Western Blot电泳蛋白质外漏问题请教
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[Western Blot电泳蛋白质外漏问题请教] 求助各位高手指点，本人最近蛋白电泳过程中经常出现在蛋白样品刚跑离样品孔还没进入分离胶的时候，样品就漏下来了！如下图所示。在我想的问题都找遍了，比如浓缩胶浓缩时间，玻璃板清洗问题及玻璃板都换新的了，还有试剂都换了一套，还是漏 真不知道还有什么致命因素没有找到，请各位大侠指点！小弟将不胜感激！ 关键词:[分离胶 溶解 裂解液 蒸馏水 浓缩胶 过硫酸胺 丙烯酰胺]…
求助各位高手指点，本人最近蛋白电泳过程中经常出现在蛋白样品刚跑离样品孔还没进入分离胶的时候，样品就漏下来了！如下图所示。在我想的问题都找遍了，比如浓缩胶浓缩时间，玻璃板清洗问题及玻璃板都换新的了，还有都换了一套，还是漏 真不知道还有什么致命因素没有找到，请各位大侠指点！小弟将不胜感激！
回复类似图片
回复会不会是分离胶中的聚丙酰胺没有聚合，蛋白没有孔径进入分离胶，一般30分钟左右分离胶都能聚合，TEMED的量不能太多，只是起加速聚合作用，多的话会使胶变硬，变脆，胶容易裂开，蛋白肯定就跑不进孔径里了。觉得可能还是胶那里出了问题。
/dating/d805.html回复但我都放了不止30min啦 TEMED加的夜不多啊5%的浓缩胶5ml加5μl多么？回复希望大家继续提建议，问题仍没有得到解决:(:(:(回复可以肯定是胶的问题，可能是pH6.8的胶缓冲液出问题了，换新的试试回复这个问题我也遇到过，后来解决了。首先分离胶水封或者异丙醇封得时候不能干，也就是说分离胶和浓缩胶之间的界面不能干，这两个界面很容易有空隙，进入空气一般就会漏孔。再有就是梳子是不是太紧？梳子太紧容易造成拔梳子的时候将浓缩胶带起来，和分离胶分离了有空隙。再有就是玻板是不是新的？新的上面有一层油，要洗干净，否则，胶和板之间容易不紧，造成漏胶。我认为应该没有太大问题，如果是一直使用的试剂。检查一下细节问题吧。回复喔，还有一点，如果你想检查一下漏胶问题，可以现在孔里面单独点loading，让loading跑一会电泳，确定不漏胶再上样品，loading不会影响跑胶的。回复肯定是你液体配制中的问题，这是我的配方，可以参考一下。
1. 试剂配制
1.1.11.0mol/L Tris•HCl
Tris (MW121.14)
溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF
PMSF 0.174g
异丙醇 100ml
溶解后，分装于1.5ml中，-20℃保存。
0.2mol/L NaH2PO4
NaH2PO4（MW119.98） 12g
蒸馏水至 500ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
0.2mol/LNa2HPO4
Na2HPO &#O（MW 358.14） 71.6g
蒸馏水至 1000ml
溶解后，高压灭菌，室温保存。
蒸馏水至 100ml
50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
10％过硫酸胺（AP）
过硫酸胺 0.1g
超纯水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
（可先将过硫酸胺干粉称好分量后放在EP管中，一次性多装几管，使用时加入超纯水即可）
1.5mol/L Tris•HCl（pH8.8）
Tris (MW121.14)
溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）
Tris (MW121.14) 15.14g
溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，室温下保存。
40％Acr/Bic（37.5:1）
丙稀酰胺（Acr）
甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g
溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
30％Acr/Bic（29:1）
丙稀酰胺（Acr）
甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g
溶解后4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
20％Tween20
蒸馏水至 100ml
混匀后4℃保存。
1.2 使用液配制
1.2.1单去污剂裂解液（PMSF）：
1mol/L Tris•HCl（pH8.0）2.5ml
TritonX-100
混匀后4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。
一般实际用的比较多的其实是RIPA-Radio Immunoprecipitation Assay裂解配方：
50 mM Tris-HCl pH 7.4、150 mM NaCl、1 mM PMSF、1 mM EDTA、1% Triton X-100、1%脱氧胆酸钠、0.1% SDS。
裂解得到的蛋白样品，由于含有较高的蛋白去垢剂干扰，不能用Brandford法测定蛋白浓度,要用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。 对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液(弱)效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。
1.2.20.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4）
0.2 mol/L NaH2PO4
0.2 mol/L Na2HPO4
G250考马斯亮蓝溶液（蛋白定量专用）
考马斯亮蓝G250 100mg
蒸馏水至 1000ml
配制时，先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和水，混匀后，用滤纸过滤，4℃保存。
0.15 mol/L NaCl
NaCl（MW58.44） 0.877g
高温灭菌后，室温保存。
1.2.5100mg/ml 牛血清白蛋白（BSA）
0.15 mol/L NaCl
溶解后-20℃保存。制作蛋白标准曲线时，用0.15 mol/L NaCl进行100倍稀释成1mg/ml，-20℃保存。
1.2.6还原型5 X SDS上样缓冲液
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）
二硫叔糖醇（DTT，MW154.5）
混匀后，分装于1.5ml中，4℃保存。
电泳液缓冲液
Tris（MW121.14）
甘氨酸（MW75.07）
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次。
（电泳液可以回收重复利用，一般将回收的电泳液加入垂直电泳槽的下半部分，上半部分最好使用新鲜的电泳缓冲液）
转移缓冲液
甘氨酸（MW75.07）
Tris（MW121.14）
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3～5次（次溶液最好保存在4度冰箱，最多使用5次左右，不然影响转移效率）。
（先用蒸馏水溶解甘氨酸、和SDS，然后再加入甲醇，最后补足液体。如果先加入甲醇，溶解甘氨酸、和等比较困难）
10X丽春红染液
磺基水杨酸
使用时将其稀释10倍。
1.2.10TBS缓冲液
1 mol/L Tris•HCl（pH7.5） 10ml
（可以配制成10×TBS缓冲液进行保存，稀释10倍使用）
TBST缓冲液
20％Tween20
混匀后即可使用，最好现用现配。
封闭液 (最好现配现用)
脱脂奶粉（国产，光明牌） 5g
1.2.12 洗脱抗体缓冲液（可用可不用）
14.4 mol/L 2- Mercaptoethanol(β-巯基乙醇)
700 μl（通风厨里加）
0.5mol/L Tris•HCl（pH6.8）
配制时，在通风厨内进行。4℃保存。可重复使用1次。
1.2.1840%聚丙烯酰胺的浓缩胶和分离胶配制
10％分离胶（两块胶，10ml）
4％浓缩胶（两块胶，5ml）
40％Acr/Bic（37.5:1）
1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8） 2.5ml
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）－
*加TEMED后，立即混匀即可灌胶。（为了加快凝胶，可以将过硫酸胺和TEMED量加大，一般加至原来的2-3倍，根据实验当时的温度适当调整）
15％分离胶（两块胶，10ml） 7.8％浓缩胶（两块胶，5ml）
40％ Acr/Bic（37.5:1）
1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8）
0.5 mol/L Tris•HCl（pH6.8）
1.2.1930%聚丙烯酰胺的浓缩胶和分离胶配制
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围
*丙烯酰胺浓度（%）
线性分离范围（kD）
*双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。
配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶溶液
总体积 5ml
总体积 10ml
总体积 15ml
总体积 20ml
总体积 25ml
总体积 30ml
30%丙烯酰胺
1.5M Tris(pH 8.8)
10%过硫酸胺
30%丙烯酰胺
1.5M Tris(pH 8.8)
10%过硫酸胺
30%丙烯酰胺
1.5M Tris(pH 8.8)
10%过硫酸胺
30%丙烯酰胺
1.5M Tris(pH 8.8)
10%过硫酸胺
30%丙烯酰胺
1.5M Tris(pH 8.8)
10%过硫酸胺
配制Tris-甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5% 浓缩胶溶液
30%丙烯酰胺
1M Tris(pH 6.8)
10%过硫酸胺
这个问题我也遇到过，后来解决了。首先分离胶水封或者异丙醇封得时候不能干，也就是说分离胶和浓缩胶之间的界面不能干，这两个界面很容易有空隙，进入空气一般就会漏孔。再有就是梳子是不是太紧？梳子太紧容易造成 ... 我的梳子就很紧，每次插的时候液体都会溅出来，拔得时候也很容易把泳道弄坏掉，唉。。。有啥方法使梳子稍微松点不啊，呵呵呵回复额，这个可能是手法问题，或者你的梳子和胶板不配套？回复可能是浓缩胶的问题，你仔细看靠近分离胶的位置是不是有波浪状的突起，有的话就对了回复感觉TEMEB加的好多啊
你的现象没见过
只见过浓缩胶是不齐，有点扩散
到分离胶就好了 是因为浓缩胶凝固时间太短
你做胶的夹子是什么样的啊 类似 bio-rad？回复我遇到过，主要原因是板和胶有缝隙。回复我也遇到了相同的问题，我试过全程用10%分离胶跑就没有漏过，所以应该是浓缩胶的问题，期待问题解决啊~~回复好久不来了！感谢大家的回复！总之细心就没事了！这段时间又莫名其妙的好了不漏了！自己都找不到原因！当然在制备完胶在装槽时也有可能微微错动俩玻璃板所致吧 ！回复我也做过电泳，不过做的不多，我一般是在电泳缓冲液里拔，可以好拔一点，你试试吧！仅供参考！回复估计是梳子插得太紧的缘故吧。。拔梳子之前，先将胶板固定好，加上电泳缓冲液，在上样前，缓慢拔掉梳子，上样孔可用微量注射器针头冲洗残留的胶。如果胶齿不正，可用针头略加调整回复个人建议，仅供参考！
首先，问个问题，你是用移液枪上样还是用微量进样器上样？
1.感觉你的问题是浓缩胶和分离胶接触层没有处理好，分离胶液封的表面尽量用折过无毛刺的吸干，但一定不要碰到分离胶；
2.如果用微量进样器上样，注意一定不要触碰到胶孔底部；
3.可以检查一下梳子和玻璃板是否配套，有很多规格的，比如0.5mm、1.0mm等。回复点样过程枪头在制胶板之间嵌得过深使得板子有轻微分离也会导致样品扩散。制胶不要太软，用百分之95的乙醇封胶，如果倒不干净用吸一下。点样孔我在做的过程中也发现总有一两个会不能用，仔细检查一下梳子，在左右两侧有两个小小的点，如果经常用力拔梳子可能会把它弄断所以两侧的孔就不能用了，希望对你有帮助
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【求助】大家跑电泳时会漏胶吗？
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【求助】大家跑电泳时会漏胶吗？
我好像每次都会漏点，不知有什么解决办法。请大家指点和讨论。
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跑电泳怎么可能漏胶呢？
你说的是做胶的时候会漏吧！
不知道你用的是什么电泳槽？我们实验室用的是六一10*13cm的电泳槽,一开始是好的，后来就开始漏胶了。我们就用琼脂封。这里有一个小技巧，琼脂用3%左右浓度的，太浓或太稀都会导致漏液。
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以前也有过这种情况，我的解决办法是。
下面有个胶皮垫，在上面涂上点胶水，然后 就不漏了。
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跑电泳怎么可能漏胶呢？
你说的是做胶的时候会漏吧！
不知道你用的是什么电泳槽？我们实验室用的是六一10*13cm的电泳槽,一开始是好的，后来就开始漏胶了。我们就用琼脂封。这里有一个小技巧，琼脂用3%左右浓度的，太浓或太稀都会导致漏液。
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是指跑电泳时，某孔的样品漏出孔外，当然是少量的，大部分还在原孔、跑在原泳道，在样品尚未到达浓缩胶和分离胶的分界面时，漏的胶的甚至漏到分界面了，很不好看。
我自己认为一部分原因是我加样时已漏出一些，还有是什么呢？
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呵呵，那不叫漏胶，一般都不会有这种现象发生。
如果发生了，建议是
　1　放少一点浓缩胶（即把胶孔作大一点）
　2　注意上样缓冲液的配方，必要的时候，加大甘油的用量。这样你的样品就会沉的很快－就象买来的MARKER一样。
　3　用枪加完后，稍停片刻再把枪提起，避免带起样品。
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早期的电泳槽制胶时需要琼脂封胶,漏一点是难免的.现在各生产厂家在自动封胶方面做了很多改进,基本解决了漏胶的问题.
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&&&是指跑电泳时，某孔的样品漏出孔外，当然是少量的，大部分还在原孔、跑在原泳道，在样品尚未到达浓缩胶和分离胶的分界面时，漏的胶的甚至漏到分界面了，很不好看。
我自己认为一部分原因是我加样时已漏出一些，还有是什么呢&&&
我也遇到这样的情况，不知战友的问题是否已经解决，给我传授一下经验
我个人认为可能是
1 上层胶没有凝好，
2 倒掉用于压分离胶的水后，没有完全晾干
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没有啊，怀疑是我上样技术不过关的缘故
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我也经常遇到此问题,我认为可能有两个原因:
1是玻璃板不干净,导致罐胶时空气进入.
2是蛋白浓度可能过高
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我觉得你说的不叫漏胶应该叫漏液（样品跑到槽外电泳缓冲液中了）吧，有两个小建议你可以试试：1、减少上样量，试试10ul吧；2、上样的时候枪头要抵紧板子（靠外的玻璃板），看好了孔再缓慢连续的加，避免将样品加到槽外。月度关注热点
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我好像每次都会漏点，不知有什么解决办法。请大家指点和讨论。查看完整版本请点击这里：
am10 ( 15:20:52)
以前也有过这种情况，我的解决办法是。
下面有个胶皮垫，在上面涂上点胶水，然后 就不漏了。
avi317 ( 15:24:01)
跑电泳怎么可能漏胶呢？
你说的是做胶的时候会漏吧！
不知道你用的是什么电泳槽？我们实验室用的是六一10*13cm的电泳槽,一开始是好的，后来就开始漏胶了。我们就用琼脂封。这里有一个小技巧，琼脂用3%左右浓度的，太浓或太稀都会导致漏液。
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是指跑电泳时，某孔的样品漏出孔外，当然是少量的，大部分还在原孔、跑在原泳道，在样品尚未到达浓缩胶和分离胶的分界面时，漏的胶的甚至漏到分界面了，很不好看。
我自己认为一部分原因是我加样时已漏出一些，还有是什么呢？
zhenxin ( 15:25:05)
呵呵，那不叫漏胶，一般都不会有这种现象发生。
如果发生了，建议是
　1　放少一点浓缩胶（即把胶孔作大一点）
　2　注意上样缓冲液的配方，必要的时候，加大甘油的用量。这样你的样品就会沉的很快－就象买来的MARKER一样。
　3　用枪加完后，稍停片刻再把枪提起，避免带起样品。
rxcc33 ( 15:26:59)
早期的电泳槽制胶时需要琼脂封胶,漏一点是难免的.现在各生产厂家在自动封胶方面做了很多改进,基本解决了漏胶的问题.
utt0989 ( 15:27:24)
&&&是指跑电泳时，某孔的样品漏出孔外，当然是少量的，大部分还在原孔、跑在原泳道，在样品尚未到达浓缩胶和分离胶的分界面时，漏的胶的甚至漏到分界面了，很不好看。
我自己认为一部分原因是我加样时已漏出一些，还有是什么呢&&&
我也遇到这样的情况，不知战友的问题是否已经解决，给我传授一下经验
我个人认为可能是
1 上层胶没有凝好，
2 倒掉用于压分离胶的水后，没有完全晾干
yapuyapu ( 15:27:49)
没有啊，怀疑是我上样技术不过关的缘故
831226 ( 15:29:26)
我也经常遇到此问题,我认为可能有两个原因:
1是玻璃板不干净,导致罐胶时空气进入.
2是蛋白浓度可能过高
wmp1234 ( 15:30:38)
我觉得你说的不叫漏胶应该叫漏液（样品跑到槽外电泳缓冲液中了）吧，有两个小建议你可以试试：1、减少上样量，试试10ul吧；2、上样的时候枪头要抵紧板子（靠外的玻璃板），看好了孔再缓慢连续的加，避免将样品加到槽外。
yapuyapu ( 15:31:07)
可能是以前上样技术不过关，昨天上样几乎没出现这种情况了
雪原 ( 15:31:53)
可能是浓缩胶的问题，你仔细看靠近分离胶的位置是不是有波浪状的突起，有的话就对了
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点击次数：145&&发布时间：[更新时间: 17:25:12]
公司名称：北京菁美瑞科技有限公司
号：JMR-JX5L
所在地点：中国大陆
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简单介绍：
* 新款快速SSR型垂直电泳槽是我公司对夹芯式电泳槽革命性的重新开发、设计出的新一代垂直电泳产品；* 改革后的产品，除保留“夹芯式"电泳槽缓冲液充足的特点外，无需胶框封胶，彻底解决了漏胶、漏液、胶框老化、操作繁琐等缺点带来的不便；* 只需少数几个旋转操作，使制胶、上板过程更加轻松快捷；
&JMR-JX5L电泳槽性能特点* 新款快速SSR型垂直电泳槽是我公司对夹芯式电泳槽革命性的重新开发、设计出& 的新一代垂直电泳产品；* 改革后的产品，除保留&夹芯式"电泳槽缓冲液充足的特点外，无需胶框封& 胶，彻底解决了漏胶、漏液、胶框老化、操作繁琐等缺点带来的不便；* 只需少数几个旋转操作，使制胶、上板过程更加轻松快捷；* 优化的凝胶面积，合理的样品量设计，该款电泳槽广泛应用于SSR扩增产物聚丙& 烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测；* 可拆卸电极架，使电极的维修及更换更加方便，快捷、安全；* 开盖断电结构，保证实验者的操作安全；* 独特、巧妙的人性化结构设计，确保食盐操作简便、快捷、可靠！&产品用途& & 广泛应用于SSR扩增产物聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）检测。&
北京菁美瑞科技有限公司
联系人：张经理（联系我时请说明是在阿仪网看到的！谢谢)
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