发一篇中文综述,介绍一种新型电子显微镜镜的原理和在生物学领域的应用,那种杂志?怎么发?

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随时随地聊科研显微镜的用途 用处多少
核心提示:显微镜在初中的化学或者物流课堂上有用过,一般平常人也不拥有显微镜,所以关于显微镜的用途和应用领域在那里还是不太清楚,下面来介绍一下关于显微镜的用处,如果对微小而用肉眼不到的东西可以买一个显微镜来研究,这样对生活的认识就会有更好的提高,说不定因此就喜欢上了显微镜!& & 显微镜在初中的化学或者物流课堂上有用过,一般平常人也不拥有显微镜,所以关于显微镜的用途和应用领域在那里还是不太清楚,下面来介绍一下关于显微镜的用处,如果对微小而用肉眼不到的东西可以买一个显微镜来研究,这样对生活的认识就会有更好的提高,说不定因此就喜欢上了显微镜!
& & &&光学显微镜是精密的光学仪器,主要用于微观物质的观察(包括精密零件、动植物细胞、细菌等)。
& & & &显微镜是由一个透镜或几个透镜的组合构成的一种光学仪器,是人类进入原子时代的标志。主要用于放大微小物体成为人的肉眼所能看到的仪器。显微镜分光学显微镜和电子显微镜:光学显微镜是在1590年由荷兰的杨森父子所首创。现在的光学显微镜可把物体放大1600倍,分辨的最小极限达0.1微米,国内显微镜机械筒长度一般是160mm。  光学显微镜的种类很多,除一般的外,主要有:
& 暗视野显微镜,一种具有暗视野聚光镜,从而使照明的光束不从中央部分射入,而从四周射向标本的显微镜。
荧光显微镜,以紫外线为光源,使被照射的物体发出荧光的显微镜。电子显微镜是在1931年在德国柏林由克诺尔和哈罗斯卡首先装配完成的。这种显微镜用高速电子束代替光束。由于电子流的波长比光波短得多,所以电子显微镜的放大倍数可达80万倍,分辨的最小极限达0.2纳米。1963年开始使用的扫描电子显微镜更可使人看到物体表面的微小结构。&
双筒解剖显微镜:解剖较小标本或观察玻片标本的全貌时,需使用解剖显微镜,以观察自然状态下较小的实体(正像)和较大的玻片标本,或解剖细小生物。
  暗视野显微镜:是一种具有暗视集中器或中央遮光板的显微镜。即在聚光镜上加一特殊装置,使光线从集光器透镜的边缘衍射或反射到标本上,经标本反射投入物镜内,使整个视野变暗,故能在视野中见到被检物体衍射之图像。这种显微镜可观察运动着的有机体。
  & &荧光显微镜:其特点是以紫外光为光源,利用紫外光照射,使标本内的荧光物质激发出不同颜色的荧光,以研究标本内某些物质的特征和位置。有些物质本身能发出荧光,有些物质需经荧光染料染色后才能发出荧光。
  相差显微镜:活细胞在普通光镜下,一般不能分辨其细微结构。这是由于各细微结构的折光性很近似或对比不够显著的缘故。相差显微镜则是在聚光器下装一个环状光栏,其物镜是安有相板的相差物镜。环状光栏的作用是造成空心的光线锥,使直射光和衍射光分离。相板的作用是使直射光和衍射光发生干涉,导致相位差变成振幅差(即明暗差),使反差加强。所以,可以观察活细胞中不同染色的微细结构。
 倒置显微镜:物镜位于标本的下方,而光源位于标本的上方。主要用于细胞培养时观察培养瓶中细胞的生长情况。
■主要用途
显微镜被用来放大微小物体的图像。一般应用于生物、医药、微观粒子等观测。
(1)利用微微动载物台之移动,配全目镜之十字座标线,作长度量测。
(2)利用旋转载物台与目镜下端之游标微分角度盘,配全合目镜之址字座标线,作角度量测,令待测角一端对准十字线与之重合,然再让另一端也重合。
(3)利用标准检测螺纹的节距、节径、外径、牙角及牙形等尺寸或外形。
(4)检验金相表面的晶粒状况。
(5)检验工件加工表面的情况。
(6)检测微小工件的尺寸或轮廓是否与标准片相符。
显微镜的主要分类、功能及应用领域
随着人类的发展,显微镜的种类也越来越多,可观察的范围也越来越广,我们对光学显微镜的分类作一个了解。
(一)、按使用目镜的数目可分为单目、双目和三目显微镜。
单目价格比较便宜,可以作为初学爱好者的选择,双目稍贵点,观察的时候两眼可以同时观察,观察得舒适些,三目又多了一目,它的作用主要是连接数码相机或电脑用,比较适合长时间工作的人员选用。
(二)、根据其用途以及应用范围分为生物显微镜、金相显微镜、体视显微镜等。
1、生物显微镜是最常见的一种显微镜,在很多实验室中都可以见到,主要是用来观察生物切片、生物细胞、细菌以及活体组织培养、流质沉淀等的观察和研究,同时可以观察其他透明或者半透明物体以及粉末、细小颗粒等物体。生物显微镜供医疗卫生单位、高等院校、研究所用于微生物、细胞、细菌、组织培养、悬浮体、沉淀物等的观察,可连续观察细胞、细菌等在培养液中繁殖分裂的过程等。在细胞学、寄生虫学、肿瘤学、免疫学、遗传工程学、工业微生物学、植物学等领域中应用广泛。
2、体视显微镜又称为实体显微镜、立体显微镜,是一种具有正像立体感的目视仪器,广泛的应用于生物学、医学、农林等。它具有两个完整的光路,所以观察时物体呈现立体感。主要用途有:①作为动物学、植物学、昆虫学、组织学、考古学等的研究和解剖工具。②做纺织工业中原料及棉毛织物的检验。③在电子工业,做晶体等装配工具。④对各种材料气孔形状腐蚀情况等表面现象的检查。⑤对文书纸币的真假判断。⑥透镜、棱镜或其它透明物质的表面质量,以及精密刻度的质量检查等。
3、金相显微镜主要是用来鉴定和分析金属内部结构组织,是金属学研究金相的重要仪器,是工业部门鉴定产品质量的关键设备,专门用于观察金属和矿物等不透明物体金相组织的显微镜。这些不透明物体无法在普通的透射光显微镜中观察,故金相和普通显微镜的主要差别在于前者以反射光,而后者以透射光照明。不仅可以鉴别和分析各种金属、合金材料、非金属物质的组织结构及集成电路、微颗粒、线材、纤维、表面喷涂等的一些表面状况,金相显微镜还可以广泛地应用于电子、化工和仪器仪表行业观察不透明的物质和透明的物质。如金属、陶瓷、集成电路、电子芯片、印刷电路板、液晶板、薄膜、粉末、碳粉、线材、纤维、镀涂层以及其它非金属材在金相显微镜中照明光束从物镜方向射到被观察物体表面,被物面反射后再返回物镜成像。所以用金相显微镜来检验分析金属内部的组织结构在工业生产中是十分重要的。体视显微镜在工业生产中也可以用到,但是它只是用来观察金属表面划伤、划痕等,放大倍数一般在10X-50X之间,金相的放大倍数一般在40X-400X,有些可以达到800X。
(三)、按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉对比显微镜等
1、偏光显微是鉴定物质细微结构光学性质的一种显微镜。凡具有双折射性的物质,在偏光显微镜下就能分辨的清楚,当然这些物质也可用染色法来进行观察,但有些则不可能,而必须利用偏光显微镜。主要用于研究透明与不透明各向异性材料。一般具有双折射的物质都可以用这种显微镜进行观察。双折射性是晶体的基本特征。因此,偏光显微镜被广泛地应用在矿物、化学等领域,如在植物学方面,如鉴别纤维、染色体、纺锤丝、淀粉粒、细胞壁以及细胞质与组织中是否含有晶体等。在植物病理上,病菌的入侵,常引起组织内化学性质的改变,可以偏光显微术进行鉴别。在人体及动物学方面,常利用偏光显微术来鉴别骨骷、牙齿、胆固醇、神经纤维、肿瘤细胞、横纹肌和毛发等。  摘 要 激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图象分析仪器,现已广泛应用于荧光定量测量、共焦图象分析、三维图象重建、活细胞动力学参数监测和胞间通讯研究等方面。其性能为普遍光学显微镜质的飞跃,是电子显微镜的一个补充。本文以美国Meridian公司的ACAS ULTIMA312为例简要介绍了激光扫描共聚显微镜系统的结构,功能和生物学应用前景。
  关键词 激光;共聚焦显微镜;粘附细胞分析与筛选(ACAS)
The Laser Scanning Confocal Microscopy System and its Biological Applications
Chen Yaowen ,Lin Jielong ,Lai Xiaoying ,Mei Pinchao
(Shantou Uni.Med .College,Central Lab ,Shantou Guangdong 515031)
  Ahstract The Laser Scanning Confocal Microscopy is a new medical image analysis instrument ,which is developed in the last decade.Now it is widely applied in such fields as fluorescent quantitative measurement ,conpocal image andlyusis ,3-D reconstruction ,Kinetic signal monitioring of living cell ,cellcell communication researches ,etc .In this paper ,ACSA ULTIMA 312(Meridian Co,USA)is taken as an example to introduce the principle of confocal microscopy ,its funetions and biological applications.
  Key words Laser Confocal Microscopy Adherent Cell Analysis and sorting(ACSA)
  激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning Confocal Microscopy ,简称LSCM)是近代生物医学图象仪器的最重要发展之一,它是在荧光显微镜成象的基础上加装激光扫描装置,使用紫外光或可见光激发荧光探针,利用计算机进行图象处理,从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图象,以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化。已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域[1、2、3],对生物样品进行定性、定量、定时和定位研究具有很大的优越性,为这些领域新一代强有力的研究工具。
  创建于1983年的美国Meridian公司,在90年代推出的“激光扫描共聚焦显微镜”这一项具有划时代的义意的高科技产品,曾获得美国“政府新产品奖”和两次“高科技领先技术奖”,它能达到每秒120幅画面的高速扫描激光共聚焦观察,可提供实时,真彩色的激光共聚焦原色图象。我院最近引起的ACAS uLTIMA312是Meridian公司最新的高科技产品,为同类仪器中档次最高、功能最全的精密仪器。现以该仪器为例介绍激光扫描共聚焦显微镜系统及其在细胞生物学中的应用。
  1、激光扫描共聚焦显微镜成像原理及组成
  有关共聚焦显微镜的某些技术原理,早在1957年就已提出,二十年后由Brandengoff在高数值孔径透镜装置上改装成功具有高清晰度的共聚焦显微镜[5],1985年Wijnaendts Van Resandt发表了第一篇有关激光扫描共聚焦显微镜在生物学中应用的文章,到了1987年,才发展成现在通常意义上的第一代激光扫描共聚焦显微镜。
  激光扫描共聚焦显微镜成像原理如图1所示,激光器发出的激光束经过扩束透镜和光束整形镜,变成一束直径较大的平行光束,长通分色反射镜使光束偏转90度,经过物镜会聚在物镜的焦点上,样品中的荧光物质在激光的激发下发射沿各个方向的荧光,一部分荧光经过物镜、长通分色反射镜、聚焦透镜、会聚在聚焦物镜的焦点处,再通过焦点处的针孔,由检测器接收。
  从图1中可以看出,只有在物镜的焦平面上发出的荧光才够到达检测器,其它位置发出的光均不能过针孔。由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上,因而称这种方式成像的显微镜为共聚焦显微镜为共聚显微镜。在成像过程中针孔起着关键作用,针孔直径的大小不仅决定是以共聚焦扫描方式成像还是以普遍学显微镜扫描方式成像,而且对图像的对比度和分辨率有重要的影响。
  ACAS ULTIMa 312采用快速镜扫描或台阶扫描对样品逐点扫描成像,由于样品中不同的扫描点始终在物镜和会聚透镜的光轴上,因而它以相同的信噪比扫描整个样品,扫描精度达0.1μm,扫描面积最大的为10cm×8cm,当激光逐点扫描样品时,针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像,并将之转化为数字信号传输至计算机,最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚聚焦图像。一个微动步进马达控制栽物台的升降,使焦平面依次位于标本的不同层面上,可以逐层获得标本相应的光学横断面的图像。这称为“光学切片”。再利用计算机的图像处理及三维重建软件。可以得到高清晰度来表现标本的外形剖面,十分灵活、直观地进行形态学观察。
  2、激光扫描共聚焦显微镜硬件和软件系统
  2.1 ACAS ULTIMa 312硬件及参数指标  激光光源:氩离子激光(50mW的紫外光、999 mW的可见光),能同时/顺序/分别输出紫外光和可见光,激发波长为351-364nm;488nm;514nm。  计算机系统:MHz PCI/80MB RAM/2000MB SCSI硬盘/150MB Bernoulli盘驱动器/17’’大屏幕显示器。  共聚焦系统:计算机自动控制光路准调节;计算机控制孔径校准;计算机调节孔径大小;自动Z轴调节(最小0.1μm)。  光学探测系统:3个测窗式PMT采集荧光;1个CCD系统;12位的高速A/D转换器。  图像分辨率:图像大小;像素最小距离:0.1μm;灰度为4096级。  扫描方式:快速镜扫描Dual Scan台阶扫描;扫描精度0.1μm;扫描面积最大为10cm×8cm ;扫描平面:XY和XZ和独特点、线、面扫描。2.2激光扫描共聚焦显微镜软件系统
  ACAS ULTIMa 312系统采用独特设计的软件将激光细胞仪与先进的计算机技术结合,产生快速、高效、灵活的操作系统,完备的数据采集、分析与管理功能。基于生物医学研究有如下的软件。
  Image Analyze―对于单色、比色和三色标记的二维荧光图像的定量分析,可产生透射光图像重叠,同时Auto Image可多个区域的自动扫描和荧光定量,以及相同区域的时间顺序扫描。  Ratio Analysis和 Kinetics―测定细胞内的离子变化,可有点扫描、线扫描及图像扫描三种测定形式,以监测各种速率的生物反应。  Cell CCell Communication and FRAP-相邻细胞的FRAP分析。该软件首先用可光淬灭特异的细胞荧光,然后在多个时间点扫描,此扫描可对单一区域或细胞的多个选择区域,可产生透射光图像并与其它图像重叠。  Cell List―储存被选择细胞的位置,即可自动对较大样品进行扫描,又可产生较小样品特异部位的网络位置表,以进行自动的测量、筛选和重复测定。  Cell Sorting―ACAS具备如下四种分选方式:  Ablation Sort:预选定义一个荧光阈值 ,然后对特定细胞杀伤。②CookieCutter Sort在用户定义的中心点四周切割Cookies。③Quick Sort:对已定义的细胞表列,用Ablation或Cookie Cutter作分选。④Manual Sort:直接使用鼠标控制载物台位置及激光脉冲,并杀灭和分选细胞,进行细胞显微外科,染色体切割和光隐阱等操作。  Confocal Imaging―共聚焦分析,可实现Z轴定量,三维立体图像分析(包括SFP模拟荧光处理法,DP深度投影法和SP文体投影法),以及视点移动动画。
  3 激光扫描共聚焦显微镜在细胞生物学中的应用
  3.1 定量荧光测量
  ACAS可进行重复性极佳的低光探测及活细胞荧光定量分析。利用这一功能既可对单个细胞或细胞群的溶酶体,线粒体、DNA、RNA和受体分子含量、成份及分布进行定性及定量测定,还可测定诸如膜电位和配体结合等生化反应程度。此外,还适用于高灵敏度快速的免疫荧光测定,这种定量可以准确监测抗原表达,细胞结合和杀伤及定量的形态学特性,以揭示诸如肿瘤相关抗原表达的准确定位及定量信息。
  3.2 定量共聚焦图像分析
  借助于ACAS 激光共焦系统,可以获得生物样品高反差、高分辨率、高灵敏度的二维图像。可得到完整活的或固定的细胞及组织的系列及光切片,从而得到各层面的信息,三维重建后可以揭示亚细胞结构的空间关系。能测定细胞光学切片的物理、生物化学特性的变化,如DNA含量、RNA含量、分子扩散、胞内离子等,亦可以对这些动态变化进行准确的定性、定量、定时及定位分析。
  3.3 三维重组分析生物结构
  ACAS使用SFP进行三维图像重组,SFP将各光学切片的数据组合成一个真实的三维图像,并可从任意角度观察,也可以借助改变照明角度来突出其特征,产生更生动逼真的三维效果。
  3.4 动态荧光测定
  Ca2+ 、pH 及其它细胞内离子测定,利用ACAS能迅速对样品的点,线或二维图像扫描,测量单次、多次单色、双发射和三发射光比率,使用诸如Indo-1、BCECF 、Fluo-3等多种荧光探针对各种离子作定量分析。可以直接得到大分子的扩散速率,能定量测定细胞溶液中Ca2+对肿瘤启动因子、生长因子及各种激素等刺激的反应,以及使用双荧光探针Fluo-3和CNARF进行Ca2+和pH的同时测定。
  3.5 荧光光漂白恢复(FRAP)--活细胞的动力学参数
  荧光光漂白恢复技术借助高强度脉冲式激光照射细胞某一区域,从而造成该区域荧光分子的光淬灭,该区域周围的非淬灭荧光分子将以一定速率向受照区域扩散,可通过低强度激光扫描探测此扩散速率。通过ACAS可直接测量分子扩散率、恢复速度,并由此而揭示细胞结构及相关的机制。
  3.6 胞间通讯研究
  动物细胞中由缝隙连接介导的胞间通讯被认为在细胞增殖和分化中起非常重要的作用。ACAS可用于测定相邻植物和动物细胞之间细胞间通讯,测量由细胞缝隙连接介导的分子转移,研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通讯的抑制作用,以及胞内Ca2+ ,PH和cAMP水平对缝隙连接的调节作用。
  3.7 细胞膜流动性测定
  ACAS设计了专用的软件用于对细胞膜流动性进行定量和定性分析。荧光膜探针受到极化光线激发后,其发射光极性依赖于荧光分子的旋转,而这种有序的运动自由度依赖于荧光分子周围的膜流动性,因此极性测量间接反映细胞膜流动性。这种膜流动性测定在膜的磷脂酸组成分析、药物效应和作用位点,温度反应测定和物种比较等方面有重要作用。
  3.8 笼锁―解笼锁测定
  许多重要的生活物质都有其笼锁化合物,在处于笼锁状态时,其功能被封闭,而一旦被特异波长的瞬间光照射后,光活化解笼锁,使其恢复原有活性和功能,在细胞的增值、分化等生物代谢过程中发挥功能。利用ACAS可以人为控制这种瞬间光的照射波长和时间,从而达到人为控制多种生物活性产物和其它化合物在生物代谢中发挥功能的时间和空间作用。
  3.9 粘附细胞分选
  ACAS是目前唯一能对粘附细胞进行分离筛选的分析细胞学仪器,它对培养皿底的粘附细胞有两种分选方法:(1)Coolie-CutterTM法,它是Meidian公司专利技术,首先将细胞贴壁培养在特制培养皿上,然后用高能量激光的欲选细胞四周切割成八角形几何形状,而非选择细胞则因在八角形之外而被去除,该分选方式特别适用于选择数量较少诸如突变细胞、转移细胞和杂交瘤细胞,即使百万分之一机率的也非常理想。(2)激光消除法,该方法亦基于细胞形态及荧光特性,用高能量激光自动杀灭不需要的细胞,留下完整活细胞亚群继续培养,此方法特别适于对数量较多细胞的选择。
  3.10 细胞激光显微外科及光陷阱技术
  借助ACAS可将激光当作“光子刀”使用,借此来完成诸如细胞膜瞬间穿孔、切除线粒体、溶酶体等细胞器、染色体切割、神经元突起切除等一系列细胞外科手术。通过ACAS光陷阱操作来移动细胞的微小颗粒和结构,该新技术广泛用于染色体、细胞器及细胞骨架的移动。
  4、结语
  激光扫描共聚焦显微镜是近十年发展起来的医学图像分析仪器,与传统的光学显微镜相比,大大地提高了分辨率,能得到真正具有三维清晰度的原色图象。并可探测某些低对比度或弱荧光样品,通过目镜直接观察各种生物样品的弱自发荧光。能动态测量Ca2+ 、pH值,Na1+、Mg2+等影响细胞代谢的各种生理指标[9],对细胞动力学研究有着重要的意义。同时激光扫描共聚显微镜可以处理活的标本,不会对标本造成物理化学特性的破坏,更接近细胞生活状态参数测定。可见激光扫描共聚焦显微镜是普遍显微镜上的质的飞跃,是电子显微镜的一个补充,现已广泛用于荧光定量测量,共焦图像分析,三维图像重建、活细胞动力学参数分析和胞间通讯研究等方面,在整个细胞生物学研究领域有着广阔的应用前景。
References
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