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【求助】请教关于分子量14kDa蛋白的western blot？？
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这个帖子发布于5年零117天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近在做western blot，测一个小分子量蛋白（14kDa），一直没有结果。我的电泳条件：1、普通聚丙烯酰胺凝胶，上层胶5%,下层胶15%；2、电泳80V,30min左右，待marker散开后，加电压110V-150V,继续电泳约503、转膜80V,30-50min。请教各位前辈：1、普通聚丙烯酰胺凝胶能跑出来吗？是否有必要用Tricine-SDS-PAG？
2、电泳时间、转膜时间是否合适？
3、其他还需注意些什么？
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14kd的蛋白用普通15%的westen可以的，不会跑出来，根据你的溴酚蓝来决定跑胶时间。电转条件没什么问题。如果是夏天电转，记得槽内放冰袋。否则温度过高。
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蛋白分子量比较小，建议你用PVDF膜，不要用NC，因为NC对小分子蛋白的截留能力不好。另外，如楼上所述，转印时尽量保证低温。
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第一个就是用SDS-PAGE胶是可以的，15%的浓度也没问题，再就是要用0.22um的PVDF膜，转膜液里面不要加SDS，不知道你用的什么仪器转膜，你用横流试试，200mA 45min,注意降温，仅供参考
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能跑出来，转膜 60V 30min，0.22 NC膜，没问题，能出来
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应该用0.22um的PVDF膜
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你转过大分子量的蛋白么?比如270KDa的?湿转的转膜条件是什么啊?我用200mA转了2.5个小时结果都没转上
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湿转,给你个比较麻烦一点的条件：用串联转法,10V恒压,转移过夜.有条件的话在四度下进行.如果你不想花时间,你可以用半干转,大约80mA一张膜,转移1.5h也可以了.
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【求助】WB检测小分子量蛋白（小于10kDa）的问题请教
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这个帖子发布于8年零206天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近用WB检测小鼠脑组织beta淀粉样蛋白，做了一次，背景很高，准备再摸索一下条件。请教：有谁能分享一下WB检测10kDa以下的蛋白表达的注意事项和特殊要求吗？谢谢。
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wh2008 edited on
对于分子量仅为4KD左右的蛋白（严格来说肽段）而言，在WB检测中主要是注意：一、SDS-PAGE时候控制好电泳时间，别跑丢了；二、另外就是转膜的时候很容易“穿透”，选择小孔径的膜很有必要（对付小分子蛋白一般都是0.22um的印迹膜），听说whatman还有0.1um的印迹膜可供选择；三、最后就是abeta的丰度在脑组织中丰度到底有多高，会不会已经超出WB检测的灵敏度范围？我曾经原核表达过带有tag的abeta蛋白，WB检测时候很正常。
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谢谢提醒，这几个问题你回复得比较到位，恳请版主给予加分鼓励。
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回答你第1个问题：SDS-PAGE不好掌握时间,可以跑Tricine-SDS-PAGE,适合于分离小分子量的蛋白,分离范围为1~100kD
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请问Tricine-SDS-PAGE怎么配。谢谢！
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Tricine gel:Separating gel (16.5% T,3%C)30% Acrylamide
19.2mlGel buffer*
11.7mlGlycerol 4.6ml10% APS 150ulTEMED 15ulStacking gel (4%T, 3%C)30% Acrylamide 825ulGel buffer 1.55ml10%APS
50ulTEMED 5ulwater 3.875mlAnode buffer 0.2M Tris, pH 8.9Cathode buffer 0.1M Tris, pH 8.25**0.1M Tricine0.1% SDS*Gel buffer: 3M Tris, pH 8.45, 0.3% SDS**no need to adjust the pH.另外，C好象是指polyacrylamide的交联率，在commercial的瓶子上好象有列出实际16.5%这里就是指其浓度，分子克隆上最高的也只列到15％，这里16.5%算是很特殊的了,所以Tricine胶是用于分离很小的蛋白／肽段的
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以下是详细说明书：
Tricine/Polyacrylamide Gel ElectrophoresisUsed for pilin processing analysis but generally useful for resolution of small (15-35 Kdal) proteins of similar size. SeeStrom, M. S., D. N. Nunn, and S. Lory. 1993. A single bifunctional enzyme, PilD, catalyzes cleavage and N-methylation of proteins belonging to the type IV pilin family. Proc. Natl. Acad. Sci., 90:. or Strom, M. S., and S. Lory. 1992. Kinetics and sequence specificity of processing of prepilin by PilD, the Type IV leader peptidase of Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 174:. Original citation: Schagger, H. and G. von Jagow. 1987. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166: 368-379. Reagents:
Anode Buffer (+): 200 mM Tris pH 8.9 (can dilute from 10X stock)
Cathode Buffer (-): 100 mM Tris/100 mM Tricine/0.1% SDS (no need to pH, but will be ~8.25) these can be made as 10X stocks and diluted before use
Gel Buffer: 3.0 M Tris, pH 8.45/0.3% SDS Note: the pH's given for the anode and gel buffers are essential
Stacking acrylamide: 48% acrylamide/1.5% bis-acrylamide
Separating acrylamide: 46.5% acrylamide/1.5% bis-acrylamide
Sample buffer: (add equal volume to sample), for 20 ml:
5 ml 0.5 M Tris, pH 6.8
4 ml 20% SDS
1 ml 2-mercaptoethanol
4 ml 50% glycerol
0.004 g bromophenol blue
6 ml water
Pouring Gels For each minigel (Hoeffer &Mighty Small& or BioRad &Mini Protean-II&--scale up as required):
1. Separating gel:
2 ml separating acrylamide
2 ml gel buffer
2 ml 50% glycerol
1.22 ml separating acrylamide
2 ml gel buffer
2 ml 50% glycerol
0.78 ml waterpolymerize with 75 ul 10% APS and 7.5 ul TEMED
2. Stacking gel:
0.25 ml stacking acrylamide
0.75 ml gel buffer
2.0 ml water
20 ul 10% APS
2 ul TEMED
Polymerize both the stacking and separating gels at the same time (I used small disposable tubes), and pour stacking gel directly onto the separating gel (pour carefully but quickly--they won't mix but the separating gel polymerizes within 2-3 minutes). Make each separating gel mixture separately and add TEMED and APS right before pouring. Multiple stacking gel mixtures can be made in the same tube, but you have around 10 minutes before these start to polymerize too. Sample loading and electrophoresis:
For the minigels, 5-10 ul per well gives best results. Layer the samples in the well very carefully, and be sure to flush out any unpolymerized acrylamide before loading.
Electrophorese at 25-35 mA (constant current) per gel in minigel setup. Foam will appear on the top (cathode), and additional cathode buffer may have to be added during the run.
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我有个问题，看文献讲，有的胶用3C，有的用6C，那种好一些？为什么？
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本人曾看過一篇專門討論大膠的跑膠時間,電壓,電流,以及C%等的條件,剛才去找了一下,沒找到.偶的印象是,除非是很特殊的實驗,否則C的影響不大,不必專門關心. 試想,在丙烯酰胺單體溶液中,3%的二聚體與6%的二聚體,對整個體系的影響,差別能有多大?
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【求助】请教大分子量蛋白（MRP－1 190 kDa）做wb应该注意甚么？
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我检测MRP1（multidrug resistant protein 1）蛋白的表达（ 190 kda），用santa cruz的一抗， 10％ 的分离胶， 恒压100 V 转3 个小时，中间换冰保持低温。 转完后，发现250 kDa的marker 可以完全转到nitrocellulos膜上。 但是最后，ECl曝光后发现在marker 250kDa 和148 Kda之间信号非常弱。我想请教大家：1. 我的wb的过程可以有甚么改进呢？2. 大家用没有用过其他公司的MRP1aitibody 可以推荐一下呢？ 我担心santa cruz的antibody有的质量不好。非常感谢！！！
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同求，我的蛋白是290kDa 大小，做了很多次还是没做出来，5%分离胶，100V转了5小时，发现在250以上（最大marker）根本就没有任何条带，请高手指点
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有高手能帮忙指点一二吗？如果有需要，我可以帮忙查全文做为回报。谢谢先！
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我用的是ABcam的抗体，然后，有做出来还挺明显的，但是，我也遇到了一些问题，就是换了样本就是重复不出来
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