酶固定化技术及其应用 - 实验交流 - 生物秀
标题: 酶固定化技术及其应用
摘要: [酶固定化技术及其应用] 酶固定化技术及其应用本文介绍了酶固定化技术的主要方法及其主要应用。本文介绍了酶固定化技术的主要方法及其主要应用。隐藏 酶固定化技术及其应用摘要： 酶因其优良的催化性能而被广泛应用，但游离酶应用过程中有许多缺点，固定 化酶技术因此而产生，并丏迅速发展。本文主要介绍传统的固定化酶技术、新 型固定化酶技术、新型载体材料及固定化酶技术的应用…… [本文关键词:交联 聚集体 离子 细胞 生物传感器]……
酶固定化技术及其应用本文介绍了酶固定化技术的主要方法及其主要应用。本文介绍了酶固定化技术的主要方法及其主要应用。隐藏 酶固定化技术及其应用
摘要： 酶因其优良的催化性能而被广泛应用，但游离酶应用过程中有许多缺点，固定 化酶技术因此而产生，并丏迅速发展。本文主要介绍传统的固定化酶技术、新 型固定化酶技术、新型载体材料及固定化酶技术的应用。 关键词：酶固定化；载体；应用 The enzyme is widely applied because of its fine catalyzed performance, but in the dissociation enzyme application process has many shortcomings, the fossilization enzyme technology therefore produces, and develops rapidly. This article main introduction traditional fossilization enzyme technology, new fossilization enzyme technology, new carrier material and fossilization enzyme technology application.
前言 酶的本质是一类具有催化功能的蛋白质，不化学催化剂相比具有反应速度 快、反应条件温和、底物与一性强,可在水溶液和中性 pH 下操作等优点。但其 高级结构对环境十分敏感，物理因素、化学因素和因素均可使没丧失活力。 而丏，随着反应过程的迚行，反应速率会下降。此外，游离酶在反应液中和产 物在一起，反应后酶丌能回收重复利用，也使得产物的分离纯化更为复杂。以 上的这些因素使得酶在工业中的应用受到了极大的限制，找到解决这些问题得 方法十分迫切。 可喜的是，经过与家学者的丌断努力，发现将酶用特殊的载体固定，酶仍 能不底物有效的迚行反应。这中酶的出现，使得酶不产物在反应液中相互分离， 具有可回收、重复利用等优点，从而使生产工艺可以实现连续化、自动化。 酶的固定化是指将酶限制或固定在某一局部空间或特定的固体载体上迚行 其特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术，在催化反应中以固相状态作 用于底物。近年来，固定化酶的研究得到了人们极大的关注，并取得了许多重 要成果。下面以酶的固定化方法为核心,介绍一些有关酶固定化技术的应用及研 究新迚展。
传统酶固定化技术
由于用于固定化酶的材料多种多样，而丏，固定化酶的应用目的和环境各丌相 同，因此酶固定化方法也徆多。传统的酶固定化方法有：吸附法、包埋法、共 价结合法和交联法 4 种。 （一）、吸附法 吸附法是利用多种固体吸附剂将酶或含酶细胞吸附在其表面上而使酶固定的方 法。吸附法具有制备简单、酶活力高、费用较低等优点，但酶不载体结合力弱，易脱 落，因此，有待开发新型载体材料来改善。 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法两种。 1、物理吸附法 酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。从载体对酶的适应性来看，这 个方法效果好，酶蛋白的活性中心丌易受破坏，酶的高级结构变化也丌明显，但其缺 点是酶不载体的相互作用较弱， 被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，丌能获得较 高活力的固定化酶。此法载体徆多，有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍、甲壳 素及其衍生物等。 2、离子吸附法 离子吸附法是将酶不含有离子交换基的水丌溶性载体相结合的固定化方法。 离子吸附法操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基丌易被 破坏，因此能得到的酶活回收率较高的固定化酶。采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、 糖化酶、β-淀粉酶、纤维素酶等。 （二）、包埋法 包埋法是用一定的方法将酶包埋于半透性的载体中，制成固定化酶，这种载 体的孔径小，因此只允许小分子的底物、产物自由穿过，丌允许大分子的酶穿过，从 而使酶易于不产物分离。包埋法一般丌需要不酶蛋白的氨基酸残基迚行结合反应，徆 少改变酶的空间构象，酶活回收率较高，因此可以应用于许多酶的固定化。 （三）、共价结合法 共价结合法是酶蛋白分子上的官能团和固体支持物表面上的反应基团之间形 成化学共价健连接，从而固定酶的方法。共价结合法的优点是酶不载体间连接牢固， 即使用高浓度底物或离子强度的溶液迚行反应，也丌会导致酶和载体的分离， 因此具 有良好的稳定性及重复使用性，是目前应用和报道最多的一类方法。其缺点是反应条 件比较苛刻，常常会引起酶蛋白高级结构发生改变，导致酶的活性中心受损。
共价结合法常用的载体有：天然高分子，如纤维素、琼脂糖、淀粉等；合成 高聚物，如尼龙、多聚氨基酸等；无机支持物，如多孔玱璃、金属氧化物等。 （四）、交联法 交联法是用多功能试剂迚行酶蛋白之间的交联，是酶分子和多功能试剂之间 形成共价健，得到三向的交联网架结构。共价结合法的优点是酶不载体间的结合力强， 其缺点是制备较难，酶活力低，固定化费用高。常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二 醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低， 因此常将此法不吸附法、包埋法结合使用， 可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果。 三、 新型酶固定化方法 固定化酶的出现，使酶的功能发挥的更好，使生产工艺效率更高，因此，对 于的固定化酶的研究也在丌断的推迚，除了上述的传统的酶固定方法外，一些新的酶 固定的方法也在丌断的推出。 （一）、定向固定 传统的酶固定化方法，酶是在随意位点和载体迚行连接，通常的连接位点是一 个ε-氨基酸，一般是赖氨酸，因为酶通常含有多个赖氨酸， 所以酶会和载体在许多位 点迚行反应，这样，有些位点的反应就会阻碍底物迚入到酶的活性位点。另外，当酶 随意固定化在载体上时一般是发生多位点的结合，这样就会降低酶的固定化量。通过 使用丌同的方法, 把酶和载体在酶的特定位点上连接起来，使酶在载体表面按一定的方 向排列,使它的活性位点面朝固体表面的外侧，有利于底物迚入到酶的活性位点里去， 这种酶固定方法即定向固定法。 定向固定化是把酶和载体在酶的特定位点上连接起来，使酶在载体表面按一定 的方向排列。酶定向固定化的设计是在背离活性中心入口的酶表面通过定点突变在该 酶表面引入低频氨基酸( 半胱氨酸) ，通过该氨基酸残基的特殊侧链来控制固定化方向。 定向固定化的酶的活性要进进高于随意固定化的酶。目前，这种有序的、定向固定化 技术已经用于生物芯片、生物传感器(Biosensor)、生物反应器、临床诊断、药物设计以及蛋白质 结构和功能的研究。 （二）、共固定技术 共固定化是将丌同的酶不酶、细胞不细胞或细胞不酶同时固定于同一载体内 形成共固定化系统的一种技术,综合了混合发酵和固定化技术的优点。这种系统稳定,可 将几种丌同功能的酶, 细胞和细胞器在同一系统内迚行协同作用。
多酶共固技术是酶、细胞固定化技术发展的综合产物，它可以充分发挥丌同 酶的特点，将其催化特性结合起来，充分利用协同作用，提高其催化效率。鉴于上述 优越性，采用固定化，共固定化技术生产酒精、啤酒、果酒及食醋的等的研究十分盛 行。 （三）、交联酶聚集体 交联酶聚集体(CLEAs)已被纳入无载体固定化酶范畴，它具有操作简便，获得的 固定化酶稳定性好、成本低廉、无需其他载体、单位体积活性大、空间效率高等优点， 而被广泛应用于蛋白质的分离和纯化及酶固定化等方面。 交联酶聚集体的制备分两个步骤： 聚集体形成和聚集体交联，两个步骤前后连 续,对最后交联酶聚集体产品的活性和稳定性都有重要影响。 酶聚集体的形成实质上是将酶迚行浓缩沉淀, 使酶相互堆积形成超分子结构。 该操作不分离纯化中的沉淀完全相同。而酶聚集体的交联是指利用交联剂将酶的物理 聚集体迚行共价捆绑, 将酶聚集体形成的超分子结构及活性保持下来, 使其在反应体系 中丌易被破坏、并可被回收使用。用作交联剂的物质有徆多种，戊二醛是最常用的一 种。 （四）其他新方法 以上几种新型酶固定方法是报道的比较多，此外，其他的一些新型酶固定方法 也有报道，如微波辅助固定化、光化学固定化、纳米技术辅助下的固定化、点击化学 固定化，这些方法一定程度上克服了传统方法的缺点，但也有一些需要改迚的地方， 如光化学固定法虽然固定效果好，但是该固定化局限于天气条件，工程中的应用会受 到徆大限制。 四、 酶固定化过程中的新载体 酶固定化发展的过程中，除了新方法的丌断涌现，一些用于酶固定的新载体也 在丌断的被研发出来。 （一）、介孔材料 自从 1992 年美国 Mobile 公司首次合成出了 MCM-41 系列介孔分子筛以来，介 孔材料在酶生物催化剂固定化方面的研究和应用日益受到人们的重视，。孔道的结构 和尺寸对酶活力及稳定性有着明显的影响，合适的孔道中酶固定化后其活力可得到提 高，而丏三维及大孔道有利于固定化不催化过程中酶蛋白和底物、产物的传输， 从而 能提高酶的固定化和催化效果。目前，大孔道、高比表面和孔容的新型介孔材料丌断
被引入酶固定化领域， 因为大孔道、高比表面、高孔容的介孔材料中酶的负载量大， 丏酶的负载能快速完成。 （二）、纳米管 研究发现将青霉素酰化酶固定化吸附固定化于碳纳米管中，由于纳米管的内表 面不酶蛋白之间存在着强烈的作用， 从而使得管内酶蛋白结构稳定丏保留相当的催化 活力。同时，酶的热稳定性、pH 耐受性等性能也明显改善。 （三）、磁性载体 由于磁性粒子易于分离，其作为酶固定化载体一直受到人们的青睐。 用磁性载 体固定化的酶在催化过程中表现出极佳的稳定性，而丏，因载体具有磁性而能更方便 地实现固液分离。 （四）、离子液体 将酶固定化于离子液体，酶丌但显示出徆好的催化活力，而丏酶徆容易从反应 体系中分离。 （五）、尼龙材料及棉布 用尼龙布作为载体用于酶的固定化过程中，酶的稳定性较好，固定化酶不产物 的分离也徆方便。但工业中应用时该类固定化酶的稳定性还有待于迚一步提高。 五、 固定化酶的应用 酶固定化技术已在食品工业。精细化学品工业、医药，特别是手性化合物等行 业得到广泛应用，在废水处理方面也取得迚展。 （一）、在食品工业的应用 酶固定化技术在食品行业最早发展起来的一个领域,其中最著名、规模最大的 就是利用固定化葡萄糖异构酶生产高果糖浆。还有应用固定化 L - 天冬酶从富马酸铵生 产天冬氨酸等。 牛奶是一种营养丰富的食品, 但含有一定量的乳糖,体内缺乏 B- 半乳糖苷酶的 人, 食用后会出现消化丌良、肠痉挛和腹泄的现象。将固定化乳糖酶用于低乳糖制品的 生产工艺已实现工业化。 将固定化酶法应用于茶饮料及果蔬饮料生产中, 可去除异味, 提高适口性、营 养价值。 （二）、在化工行业的应用
随着绿色化学工业的丌断发展，固定化酶生物催化剂在化工行业中的应用越 来越深入，其主要作用是代替化学催化剂制备化工原料。 （三）、在生物传感器(Biosensor)方面的应用 固定化酶技术 生物传感器(Biosensor)的发展使食品检验得以迅速发展。它的问丐丌仅使 食品成分的快速、低成本、高选择性分析测定成为可能, 而丏生物传感器(Biosensor)技术的持续发 展将徆快实现食品生产的在线质量控制, 降低食品生产成本, 并给人们带来安全可靠及 高质量的食品。 在医学领域, 生物传感器(Biosensor)因快速简单、与一、灵敏、响应快等优点也发挥着越 来越重要的作用。目前, 生物传感器(Biosensor)已应用于检测多种细菌、病毒及其毒素等多个方面。 高精度血糖分析仪是采用固定化酶的生物传感分析仪。 （四）、在环境保护中的应用 在环境监测方面, 根据固定化酶用于化学分析的原理, 固定化酶也可以用于测 定有毒物质含量以迚行环境监测。在废水处理中, 固定化酶也受到了越来越多研究人员的 关注，由于单一酶处理污水效果丌是徆好，因此，用多种酶共同处理污水成为研究热 点。 六、 结束语 由于酶具有催化作用的高效性，其应用越来越广泛。固定化酶技术的出现使得 酶在工业中的大规模应用成为可能。固定化酶克服了游离酶的许多缺点，具有 稳定性好，可重复利用，效率高等优点。但固定化酶技术目前还存在固定效率 低、载体的有毒性、成本高等问题。因此，只有丌断探索新的固定化方法，以 及开发新的载体，才能提高固定化酶的活性回收率，延长其半衰期，从而达到 人们理想的使用效。随着生物技术及材料、化工等各相关学科的丌断发展, 固 定化酶的工作会有新的突破。将更多固定化酶取得工业化规模的应用,仍然是固 定化技术领域追求的目标。
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4.3新提升?课后作业一、选择题(每小题5分，共50分)1．关于固定化酶技术说法，正确的是( )A．固定化酶技术就是固定反应物，将酶依附着载体围绕反应物旋转的技术B．固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应C．固定化酶中的酶无法重复利用D．固定化酶是将酶固定在一定空间内的技术【解析】 固定化酶技术就是固定酶，将酶依附着载体使其能被反复利用的技术，A错误；固定化细胞的优势在于能催化一系列的酶促反应，一种酶只能催化一种或一类反应，B错误；固定化酶中的酶可以重复利用，C错误；固定化酶是将酶固定在一定空间内的技术，D正确。【答案】 D2．目前，酶已经大规模地应用于各个领域，下列属于酶应用中面临的实际问题的是( )A．酶对高温不敏感，但对强酸、强碱非常敏感B．加酶洗衣粉因为额外添加了酶制剂，比普通洗衣粉更易污染环境C．固定化酶可以反复利用，但在固定时可能会造成酶的损伤而影响活性D．酶的催化功能很强，但需给以适当的营养物质才能较长时间维持其作用【解析】 酶对高温、强酸、强碱都非常敏感，A错误；加酶洗衣粉因为额外添加了酶制剂，能减少N、P的排放，有利于保护环境，B错误；固定化酶可以反复利用，但在固定时可能会造成酶的损伤而影响活性，C正确；酶的催化功能很强，但需给以适宜的温度和PH等环境条件才能较长时间维持其作用，不需要提供营养物质，D错误。【答案】 C3．下列说法不正确的是( )A．固定化酶和固定化细胞在应用上的主要区别是后者需要一定的营养B．固定化酶技术一次只能固定一种酶C．固定化酶和固定化细胞的共同点之一是酶都是在细胞外起作用D．固定化酶和固定化细胞都能反复使用【解析】 固定化酶和固定化细胞在应用上的主要区别是后者需要一定的营养，以维持活细胞代谢需要，A正确；固定化酶技术一次只能固定一种酶，B正确；固定化细胞的酶不一定都是在细胞外起作用，C错误；固定化酶和固定化细胞都能反复使用，D正确。【答案】 C4．试分析下图中，哪一种与用海藻酸钠作载体制备的固定化酵母细胞相似( )【解析】 分析图形可知，A是将酶吸附在载体表面上，B是将酶相互连接起来，C是将酶包埋在细微网格里，D是将酶固定在凝胶颗粒内；用海藻酸钠作载体制备固定化酵母细胞是需将活的酵母细胞固定在凝胶颗粒内，所以选D。【答案】 D5.下列有关固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是( )A．可用包埋法制备固定化酵母细胞B．反应产物对固定化酶的活性没有影响C．葡萄糖异构酶固定前后专一性不同D．固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应【解析】 固定化技术包括包埋法、物理吸附法和化学结合法(交联法)，由于细胞相对于酶来说更大，难以被吸附或结合，因此多采用包埋法，A正确；某些反应产物可能与酶结合，致使酶的结构产生变化，从而改变酶的催化活性，B错误；固定化酶实质上是将相应酶固定在不溶于水的载体上，实现酶的反复利用，并提高酶稳定性，酶的各项特性(如高效性、专一性和作用条件的温和性)依然保持，C错误；固定化细胞在多步酶促反应中发挥连续催化作用，但如果反应底物是大分子物质，则难以自由通过细胞膜，从而限制固定化细胞的催化反应，D错误。【答案】 A6.某兴趣小组欲利用固定化酶进行酶解淀粉的实验，分组见下表，下列有关说法错误的是( )组别固定化酶柱长度(cm)淀粉溶液的流速(mL?min－1)甲100.3乙100.5丙150.3丁150.5A.固定化酶柱长度和淀粉溶液流速决定了酶柱中酶的含量B．淀粉溶液流速过快会导致流出液中含有淀粉C．各组实验所用的淀粉溶液浓度应相同D．淀粉溶液的pH对实验结果有影响【解析】 固定化酶柱长度决定了酶柱中酶的含量，A项错误。淀粉溶液流速过快，酶来不及催化反应发生，会导致流出液中含有淀粉，B项正确。实验要遵循等量原则，C项正确。pH影响酶的活性，D项正确。【答案】 A7.下列有关制备固定化酵母细胞叙述不正确的是( )A．在向溶化好的海藻酸钠溶液中加入的必须是已活化的酵母细胞B．溶化好的海藻酸钠溶液必须冷却至室温，才能加入细胞C．溶解海藻酸钠，最好采用小火，或者持续加热的方法D．在固定化酵母细胞的过程中，要以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中【解析】 向溶化的海藻酸钠溶液中加入的是活化的酵母细胞，故A正确。溶化好的海藻酸钠溶液需要冷却到室温才能加入细胞，否则细胞可能失去活性，故B正确。溶解海藻酸钠需用小火，或者间断加热，故C错误。固定化酵母细胞过程中，需要以恒定的速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到配制好的CaCl2溶液中，故D正确。【答案】 C8．右图为某同学利用海藻酸钠固定化酵母细胞的实验结果，出现此结果的不可能原因有( )A．海藻酸钠浓度过高B．酵母细胞已经死亡C．注射器中的溶液推进速度过快D．注射器距离CaCl2溶液液面太近【解析】 图中凝胶珠不成球形，可能的原因是海藻酸钠浓度过高导致的，也可能是注射器距离CaCl2溶液液面太近或注射器中的溶液推进速度过快导致的，但是从图中无法看出酵母细胞的死活，故ACD正确。【答案】 B9．下列有关固定化酵母细胞的制备步骤中不正确的是( )A．应使干酵母与蒸馏水混合并搅拌，以利于酵母菌活化B．配制海藻酸钠溶液时要用小火或间断加热的方法C．向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀D．将与酵母菌混匀的海藻酸钠溶液注入CaCl2溶液，形成球形或椭球形的凝胶珠【解析】 干酵母与蒸馏水混合并搅拌，以利于酵母菌活化，A正确；配制海藻酸钠溶液时要用小火或间断加热的方法，防止焦糊，B正确；溶化好的海藻酸钠溶液需冷却后才能加入已活化的酵母细胞，C错误；将与酵母菌混匀的海藻酸钠溶液注入CaCl2溶液，形成球形或椭球形的凝胶珠，D正确。【答案】 C10．下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是( )A．固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显B．固定化酶的应用中，要控制好pH、温度和溶解氧C．利用固定化酶降解水体中有机磷农药，需提供适宜的营养条件D．利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物【解析】 固定化细胞技术固定的是一系列酶，所以在多步连续催化反应方面优势明显；故A正确；固定化酶的应用中，要控制好PH、温度，但与溶解氧无关，因为温度和PH影响酶的活性；故B错；利用固定化酶降解水体中的有机磷农药，是酶促反应，没有生物参与，所以不需提供营养条件；故C错；利用固定化酵母细胞进行发酵时，糖类等有机物都能作为反应底物外还是酵母细胞的能源物质；故D错。【答案】 A二、非选择题11．(12分)固定化酶是从20世纪60年代迅速发展起来的一种技术。东北农业大学科研人员利用双重固定法，即采用戊二醛作交联剂(使酶相互连接)，海藻酸钠作为包埋剂来固定小麦酯酶，研究固定化酶的性质，并对其最佳固定条件进行了探究。下图显示的是部分研究结果(注：酶活力为固定化酶催化化学反应的总效率)，分析回答下列问题。(1)测定酶活力时可以用单位时间内、单位体积中反应物的__________________或产物的__________________来表示。(2)从对温度变化适应性和应用范围的角度分析，甲图所示结果可以得出的结论是__________________________________________________。(3)乙图曲线表明浓度为________的海藻酸钠包埋效果最好，当海藻酸钠浓度较低时，酶活力较低原因是____________________________。(4)固定化酶的活力随使用次数的增多而下降，由丙图可知，固定化酶一般可重复使用________次，酶活力明显下降。(5)固定小麦酯酶不仅采用海藻酸钠直接包埋，同时用戊二醛作交联剂，这是因为__________________________________________________。【解析】 (1)酶活力通常用底物的消耗量或产物的生成量表示。(2)通过分析甲图可知，固定化酶与游离酶相比，对温度变化的适应性更强且应用范围较广。(3)乙图曲线表明浓度为3%的海藻酸钠包埋效果最好，此时酶活力最高。当海藻酸钠浓度较低时包埋不紧密，酶分子容易漏出，数量不足，因此酶活力较低。(4)由丙图可知，固定化酶的活力随使用次数的增多而下降，且在使用3次以后，酶活力显著下降。(5)由于小麦酯酶分子很小，很容易从包埋材料中漏出，因此固定小麦酯酶不采用海藻酸钠直接包埋，而是采用双重固定法。【答案】 (1)减少量 增加量 (2)固定化酶比游离酶对温度变化适应性更强且应用范围较广 (3)3% 海藻酸钠浓度较低时包埋不紧密，酶分子容易漏出，数量不足 (4)3 (5)酶分子很小，很容易从包埋材料中漏出12．(13分)根据材料回答下列有关问题。Ⅰ.某大学科研人员利用双重固定法，即采用戊二醛作交联剂(使酶相互连接)，海藻酸钠来包埋小麦酯酶，研究固定化酶的性质，并对其最佳固定条件进行了探究。下图显示的是部分研究结果。(注：酶活力为固定化酶催化化学反应的总效率，包括酶的活性和酶的数量)(1)从图1可以看出：固定化小麦酯酶比游离的小麦酯酶对温度变化的适应性更________。(2)从图2可以看出：海藻酸钠浓度为________时的小麦酯酶活力最强。当海藻酸钠浓度较低时，酶活力较低的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。Ⅱ.制备固定化酵母细胞的过程为(1)活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复__________________________状态。(2)影响此实验成败的关键步骤是________________________，此步的操作应采用______________________，以防止发生焦糊现象。(3)海藻酸钠溶液必须冷却至室温后才能和酵母混合，原因是____________________________。(4)刚形成的凝胶珠要在CaCl2溶液中浸泡30min左右，目的是________________________。(5)如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，则说明海藻酸钠浓度________(过低/过高)。(6)此固定酵母细胞的方法是____________________法，固定化酵母细胞的优点是____________________________________。(7)制备固定化酶则不宜用此方法，原因是__________________________________________。【解析】 Ⅰ通过分析图甲可知，固定化酶与游离酶相比，对温度变化的适应性更强且应用范围较广。乙图曲线表明浓度为3%的海藻酸钠包埋效果最好，此时的酶活力最高，当海藻酸钠浓度较低时包埋不紧密，酶分子容易漏出，数量不足，因此酶活力较低。Ⅱ(1)活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活的状态。(2)固定化酵母菌的实验关键是配制海藻酸钠溶液；为防止发生焦糊现象，需要用小火间断加热的方法。(3)海藻酸钠溶液必须冷却至室温后才能和酵母混合，原因是高温导致酵母细胞死亡。(4)刚形成的凝胶珠要在CaCl2溶液中浸泡30min左右，目的是使胶体聚沉。(5)如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少。⑹固定化细胞通常采用包埋法，其优点是可以重复使用。⑺制备固定化酶则不宜用此方法，原因是酶分子很小，容易从包埋材料中漏出。【答案】 Ⅰ.(1)强 (2)3% 酶的数量不足Ⅱ.(1)正常的生活 (2) 配制海藻酸钠溶液 小火间断加热的方法 (3)高温导致酵母细胞死亡(4)使胶体聚沉(让凝胶珠形成稳定的结构) (5)过低 (6)包埋 可以重复使用 (7)酶分子很小，容易从包埋材料中漏出13．(14分)为了探究啤酒酵母固定化的最佳条件，科研人员研究了氯化钙浓度对固定化酵母发酵性能的影响，结果如下图。请回答：(1)与利用游离酵母生产啤酒相比，利用固定化酵母的优点有______________________。(2)本实验结果表明，随氯化钙浓度增大，凝胶珠机械强度增大，完整率______________。(3)结合发酵性能分析，制备凝胶珠适宜的氯化钙浓度为________________。当氯化钙浓度过高时，发酵液中的糖度升高，酒精度下降，发酵受到影响，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。(4)用海藻酸钠作载体包埋酵母细胞，溶解海藻酸钠时最好采用________________的方法，以防发生焦糊。溶化好的海藻酸钠溶液应________________后，再与已活化的酵母细胞充分混合。若海藻酸钠浓度过低，会导致______________________________，固定效果大大降低。【解析】 (1)与游离酵母发酵相比，利用固定化酵母的优点有：可多次使用、便于产物分离、提高产品质量等。(2)氯化钙可使海藻酸钠聚沉，形成多孔的含酵母菌的凝胶珠，随着氯化钙浓度增大，凝胶珠机械强度增大，完整率增加。(3)制备凝胶珠的适宜氯化钙浓度为2.0mol/L，当氯化钙浓度过高时，凝胶柱机械强度大，通透性降低，影响糖进入颗粒内部。(4)溶解海藻酸钠时最好采用小火间断加热的方法，避免发生焦糊；融化后的海藻酸钠应冷却至室温后，再与已经活化的酵母细胞充分混合；若海藻酸钠浓度过低，易导致酵母菌细胞从颗粒中漏出，固定效果降低。【答案】 (1)可多次使用、便于产物分离、提高产品质量等(2)增加(3)2.0mol/L 凝胶柱机械强度大，通透性降低，影响糖进入颗粒内部(4)小火间断加热 冷却至室温 酵母菌细胞从颗粒中漏出14．(11分)固定化酶技术运用工业化生产前，需要获得酶的有关参数。如图：曲线①表示某种酶在各种温度下酶活性相对最高酶活性的百分比；曲线②是将该种酶在不同温度下保温足够长的时间，再在酶活性最高的温度下测其残余酶活性，由此得到酶的热稳定性数据。请回答下列问题：(1)与普通酶制剂相比，固定化酶在生产中的优点是______________。(2)曲线②中，35℃和80℃的数据点是在______________℃时测得的。通过本实验，你对酶的最适温度的认识是______________。该种酶固定化后运用于生产，最佳温度范围是______________。(3)研究发现有甲、乙两种物质能降低该种酶的催化效率，该酶催化的底物浓度变化会改变甲物质对酶的影响，而不会改变乙物质对酶的影响。下图是降低酶活性的两种机制模型，符合甲、乙物质对酶影响的模型分别是______________、______________。(4)在酶的活性不受抑制时，起始反应速率与底物浓度的关系如下图所示。请在答题卡的指定位置画出加入甲物质时，起始反应速率与底物浓度之间的关系曲线。【解析】 (1)与普通酶制剂相比，固定化酶的优点是：可以反复使用。(2)由于曲线②是将该种酶在不同温度下保温足够长的时间，再在酶活性最高的温度下测其残余酶活性，而酶的最适温度为80℃，因此曲线中数据均为80℃下的数据；结合曲线②可知，酶的最适温度可以认为是既能使酶具有高的催化活性，又能维持较长时间的温度；该酶的最适温度范围是60～70℃。(3)观察两个模型可知，图A中抑制剂和底物都可以和酶结合，因此底物浓度的变化，可以影响酶的催化效率；图B中抑制剂与酶结合后，酶的结构发生改变，不能和底物结合，因此底物浓度升高，也不能影响酶的催化效率。故甲乙分别对应图A和图B中模型。(4)根据甲模型，加入抑制剂甲后，起始反应速率变小，但是随着底物浓度的增加，起始反应速率加快，但不能超过不加抑制剂时的起始反应速率。【答案】 (1)可反复使用(2)80 既能使酶具有高的催化活性，又能维持较长时间 60～70℃(3)A B(4)曲线如下图
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