中科院851微生物学考研真题资料
中科院大学硕士研究生入学考试
851《微生物学》考试大纲解析
一.&考试科目基本要求及适用范围概述
本《微生物学》考试大纲适用于中国科学院大学微生物学及相关专业的硕士研究生入学考试。微生物学是现代生物学的重要分支学科，是许多学科专业的基础课程。本考试大纲的主要内容包括微生物学的基本概念和原理，包括微生物生物多样性和分类、微生物生理和代谢、微生物生态学、微生物遗传学、微生物免疫学及微生物生物技术等。要求考生对微生物学的基本概念、专业词语、技术原理有较深的了解；系统掌握微生物的系统分类、细胞结构与功能、生理代谢、遗传变异、生态学和免疫学的基本理论知识以及相关实验技术；并具有应用这些知识和技术分析和解决问题的能力。
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二.&考试形式
闭卷，笔试，考试时间180分钟，总分150分。
试卷结构（题型）包括：名词解释、匹配题、填空题、简答题、实验设计题，共五个部分。
三.&使用说明：
大纲要求使用&#9734;标注
a.掌握&&&&&#9734;&#9734;&#9734;
b.熟悉&&&&&#9734;&#9734;
c.理解&&&&&#9734;
四.&考试要求
（一）微生物学基本概念和意义
1.&了解什么是微生物？微生物学的研究领域和相关学科。掌握微生物学中常用科学词语和名称。
2.&了解微生物的生物多样性概念，包括物种多样性、形态多样性、发育多样性、代谢及遗传多样性，微生物多样性是人类生存活动的重要生物资源。
3.&了解微生物学发展史是伴随人类文明和技术进步的漫长历程；微生物学的发展促进了人类的进步。
4.&了解微生物对生命科学基础理论研究的贡献，以及在医药、工业、农业、环境保护等方面的应用。
（二）原核微生物
1.&了解什么是原核生物？什么是生命三域说，由谁提出及根据是什么？了解原核生物的系统进化理论。&
2.&了解原核生物的细胞结构，认识细胞壁、细胞膜、核区(异核体)、核糖体、内生孢子、鞭毛等结构和功能性状，以及在微生物多样性研究中的意义。
3.&了解和掌握原核生物的现代分类体系与鉴定的基本程序和方法。包括革兰氏染色、形态观察、生理测定、生化活性分析、细胞化学分析、核酸(RNA/DNA)分析、蛋白质分析等表观和分子信息在分类鉴定中的综合应用。了解原核微生物的命名法规。
4.&了解和认识原核生物的物种多样性。了解细菌(狭义的)、放线菌、蓝细菌和古菌的重要代表种群的基本特性和在研究生命现象中的意义。
（三）&真核微生物
1.&了解什么是真核生物?&真核微生物的主要类群。
2.&了解真核微生物的细胞结构与功能,&比较真核细胞与原核细胞间的主要区别。
3.&了解和掌握真核微生物的分类与鉴定的基本方法。认识真核微生物的物种多样性。了解酵母菌、霉菌、蕈菌的主要代表种群的生物学特征和实际意义。
（四）&病毒和亚病毒
1.&了解病毒的基本特点、病毒的结构、病毒大小以及病毒的寄主和种类。
2.&了解病毒的分类原理和命名原则
3.&了解病毒侵入寄主细胞后复制周期所包括的吸附、穿入、脱壳、转录和翻译、组装及释放等主要环节。
4.&了解什么是亚病毒？亚病毒包括的类病毒、拟病毒、朊病毒等的特性。
5.&何谓噬菌体？何谓温和噬菌体、溶源噬菌体以及λ噬菌体？
6.&了解目前国内外在主要病毒研究领域的研究状况和进展，如禽流感病毒，肝炎病毒等与人类息息相关的类群。
（五）微生物生理和代谢
1.&了解微生物六类营养要素;&微生物的营养类型;&培养基种类及配制原则。
2.&了解微生物生长的测定方法；熟悉典型生长曲线的意义；了解影响微生物生长的主要因素。
3.&了解控制有害微生物的主要措施及其意义；熟悉高温灭菌的主要方法；了解常用化学杀菌剂、抗生素、消毒剂和治疗剂种类和功效，以及其杀菌、抑菌原理。
4.&了解能量代谢中的生物氧化概念；熟悉生物氧化包括的呼吸、无氧呼吸和发酵三种类型及其意义。
5.&了解分解代谢的内容。何谓合成代谢？合成代谢和分解代谢的关联性。
6.&了解次生代谢和次生代谢产物(包括抗生素和非抗生素生物活性物质)及其重要性。
7.&举例说明自养微生物CO2固定的4&条途径：Calvin循环、乙酰－CoA途径、逆向TCA途径和羟基丙酸途径。了解何谓生物固氮？固氮微生物的种类。&
8.&了解何谓代谢调控？了解工业发酵通过调节三类初级代谢途径而提高发酵效率的意义。
（六）&微生物生态学
1.&了解微生物生态学的概念、微生物生态系的结构和功能。
2.&了解自然界中微生物在土壤、水体、空气及其他环境中的分布。何谓极端微生物？了解古菌(Archaea)和极端微生物的关系。了解目前已知的极端生命条件。
3.&了解微生物间和微生物与其他生物间的五种主要关系类型。
4.&了解微生物在自然界碳、氮、硫、磷物质循环中的作用。
5.&了解何谓水体富营养化。解释“水华”(Water&Bloom)、“赤潮”(Red&Tide)现象。何谓生物处理(Biotreatment)和生物整治(Bioremediation)?&说明微生物在环境保护中的作用。
6．初步了解16S&rRNA等基因在分子微生物生态学中的重要意义，以及基于这类生物分子发展起来的分子微生物生态学的基本方法。
（七）微生物遗传变异和育种
1.&熟悉各类微生物（细菌、古菌、真核微生物、病毒等）的遗传特征。
2.&利用微生物的三个经典实验：转化实验、噬菌体感染实验和植物病毒的重组实验证明遗传变异的物质基础是核酸。了解遗传物质(DNA/RNA)在微生物细胞内的存在部位(核或核区、核糖体、质粒等)和功能特性。
3.&了解DNA的结构及其功能（如复制、转录等）相适应的特点。
4.&清楚基因的概念，了解基因突变的特点及突变机制。能举例说明物理诱变、化学诱变在育种中的应用。
5.&了解微生物基因表达调控的相关元件及其功能，了解原核微生物基因表达调控的分子机制。
6.&了解原核生物的四种遗传操作方法：转化(Transformation)、转导(Transduction)、接合(Conjugation,&Mating)和原生质体融合(Protoplast&Fusion)。了解真核微生物基因重组中的有性杂交和准性杂交(Parasexual&Hybridization)&在育种中的意义。
7.&熟悉基因工程(Genetic&Engineering)和相关技术术语。熟悉基因工程的基本操作步骤。
8.&了解菌种保藏的基本方法。何谓菌种退化(Degeneration)？了解菌种复壮的措施。
9.&理解基因和基因组的概念；了解真核生物和原核生物在基因组结构、基因结构及遗传过程中的主要差别。
（八）传染与免疫
1.&了解什么是传染(Infection)及决定传染的基本因素。
2.&了解什么是免疫？了解非特异性免疫的概念。&
3.&了解特异性免疫的特点。了解什么是抗原？什么是抗体？以及免疫学中常用的基本词语和概念。
4.&了解抗原－抗体反应的一般规律及免疫学的意义；抗原－抗体间的主要反应：凝集反应、沉淀反应、补体结合试验、中和反应，熟悉上述四种免疫反应的试验方法及原理。了解免疫制剂的种类及作用。
（九）知识综合运用能力
1.在给出前提条件下，能够设计简单的技术路线去获得所要求的微生物类群、基因或代谢产物。
2.能够根据提供的现象，提出微生物所具有的功能假说或进化过程假说。
3.利用所学知识，设计用某种微生物的功能去解决一个实际问题。
五.&考试大纲解析
（一）微生物学基本概念和意义
1.&了解什么是微生物？微生物学的研究领域和相关学科。
1.1微生物：一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称。它们都是一些个体微小，构造简单的低等生物。
1.2&微生物的特点：
（1）形态微小结构简单
（2）代谢旺盛繁殖快速
（3）适应性强容易变异
（4）种类繁多分布广泛&
（5）食谱广、易培养、起源早、休眠长
微生物学的研究对象：藻类、原生动物、细菌、真菌、病毒
相关学科：免疫学、病毒学、化学疗法、遗传学和分子生物学、基因组学
&#9734;&#9734;&#掌握微生物学中常用科学词语和名称。
微生物学：（microbiology）:&生物学的分支学科之一，它是在分子、细胞或群体水平上研究各类微小生物的形态结构、生长繁殖、生理代谢、遗传变异、生态分布和分类进化等生命活动的基本规律的一门学科。
菌落：将单个微生物细胞或一小堆同种细胞接种到固体培养基表面（有时在内层），当它占
有一定的发展空间并处于适宜的培养条件下时，该细胞就会迅速生长繁殖并形成细胞堆，菌
标准菌株：具有某种细菌典型特征的菌落。
毒力：细菌致病性的强弱程度。
侵袭力：指病原菌突破宿主的防御功能，进入机体内定植、繁殖和扩散的能力。
2.了解微生物的生物多样性概念，包括物种多样性、形态多样性、发育多样性、代谢及遗传多样性，微生物多样性是人类生存活动的重要生物资源。
微生物生物多样性（Microbial&biodiversity）：微生物的所有生命形式，生态系、生态过程，以及可以认识到的有关的基因、类群和分子水平上的遗传特征。包括物种多样性，生理代谢类型多样性，遗传基因多样性和生态多样性。
&#9734;&#9734;3.了解微生物学发展史是伴随人类文明和技术进步的漫长历程；微生物学的发展促进了人类的进步。
微生物学发展史:
1).列文虎克：微生物学的开拓者、世界上第一个观察到微生物的人——1676
2).巴斯德：
&#9332;彻底否定了“自生说”。（曲颈瓶实验）
&#9333;免疫学——预防接种。（鸡霍乱病）
&#9334;证明发酵是由微生物引起的。
&#9335;发明巴氏消毒法。
&#9332;证实炭疽病菌是炭疽病的病原菌。
&#9333;发现了肺结核病的病原菌。
&#9335;用固体培养基分离纯化微生物。
&#9336;配制培养基。
4).布赫纳：&用酵母菌无细胞压榨汁将葡萄糖进行酒精发酵取得成功，发现了微生物酶的重要作用、从此将微生物学推到了生化研究的阶段。
1、某一种微生物，当被怀疑是病原体时，它一定伴随着病害而存在。
2、必须能自原寄主分离出这种微生物，并培养成为纯培养。
3、用已纯化的纯培养微生物，人工接种寄主，必须能诱发与原来病害相同病害。
4、必须自人工接种发病的寄主内，能重新分离出同一病原微生物并培养成纯培养。
&#&了解微生物对生命科学基础理论研究的贡献
微生物由于其“五大共性”加上培养条件简便，因此是生命科学工作者在研究基础理论问题时最乐于选用的研究对象。历史上自然发生说的否定，糖酵解机制的认识，基因与酶关系的发现，突变本质的阐明，核酸是一切生物遗传变异的物质基础的证实，操纵子学说的提出，遗传密码的揭示，基因工程的开创，pcr技术的建立，真核细胞内共生学说的提出，以及近年来生物三域理论的创建等，都是因选用微生物作为研究对象而结出的硕果。为此，大量研究者还获得了诺奖的殊荣。微生物还是代表当代生物学最高峰的分子生物学三大来源之一。在经典遗传学的发展过程中，由于先驱者们意识到微生物具有繁殖周期短、培养条件简单、表型性状丰富和多数是单倍体等种种特别适合作遗传学研究对象的优点，纷纷选用粗糙脉孢菌，大肠杆菌，酿酒酵母和t&系噬菌体作研究对象，很快揭示了许多遗传变异的规律，并使经典遗传学迅速发展成为分子遗传学。从1970&年代起，由于微生物既可以作为外源基因供体和基因载体，并可作为基因受体菌等的优点，加上又是基因工程操作中的各种“工具酶”的提供者，故迅速成为基因工程中的主角。由于小体积大面积系统的微生物在体制和培养等方面的优越性，还促进了高等动、植物的组织培养和细胞培养技术的发展，这种“微生物化”的高等动、植物单细胞或细胞集团，也获得了原来仅属于微生物所有的优越体制，从而可以十分方便地在试管和培养皿中进行研究，并能在发酵罐或其他生物反应器中进行大规模培养和产生有益代谢产物。此外，这一趋势还是原来局限于微生物实验室使用的一整套独特的研究方法、技术，急剧向生命科学和生物工程各领域发生横向扩散，从而对整个生命科学的发展，作出了方法学上的贡献。
4.2微生物在医药、工业、农业、环境保护等方面的应用。
1）、医药中的应用：
热原质：能引起机体发热的物质。因为外源性热原质是细菌在合成代谢中产生，能导致感染
机体发热的物质，所以在注射药品的生产中药特别注意防止热原质污染。
毒素与侵袭性酶：毒素有毒，侵袭性酶损伤机体组织，是细菌重要的致病物质。
细菌素：有特异性，用于细菌的分型和流行病学调查
色素：用于细菌的分类和鉴定。
抗生素：能选择性杀死其他生物或肿瘤细胞的物质。
维生素：供给人体吸收。
2）、工业应用
a.发酵工程又叫微生物工程。对微生物进行生物工程改造，包括基因工程技术、转基因生物技术、合成生物学技术等，以及工业化应用微生物发酵生产的工程等。发酵是微生物特有的作用。
b.食品生产：生产传统的发酵产品，如啤酒、果酒、食醋等，使产品的质量和产量得到明显提高；生产食品添加剂。如L-苹果酸、柠檬酸、谷氨酸、红曲素、高果糖浆等；单细胞蛋白的生产。
3）、微生物资源在现代农业中的应用,主要包括微生物饲料,微生物肥料,微生物农药,微生物食品,微生物能源,微生物环境保护剂等方面。
a.微生物饲料能够用于微生物饲料的生产及调制的微生物,&主要有细菌、&酵母菌、&担子菌及部分单细胞藻类微生物等。发酵饲料是利用人工接种微生物或饲料本身&存在的微生物，将青饲料、粗饲料以及少量的精饲料或其他废弃物之，在一定温度、湿度和通气条件下，通过微生物的作用，使饲料中不易消化吸收的成分，转化为容易消化、并适合家畜口味的营养料。
b.微生物肥料的研究和应用正在热潮之中。其主要品种有：根瘤菌肥料类、固氮菌肥料类、硅酸盐细菌肥料、光合细菌肥料、微生物生长调节剂、复合微生物肥料类等。其原理是利用微生物的生命活动来增加土壤中氮素或有效磷、钾的含量，获奖土壤中一些作物不能直接利用的物质，转化成课被吸收利用的营养物质，或提供作物的生长刺激物质，或一致植物病原菌的活动，从而提高土壤肥力，改善作物的营养条件，提高作物产量。
c.微生物农药是指应用生物活体及其代谢产物制成的防治作物病害、虫害、杂草的制剂,&也包括保护生物活体的助剂、保护剂和增效剂,&以及模拟某些杀虫毒素和抗生素的人工合成制剂现在应用的较多，有细菌、真菌、昆虫病毒等构成的微生物杀虫剂、农用抗生素、微生物除莠剂三大类。微生物杀虫剂均为有害昆虫的致病微生物，通过人工生产和施用这些微生物农药，是害虫感染疾病而死亡。微生物杀虫剂主要包括细菌制剂（如苏云杆菌）、放线菌制剂、真菌制剂、霉菌制剂和病毒&制剂等。
d.微生物农药是指应用生物活体及其代谢产物制成的防治作物病害、虫害、杂草的制剂,&也包括保护生物活体的助剂、保护剂和增效剂,&以及模拟某些杀虫毒素和抗生素的人工合成制剂现在应用的较多，有细菌、真菌、昆虫病毒等构成的微生物杀虫剂、农用抗生素、微生物除莠剂三大类。微生物杀虫剂均为有害昆虫的致病微生物，通过人工生产和施用这些微生物农药，是害虫感染疾病而死亡。微生物杀虫剂主要包括细菌制剂（如苏云杆菌）、放线菌制剂、真菌制剂、霉菌制剂和病毒制剂等。
e.微生物能源：我国微生物能源的应用主要是沼气。微生物在人畜粪便处理、城市污染和生活垃圾堆肥、沼气发酵等方面应用较广。该方面成熟的例证有很多，如利用有机废物生产甲烷；应用酵母和光合细菌进化高浓度有机无毒废水生产细胞蛋白等，同时生产饲料和饵料；利用木材废弃物所含非纤维素生产燃料乙醇；利用木材废弃物所含的半纤维素生产木糖及木糖醇等。
4、环境保护应用
微生物生态环境保护剂：我国微生物除臭剂的开发和应用具有广阔的发展空间。也称生物修复，是指利用微生物及其他生物，将土壤、地下水或海洋中的危险性污染物现场降解成二氧化碳和水货转化成无害物质色工程技术系统。可以用来作为生物修复的微生物分为三大类：土著微生物、外来微生物、基因工程菌。生物修复技术的出现和发展反映了污染治理工作已从耗氧有机污染物深入到影响更为深远的有害有机污染物，并且从地表水扩展到土壤、地下水和海洋。
（二）原核微生物
1.&了解什么是原核生物？什么是生命三域说，由谁提出及根据是什么？了解原核生物的系统进化理论。&
1.1原核生物（Prokaryote）：是指一大类细胞核无核膜包裹，只存在称为核区的裸露DNA的原始单细胞生物，没有复杂的细胞器,只有核糖体；有的含有细胞壁,成份是肽聚糖。
根据外表特征把原核生物粗分为6种类型：细菌、蓝藻（蓝细菌）、放线菌、支原体、衣原体、立克次氏体
&#9734;&#生命三域学说：
生命三域学说，伍斯（Woese）提出，域是比界更高一级的分类单元，整个生命界分为：古菌域（Archaea）、细菌域（Bacteria）和真核生物域（Eucarya）。根据超微结构和生物化学，尤其是分子生物学证据，将自然界的整个生物被重新划归三大超界，即原核的古菌、原核的细菌和全部真核生物。
Woese用寡核苷酸序列编目分析法对60多株细菌的16SrRNA序列进行比较后，惊奇地发现：产甲烷细菌完全没有作为细菌特征的那些序列，于是提出了生命的第三种形式--古细菌(archaebacteria)。随后他又对包括某些真核生物在内的大量菌株进16SrRNA(18SrRNA)序列的分析比较，又发现极端嗜盐菌和极端嗜酸嗜热菌也和产甲烷细菌一样，具有既不同其他细菌也不同于其核生物的序列特征，而它们之间则具有许多共同的序列特征。于是提出将生物分成为三界(Kingdom)(后来改称三个域)：古细菌、真细菌(Eubacteria)和真核生物(Eukaryotes)。1990年，他为了避免把古细菌也看作是细菌的一类，他又把三界(域)改称为：Bacteria(细菌)、Archaea(古生菌)和Eukarya(真核生物)。并构建了三界(域)生物的系统树。
16SrRNA同源性分析在原核生物系统学研究中的意义:&
a.&存在于所有生物的细胞中；&
b.&具有分子计时器的特点:分子序列变化缓慢，能跨越整个生命进化过程；&&&
c.&分子中含有进化速度不同的区域，可用进化速度不同的生物之间的系统发育。
1.5&原核生物的系统进化理论(参考2007《中国科学》论文)
原核生物分类中存在的问题由来已久.&从林奈开始,&物种的分类一直主要基于它们的形态特征.&人们更加强调对相似物种的分组,&而忽略了寻求它们之间的进化关系.&
由于不同种的真细菌与古细菌间的16S&rRNA基因（16S&rDNA）是高度保守的，16S&rDNA常被用于对各种生物进行的系统发育学方面的研究这种运用16S&rRNA对生物进行系统发育学研究的方法由卡尔·沃斯（Carl&Woese）开创。
在细菌基因组中，编码&16S&rRNA&的&rDNA&基因具有良好的进化保守性，适宜分析的长度（约为1540bp），以及与进化距离相匹配的良好变异性，所以成为细菌分子鉴定的标准标识序列。16S&rDNA的序列包含9或10个可变区（variable&region）和11个恒定区（constant&region）。保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系，而高变序列区域则能体现物种间的差异。16S&rDNA分子的序列特征为不同分类级别的近缘种系统分类奠定了分子生物学基础。
2.&了解原核生物的细胞结构，认识细胞壁、细胞膜、核区(异核体)、核糖体、内生孢子、鞭毛等结构和功能性状，以及在微生物多样性研究中的意义。
2.1细胞壁的特殊结构：肽聚糖结构只出现于原核生物中，胞壁酸、磷壁酸、D-氨基酸以及二氨基庚二酸（m-DAP）都是细菌以及与细菌相近的原核生物细胞壁中特有成分。
细胞壁的功能：几乎所有细菌（除支原体外）都有细胞壁）
（1）&固定细胞外形和提高机械强度，使其免受渗透压等外力的伤害。
（2）&阻拦大分子有害物质进入细胞。
（3）&提供细胞的生长、分裂和鞭毛的着生、运动所必需的结构。
（4）&赋予细胞特定的抗原性、致病性和对抗生素及噬菌体的敏感性。
1.&细胞膜的生理功能：
&#9332;选择性的控制细胞内外营养物质和代谢产物的运送。
&#9333;是维持细胞内正常渗透压的结构屏障。
&#9334;是合成细胞壁和糖被有关成分的重要场所。
&#9335;膜上含有与氧化磷酸化或光合磷酸化等能量代谢有关的酶系，是细胞的产能基地。
&#9336;是鞭毛基体的着生部位。
3.核区(异核体)
特点：无核膜、核仁、固定形态，结构简单，细胞分裂前核分裂。一般单倍体。
成分：DNA：环状双链，超线圈结构，负电荷被镁离子、有机碱（精胺、腐胺）所中和。
4.核糖体、
核糖体&ribosome&RS
核糖核蛋白的颗粒状结构，RNA+蛋白。
原核：游离态、多聚核糖体，70S
真核：游离态、结合内质网上，70、80S
多聚核糖体：一条mRNA与一定数目的单个RS结合而成。
5.内生孢子：某些细菌生长的一定阶段，在细胞内形成一个圆形、椭圆形或柱形的休眠体。由于它位于细胞内，为区别放线菌、霉菌等形成的分生孢子，故又称内生孢子(endospore),又称芽孢。
芽孢：某些细菌在其生长发育后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量低、抗逆性强的休眠构造，称为芽孢。
6.鞭毛：所有弧菌、螺菌和假单胞菌，约半数的杆菌和少数球菌有鞭毛，细菌鞭毛是一端连于细胞，一段游离的、细长的波形纤丝状物。鞭毛的着生位置和数目是细菌分类鉴定所依据的形态特征之一。
鞭毛结构：鞭毛不是直的，而是螺旋形的，平展时每一种细菌鞭毛的两个相邻的弯曲之间的长度是恒定的，称之为鞭毛波长，鞭毛波长也是细菌种属的特征之一。鞭毛由鞭毛丝、鞭毛钩和基体组成。
&&&&&&鞭毛有推动细菌运动的功能，一般认为，细菌鞭毛主要是通过旋转来推动细菌运动。
&&&&&&鞭毛的生长并不是从基部开始的，而是从尖端生长。
7.菌毛：某些革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌和霍乱弧菌等）与革兰氏阳性菌（如链球菌属和棒杆菌属）的个别菌体表面有非鞭毛的细毛状物——菌毛。菌毛为中空柱状，较鞭毛细且短。菌毛由菌毛蛋白亚基螺旋排列而成，它不参与运动，所以运动细菌和不运动细菌都可以有菌毛。但不是所有细菌都有菌毛，产生菌毛的能力是由其染色体基因所决定的遗传性状。功能：1.促进细菌的黏附2.促使某些细菌缠集在一起而在液体表面形成菌膜以获得充分的氧气3.是许多革兰氏阴性菌的抗原—菌毛抗原。
*特殊结构和功能：
*8.性丝：只存在于大肠杆菌与其他肠道细菌的雄株菌的表面。性丝的结构与菌毛相似，但一般性丝数目较少、较长和较宽，决定产生性丝的基因位于接合型质粒的转移功能区中。性丝为革兰氏阴性菌的成功接合所必需。有的致病菌还通过性丝附着于人体组织上。
*9.糖被：有的细菌在细胞壁外分泌一个厚度不定的富含水分的多糖黏胶外层——糖被。产糖被细菌在固体培养基上形成表面湿润、有光泽、黏液状的光滑型，即S型菌落。不产糖被的细菌形成表面干燥、粗糙的粗糙型，即R型菌落。糖被物质不易着色但用负染法在光镜下可见。糖被有3种：1.荚膜或大荚膜2.微荚膜3.黏液层
*10.伴孢晶体：少数芽孢杆菌在形成芽孢的同时，会在芽孢旁形成一颗菱形、方形或不规则形的碱溶性蛋白质晶体，称为伴孢晶体。是毒性蛋白，苏云金芽孢杆菌可作为消灭昆虫的菌剂，就是利用了该性质。
*11.细菌L—型:&是细菌在某些环境条件下所形成的变异型，是遗传性稳定的细胞壁缺损细菌，在固体培养基上形成“油煎蛋”似的小菌落。细菌形成L型大多染成革兰阴性。
*12.细菌内、外毒素的特性。
内毒素是多数革兰阴性菌细胞壁的脂多糖组分，只有当细菌死亡裂解后才大量释放到细
外毒素是多数革兰阳性菌和少数革兰阴性菌在生长繁殖过程中产生并分泌到胞外的毒素，其化学成分为蛋白质。
革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌区别：
革兰氏染色反应
厚，层次多
薄，一般单层
脂多糖、脂蛋白
外膜（外壁）
对青霉素,磺胺、环丝氨酸
外毒素为主
内毒素为主
&#9734;&#9734;&#9734;3.&了解和掌握原核生物的现代分类体系与鉴定的基本程序和方法。包括革兰氏染色、形态观察、生理测定、生化活性分析、细胞化学分析、核酸(RNA/DNA)分析、蛋白质分析等表观和分子信息在分类鉴定中的综合应用。了解原核微生物的命名法规。
3.1&细菌的革兰氏染色机制：
阳性：肽聚糖的含量与交联程度都比较高，肽聚糖层多，所以细胞壁较厚，壁上的间隙较小，
&&&&&媒染后形成的结晶紫—碘复合物就不易被洗脱出细胞壁，加上它本来就不含脂质，乙醇洗脱时细胞壁非但没有出现缝隙，反而使肽聚糖层的网孔因脱水而变得通透性更小，结果蓝紫色的结晶紫—碘复合物就留在细胞内而使细胞呈蓝紫色。
阴性：肽聚糖含量与交联程度较低，层次也少，故其壁较薄，壁上的孔隙较大，再加上细胞壁的脂质含量高，乙醇洗脱后，细胞壁因脂质被溶解而孔隙更大，所以结晶紫—碘复合物极易洗脱出细胞壁，乙醇脱色后细胞成无色，经过番红复染，结果就呈现红色。
方法：将细菌涂片、干燥和固定后，先用结晶紫初染，再经碘液酶染，后用95%的乙醇脱色，最后用苯酚复红或沙黄复染，干燥后置显微镜下观察。
结果判断：镜下呈紫色的为革兰阳性菌；呈红色为革兰阴性菌。
意义：&#9312;有助于细菌分类。&#9313;了解细菌的致病性。&#9314;为临床选择用药提供参考。
3.2形态结构和培养特性观察&
１）、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。&
２）、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。&
不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。&
&&（１）细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。
（２）霉菌酵母菌的培养特征：&
大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。&
霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。&
3.3细菌的生理生化实验
&&&&各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。
1）．糖（醇、苷）类发酵试验：
(1)原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等。将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35&#8451;孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。
(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。不分解糖则无变化。
(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵&不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。
2）．葡萄糖代谢类型鉴别试验
(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。本试验又称氧化发酵（O/F或Hugh－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。
(2)方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一管加入高度至少为0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开放管）。置35&#8451;孵箱孵育48h以上。
(3)结果：两管培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；两管都产酸（变黄）为发酵型；加液体石蜡管不产酸，不加液体石蜡管产酸为氧化型。
(4)应用：主要用于肠杆菌科与其它非发酵菌的鉴别。肠杆菌科、弧菌科细菌为发酵型，非发酵菌为氧化型或产碱型。也可用于鉴别葡萄球菌（发酵型）与微球菌（氧化型）。
3）．甲基红（MR）试验
(1)原理：某些细菌在糖代谢过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步被分解为甲酸、乙酸和琥珀酸等，使培养基pH下降至4.5以下时，加入甲基红指示剂呈红色。如细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质（如醇、醛、酮、气体和水），培养基pH在&5.4以上，加入甲基红指示剂呈桔黄色。
(2)方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35&#8451;孵育48h~96h后，于5ml培养基中滴加5~6滴甲基红指示剂，立即观察结果。
(3)结果判定：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔红色为弱阳性。
(4)应用：常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别，如大肠埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志贺菌属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等为阳性。
4）．β－半乳糖苷酶试验（ONPG试验）
(1)原理：乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和β－半乳糖苷酶才能快速分解。有些细菌只有半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-β-D-半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG）而生成黄色的邻硝基酚。用于枸橼酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。
(2)方法：将待试菌接种于ONPG肉汤中，35&#8451;水浴或孵箱孵育18~24h，观察结果。
(3)结果：呈现亮黄色为阳性，无色为阴性。
(4)应用：可用于迟缓发酵乳糖细菌的快速鉴定，本法对于迅速及迟缓分解乳糖的细菌均可短时间内呈现阳性。埃希菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属、哈夫尼亚菌属、沙雷菌属和肠杆菌属等均为试验阳性，而沙门菌属、变形杆菌属和普罗威登斯菌属等为阴性。
5）．VP试验
(1)原理：测定细菌产生乙酰甲基甲醇的能力。某些细菌如产气肠杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲基甲醇。在碱性条件下，乙酰甲基甲醇被氧化成二乙酰，进而与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物。即V-P试验阳性。
(2)方法：将待检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中，35&#8451;孵育24~48h，加入50g/Lα－萘酚（95％乙醇溶液）0.6ml，轻轻振摇试管，然后加0.2ml&400g/L&KOH，轻轻振摇试管30s至1min，然后静置观察结果。
(3)结果：红色者为阳性，黄色或类似铜色为阴性。
(4)应用：主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别。本试验常与MR试验一起使用，一般情况下，前者为阳性的细菌，后者常为阴性，反之亦然。但肠杆菌科细菌不一定都这样规律，如蜂房哈夫尼亚菌和奇异变。
3.4核酸(RNA/DNA)分析、蛋白质分析
&&&&与表型特征不同，微生物基因型通常不受生长培养基或分离物活性的影响，只需分离到纯菌落便可用于分析。由于大部分微生物物种中核酸序列是高度保守的，所以&DNA&DNA&杂交、聚合酶链反应、16S&rRNA&序列和&18S&rRNA&序列、多位点序列分型、焦磷酸测序、DNA&探针和核糖体分型分析等基因型微生物鉴定方法理论上更值得信赖。
1）、&DNA&中&G+C&mol%&分析&&
&&&&每一个微生物种的&DNA&中&GC&mol%&的数值是恒定的，不会随着环境条件、培养条件等的变化而变化，而且在同一个属不同种之间，&DNA&中&GCmol%&的数值不会差异太大，可以某个数值为中心成簇分布，显示同属微生物种的&GC&mol%&范围。&DNA&中&GC&mol%&分析主要用于区分细菌的属和种，因为细菌&DNA&中&GC&含量的变化范围一般在&25&％～&75&％；而放线菌&DNA&中的&GC&比例范围非常窄&(37&％～&51%)&。一般认为任何两种微生物在&GC&含量上的差别超过了10％，这两种微生物就肯定不是同一个种。因此可利用&G+C&mol％来鉴别各种微生物种属间的亲缘关系及其远近程度。值得注意的是，亲缘关系相近的菌，其&G+C&mol&％含量相同或者近似，但&G+C&mol％相同或近似的细菌，其亲缘关系并不一定相似，这是因为这一数据还不能反映出碱基对的排列序列，而且如放线菌的&DNA&的&GC&mol%&在&37&～&51&之间，企图在这么小的范围内区分放线菌的几十个属显然是不现实的。要比较两种细菌的&DNA&碱基对排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸杂交试验。&
2）、DNA-DNA&杂交&&
DNA&杂交法的基本原理是用&DNA&解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的&DNA&在体外加热解链，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配对结合成双链&DNA&，然后根据能生成双链的情况，检测杂合百分数。如果两条单链&DNA&的碱基顺序全部相同，则它们能生成完整的双链，即杂合率为&100%&。如果两条单链&DNA&的碱基序列只有部分相同，则它们能生成的“双链”仅含有局部单链，其杂合率小于&100%&。由此；杂合率越高，表示两个&DNA&之间碱基序列的相似性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。如两株大肠埃希氏菌的&DNA&杂合率可高达&100&％，而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的&DNA&杂合率较低，约有&70&％。&G+Cmol&％的测定和&DNA&杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新的途径，解决了以表观特征为依据所无法解决的一些疑难问题，但对于许多属以上分类单元间的亲缘关系及细菌的进化问题仍不能解决。
3）&、&DNA&—&rRNA&杂交&&
目前研究&RNA&碱基序列的方法有两种。一是&DNA&与&rRNA&杂交，二是&16S&rRNA&寡核苷酸的序列分析。&DNA&与&rRNA&杂交的基本原理、实验方法同&DNA&杂交一样，不同的是&#9312;&是&DNA&杂交中同位素标记的部分是&DNA&，而&DNA&与&rRNA&杂交中同位素标记的部分是&rRNA&。&#9313;&DNA&杂交结果用同源性百分数表示，而&DNA&与&rRNA&杂交结果用&Tm(e)&和&RNA&结合数表示。&Tm(e)&值是&DNA&与&rRNA&杂交物解链一半时所需要的温度。&RNA&结合数是&100&m&gDNA&所结合的&rRNA&的&m&g&数。根据这个参数可以作出&RNA&相似性图。在&rRNA&相似性图上，关系较近的菌就集中到一起。关系较远的菌在图上占据不同的位置。用&rRNA&同性试验和&16SrRNA&寡核苷酸编目的相似性比较&rRNA&顺反子的实验数据可得到属以上细菌分类单元的较一致的系统发育概念，并导致了古细菌的建立。
4&）、&16SrRNA(16S&rDNA)&寡核苷酸的序列分析&&
首先，&16S&rRNA&普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是&18S&rRNA&）中。&rRNA&参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在&16S&rRNA&分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。第三，&16S&rRNA&的相对分子量大小适中，约&1&540&个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。&&
分离菌株&16S&rRNA&基因的分离较为简单。从平板中直接挑取一环分离菌株细胞&,&加入&100μL&无菌重蒸&H&2&O&中&,&旋涡混匀后&,&沸水浴&2min,&12&000r&min&-1&离心&5min,&上清液中即含&16S&rRNA&基因，可直接用于&PCR&扩增。分离菌株&16S&rRNA&基因的&PCR&扩增和序列测定的一般步骤为：&16S&rRNA&基因的&PCR&物：&5'-AGAGT&TTGAT&CCTGG&CTCAG-3'&；
&5'-AAGGA&GGTGA&TCCAG&CCGCA-3'&。扩增反应体积&50&m&L&，反应条件为&95&&#8451;预性&5min&，&94&&#8451;变性&1min&，&55&&#8451;退火&1min&，&72&&#8451;延伸&2min&，共进行&29&个循环，&PCR&反应在&PTC-200&型热循环仪上进行。取&5&m&L&反应液在&10g&L&-1&的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。&PCR&产物测序可由专门技术公司完成。
目前已有的基于碳源利用和生化反应特征的鉴定方法，如气相色谱法分析微生物的脂肪酸特征、&MALDI-TOF&质谱法分析微生物蛋白等微生物鉴定系统，&在进行结果判断时需借助于系统自身的鉴别数据库，还依赖特定的培养基和培养方法以确保鉴定结果的一致性。
3.6血清学试验&
&&&&&血清学反应是指：相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。&&&
血清学反应的一般特点：&
1)抗原体的结合具有特异性，当有共同抗原体存在时，会出现交叉反应。
2)抗原体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的。&
3)抗原体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。&
4)血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。第一阶段为抗原体特异性结合阶段，反应速度很快，只需几秒至几分钟反应即可完毕，但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢，需几分、几十分以至更长时间。而且，在第二阶段反应中，电解质、PH、温度等环境因素的变化，都直接影响血清学反应的结果。&&&
习惯上将经典的血清学反应分三种类别：凝集反应、沉淀反应和补体结合反应。&
１、凝集反应&
&&颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应（Agglutination&reaction）。其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。在该反应中，因为单位体积抗体量大，做定量实验时，应稀释抗体。&
&&１）直接凝集反应&
&&颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的反应，称为直接凝集反应(Direct&agglution&reaction)。&a.玻片凝集法。是一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。如将含有痢疾杆菌抗体的血清与待检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分种后若出现肉眼可见的凝集块，即阳性反应，证明该菌是痢疾杆菌。此法快速、简便，但不能进行定量测定。&
b.试管凝集法。是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。如肥达氏反应就是诊断伤寒、付伤寒的试
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