4，是不是就是我这个蛋白本身的溶解度的问题啊？或者说浓度太高了的原因？今天我配了点万金油，还是有沉淀，不过感觉是少了一点，明早再看看，测一下浓度再说。还有一个问题就是，我把万金油是放在透析袋的里面，最后的体系是不是就和我设置的体系一样了啊，里面的成分都可以透析掉吧？
信誉分 106
可用分 4311
阅读权限 255
注册 状态 离线
蛋白在等电点的溶解度是最低的，你的是8.8，不适合用9和8吧，大概再低一些，另外你的蛋白本身是可溶还是膜蛋白，离子强度由500mM突然降到0，会对结构有很大影响的
信誉分 100
可用分 4782
阅读权限 255
注册 状态 离线
你纯化的buffer中都有0.5M NaCl，但透析溶液里就只有20mM NaH2PO4？可能是离子强度不够蛋白沉淀了。试一下透析buffer中加入0.1％Triton X-100或者甘油，并且提高NaCl浓度。或者你可以在Ni柱上切啊，这样连咪唑洗脱都不用了。[请教]蛋白质透析为何会出现絮状沉淀！？
11:31:24&&&来源：&&&评论：&&
[[请教]蛋白质透析为何会出现絮状沉淀！？] 我的蛋白用PBS（PH7.4)透析两天就出现很严重的沉淀,不知道为什么,有人建议我用TE(PH8.0)透析,这可行吗? 关键词:[透析 蛋白质 絮状沉淀]…
我的蛋白用PBS（PH7.4)透析两天就出现很严重的沉淀,不知道为什么,有人建议我用TE(PH8.0)透析,这可行吗?
出现絮状沉淀是很正常的现象，因为透析本身就是一个复性的过程，那么出现絮状的沉淀就是一些不能够复性成为天然结构的一些目的蛋白和一些杂蛋白，而这些都是我们所不需要的。所以说出现絮状沉淀是正常的也是我们希望看到的。至于出现沉淀的原因不外乎条件变化太剧烈了，建议不要让透析的条件变化太剧烈了，主要是PH的浓度的变化和样品中一些其他东西如尿素的浓度变化。如果楼主透析样品中出现太多的沉淀，甚至于跑胶中基本没有带了，那么建议楼主换一种透析液来用，如用TGE也就是传说中的万金油来试试，我一直用的是这种透析液，效果很不错。TGE配法如下：50mM Tris0.5mM EDTA50mM Nacl5%或10％甘油如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。
我用万金油buffer效果很不错，甘油很有用的哦
我有问题要问,那沉淀的蛋白如何处理呢?还用尿素溶么?蛋白经过这么一番折腾还有活性么?
我就扔掉了，呵呵再作我也不知道那样还能不能用活性就更难说了
蛋白本来就不多，再扔调的话还有蛋白么？我要拿来做单抗的，这怎么办呢？
to 楼上的：沉淀没什么可惜的，也没有什么价值了。因为透析本身是个复性的过程，而且我们要的就是那些透析后可溶的蛋白质，因为只有这些蛋白质才更接近天然构象，这样做起单抗来才更有成功的希望，才更有价值嘛。你是怕可溶性的蛋白不够你用是吧？我觉得这不太可能，因为你的蛋白的表达量不会小到这种程度吧？而且透析之后你可以用PEG包埋来浓缩蛋白，毕竟做单抗的免疫量只需要50ug/只，50ug基本上所有的重组蛋白都能达到这个水平的，所以不要担心。再说了，行不行的你也要做了之后才知道啊，做了之后如果不行再想别的办法呗。祝好！
谢谢“艳过刘痕“, 我 以前的沉淀是由于透析时没加尿素才导致沉淀的，后来我就用8M尿素重新融解蛋白沉淀，然后再在PBS缓冲液中依次加入6M，4M,2M尿素透析，接下来我还要蛋白酶切的，试试看吧！我怕蛋白不够，因为以后做单抗时用于包被的蛋白必须要多量，所以看到沉淀我心痛啊 ！
沉淀可以拿来重溶，在透析的．我做的干扰素可以重复透析一次，活性与第一次接近．不过看具体的蛋白吧，试试吧
要做单抗啊？多抗用5微克蛋白就可以了呢
我也遇到过透析沉淀的情况，因为那时是刚接触蛋白质方面，老是搞不懂什么原因。当时也将沉淀后的蛋白（因为我做的是酶）测了酶活，结果一点活性都没有。就把沉淀了的蛋白都丢了。后来折腾了好久，才发现我用的Tris已过期。真气人，从学校设备科才领的药品居然是过期的。换了药品后就没有出现沉淀现象。你也检查一下你的药品是否有问题。祝实验顺利！
沉淀是正常的现象，可能是你的蛋白含量过高的原因，也可能是在透析的过程中聚合成大分子的蛋白，一般弃去沉淀不会影响你的实验的，如果蛋白浓度不够可以浓缩，但沉淀的蛋白效果很难保证。做单抗免疫小鼠浓度在1mg/ml左右就可以了，100ul加100ul，混匀后免疫即可！
请问艳过刘痕，你说的万金油透析液的PH是多少，8.0吗？还有，如果用尿素溶的话，透析液里是否还需加尿素（梯度，逐渐降低）
PBS有一个特别的功能常常被忽视，那就是它也是一种蛋白沉淀剂，做蛋白质结晶时常常用到它（可参考《蛋白质技术手册》汪家政，范明 主编2000年8月第一版第十三章）。楼主出现的沉淀分明是析出的蛋白质，一般不会是变性蛋白。为了证明不是变性蛋白，楼主可以改用低透析，如果沉淀消失，那就恭喜你了。从楼主目前情况看，肯定是要换透析液了。
请问艳过刘痕，你说的万金油透析液的PH是多少，8.0吗？还有，如果用尿素溶的话，透析液里是否还需加尿素（梯度，逐渐降低）我用的万金油的PH当时调的是7.9的，但是7.4的和8.0的我都用过，效果没什么区别的。用尿素溶的时候最好是用梯度，因为条件变化太剧烈的话如前所述，会很容易产生沉淀的。另建议每次透析的时候最好用新的透析带（100块买5米，不贵的），即使是用旧的透析带，也最好是用经典的处理液处理好，要不然就会影响透析效果（亲身体会过）。
谢谢楼上的各位的帮忙,因为我上次也做过这个蛋白的表达(夏天时做的),用PBS透析没有出现絮状沉淀,同时跑PAGE也只有一条目的带,不知为什么这次用PBS透析却出现沉淀,实验室的同事建议用TE透析,我重新提了一次蛋白再用TE透析,虽然没有出现沉淀,但是跑PAGE却出现多条带(包括目的带)(注:实验室条件有限,没有用过柱的方法,而是用SKL,及还原型氧化型谷胱甘肽处理),实验又陷入了僵局,.我该如何改进我的实验方案?
艳过刘痕,你能告诉我你提蛋白的步骤吗,(我提的是包涵体),谢谢.对出现沉淀的蛋白我应该如何处理,如果离心去沉淀,对转速和时间有没有要求??
艳过刘痕,你能告诉我你提蛋白的步骤吗,(我提的是包涵体),谢谢.对出现沉淀的蛋白我应该如何处理,如果离心去沉淀,对转速和时间有没有要求??这个问题回答起来就比较多了，我简单的给你说一下吧。1、重组菌与培养基按1：100的比例摇大约六七个小时，总之是达到OD值6002、加入IPTG至终浓度为1M，继续摇4小时左右。3、离心（12000/15min)取沉淀，称量湿菌体重量，每克湿菌体加8mlPBS，剧烈振荡混匀。4、反复冻融（－80度60min/37度10min）5、超声裂菌120次（10s/10s)6、离心(15000/15min)取沉淀加入溶液1洗涤后置冰上40min，离心(15000/15min)取沉淀。7、加入溶液2洗涤后置冰上40min，离心(15000/15min)取沉淀。8、加入溶解液，并加入DTT至终浓度为0.05M左右。9、4度放置过夜。10、离心（16000/15min）后取上清，或过柱纯化或直接应用。各段取样品跑PAGE胶看结果。我不太赞成沉淀重新处理，因为蛋白经过的程序越少就越好。一定要处理就用8M的尿素重新溶解就行了。大概是这样，希望对你有帮助。
呀，这里好多复性高手哟，我遇到一个问题就是：为什么在透析过程中蛋白会被降解了各位高手有什么办法吗．．复性都做了好久了，就是解决不了呀可以交流吗
哦，还有个问题，我用盐酸胍容的　，，．我看资料上说他一般是在１.５Ｍ时复性完全，，，为什么我已经将其浓度将到１.５Ｍ一下后再用不含盐酸胍的ＰＢＳ做终透析还会沉淀．．　另外，出现沉淀一般都是在盐酸胍浓度为１.５－－２Ｍ时，，好象怎么缓慢降低其盐浓度都会沉淀，，，如何可以避免呢急盼各位老师的回复谢谢！！！！！！
透析沉淀是一个大问题，问题在于往往是大量沉淀，余下可溶的几乎没有了。现在我只能放弃透析，改用最原始最简单的稀释复性法了，希望有高手全面解答一下透析沉淀的问题
溶液1溶液2溶解液怎么配啊
艳过刘痕,溶液1,溶液2,溶解液怎么配啊 ?谢谢
艳过刘痕,溶液1,溶液2,溶解液怎么配啊 ?谢谢洗涤液1：60mM 4%Triton X-1001.5MNaclPH7.0洗涤液2：0.1MTris-cl20mM 2M UreaPH7.0包涵体溶解液：0.1M Tris-cl8MUrea5mM PH8.0
感谢艳过刘痕朋友的积极参与！
呀，这里好多复性高手哟，我遇到一个问题就是：为什么在透析过程中蛋白会被降解了各位高手有什么办法吗．．复性都做了好久了，就是解决不了呀可以交流吗 哦，还有个问题，我用盐酸胍容的　，，．我看资料上说他一般是在１.５Ｍ时复性完全，，，为什么我已经将其浓度将到１.５Ｍ一下后再用不含盐酸胍的ＰＢＳ做终透析还会沉淀．．　另外，出现沉淀一般都是在盐酸胍浓度为１.５－－２Ｍ时，，好象怎么缓慢降低其盐浓度都会沉淀，，，如何可以避免呢急盼各位老师的回复谢谢！！！！！！ 怎么没有回话呀，，，我很着急呀
可能沉淀是不可避免的，但只要溶液中有你的蛋白不就行了
艳过刘痕xsvulture这次我用万金油透析在１Ｍ盐酸胍稳定了４小时都没有沉淀，然后再透析到１.５Ｍ时又大量沉了，，是为什么呢怎么解决呀，，，急呀！！！！！！！（我也是做干扰素）
艳过刘痕xsvulture这次我用万金油透析在１Ｍ盐酸胍稳定了４小时都没有沉淀，然后再透析到１.５Ｍ时又大量沉了，，是为什么呢怎么解决呀，，，急呀！！！！！！！（我也是做干扰素）复性的概念：通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂使二硫键正常形成。透析是简易的复性过程，对于尿素而言，在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M 左右时结束。对于盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经结束。所以我不是很明白为什么朋友是从低浓度往高浓度透析呢？透析出现少量沉淀是正常的，如果没有沉淀你才应该更担心呢。如果出现大量的沉淀则可能是由于复性液浓度和PH值变化过烈，其他条件变化过快。透析时应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法，此外透析时条件要温和，使蛋白质能够正确折叠。
艳过刘痕 ：哦，，sorry,,,打错了，是透析在１Ｍ盐酸胍稳定了４小时都没有沉淀，然后再透析到０.５Ｍ时又大量沉了透析出现少量沉淀是正常的，如果没有沉淀你才应该更担心呢这是为什么呢，，是怀疑被降解了吗感谢回复
甘油该没有起还原剂的作用把
艳过刘痕 ：哦，，sorry,,,打错了，是透析在１Ｍ盐酸胍稳定了４小时都没有沉淀，然后再透析到０.５Ｍ时又大量沉了透析出现少量沉淀是正常的，如果没有沉淀你才应该更担心呢这是为什么呢，，是怀疑被降解了吗感谢回复怀疑降解是一个方面，另一个方面就是如果没有沉淀的话，就是说你的蛋白全是可溶的了，这好像不太可能。所以我看到有经验的人说，如果透析时没有出现沉淀的话就说明透析的效果不太好。至于为什么再1M的时候没有出现沉淀，而在0.5M的时候出现，我想大概就是由于只有在一定的条件下，蛋白才沉淀，这个一定的条件，大概就是0.5M吧，呵呵。完全是自己的理解，希望对你有点帮助。
谢谢　　艳过刘痕 ：还有甘油在这里起什么作用呢
谢谢　　艳过刘痕 ：还有甘油在这里起什么作用呢甘油的作用很简单的，你还记得在菌株保种的时候加过甘油吗？其实这里面加甘油的目的可能就是为了透析后样品能长时间的保存而已。其实万金油不一定就是只能加5％的甘油的，我有几次都是加的30％，之后样品放－60度冰箱中可以保存好长时间。甘油没有还原的作用，万金油中起还原作用的是有条件是加入的还原型的谷胱甘肽，呵呵。
艳过刘痕高手就是高手，，，还有几个问题请教，，１.为什么ＰＢＳ和ＴＥ作复性是对复性有那么大的影响，，我用ＰＢＳ时几乎没有可容蛋白，，而换了万金油后可容性很好．．这和他门的化学性质到底有什么关系呢，，如果要讨论这个问题　应从那些方面考虑，，有那些资料可以参考吗？２.甘油的问题．甘油含有－ＯＨ基．在通常的反应中应表现为还原性，，如果他仅在保存时起缓冲作用的话，那么为什么在不加它时，容易沉淀的多．３.关于谷胱甘肽的问题．我门都认为氧化型谷胱甘肽起氧化二硫键的作用，而还原型的作用好象是对氧化型谷胱甘肽的氧化作用起平衡作用，然而，还原型氧化型谷胱甘肽溶液是及不稳定的易被氧化成氧化型的．．那，是什么使还原型氧化型谷胱甘肽被氧化呢，，应该是氧．由此推论，，氧使还原型氧化型谷胱甘肽被氧化．氧化型谷胱甘肽起氧化二硫键，还原型平衡氧化型谷胱甘肽的氧化平作用．还原型氧化型谷胱被氧化成氧化型后．会加剧对二硫键的氧化作用，，对氧化－还原谷胱甘肽对而言这似乎有点矛盾．．另外，，既然溶液中有能使还原型谷胱甘肽氧化成氧化型谷胱甘肽的物质，，按氧化还原规律那么就应该有比氧化型谷胱甘肽更强氧化能力的物质，，换句话说，，有比氧化型谷胱甘肽更易氧化二流键形成的物质，，从这个意义上讲　，用昂贵的氧化型谷胱甘肽似乎有点说不过去．．以上为笨鸟一时说想，，也不知道是否正确．．希望各位高手指点．．谢谢！！！！！！！！
将本文分享到下面的网站：
相关热词搜索：
[[请教]蛋白质透析为何会出现絮状沉淀！？]延伸阅读：
频道总排行
频道本月排行我蛋白透析复性时出现了大量白色沉淀，我用6M，4M，2M，1M，0M尿素的PBS缓冲液梯度复性，1M时出现沉淀。_百度知道
我蛋白透析复性时出现了大量白色沉淀，我用6M，4M，2M，1M，0M尿素的PBS缓冲液梯度复性，1M时出现沉淀。
请问会影响实验结果吗，我做的是酶，会有酶活吗？
我有更好的答案
缓冲液的pH多少？
蛋白的pI多少？
其他类似问题
为您推荐：
等待您来回答
下载知道APP
随时随地咨询
出门在外也不愁