荧光分子探针技术在基因表达产物研究中的应用--《湖南大学》2007年博士论文
荧光分子探针技术在基因表达产物研究中的应用
【摘要】：
现代科学认为:许多疾病的发生与细胞内的基因结构和表达水平变化有着直接的联系。但是,如何借助有效的研究手段,从分子水平上实时、灵敏、特异地获取这些信息变化,尤其是基因表达信息的变化,已经成为医学研究所面临的严峻挑战,同时也为分析化学加强与医学的融合提供了新的机遇。荧光分子探针技术作为一种灵敏、准确的研究手段和方法,结合生物大分子的一些特殊生化性质,如核酸杂交、核酸-蛋白质的相互作用、蛋白质(酶)对底物的特异性识别和切割等,将生物分子信息转变为易于检测的荧光信号,有望在获取基因表达产物信息方面取得突破。但是,由于受到荧光分子探针类型的限制和基因表达产物多样性的影响,目前基于荧光分子探针检测基因表达产物的方法还不多。因此,进一步发展可用于检测基因表达产物的荧光分子探针新方法、新技术和新原理是一项非常有意义的前瞻性研究工作。
本论文以细胞中能降低肿瘤发生风险的一类基因表达产物损伤修复蛋白为研究对象,利用这些蛋白的催化功能,结合研制新型荧光分子探针,从检测尿嘧啶糖苷酶(UDG)着手,以发展操作简单快速、灵敏度高、选择性好、而且样品量小的新方法为研究主线,利用新的双链荧光探针建立了损伤修复蛋白UDG、APE1和T4DNA连接酶的活性分析新方法,利用已有的分子信标探针开展了损伤修复蛋白hOGG1活性分析;同时利用分子信标开展了基因表达产物mRNA的定量检测研究。这种用于基因表达产物研究的荧光分子探针技术具有操作简单、快速、可实时监测等优点,一定程度上克服了基于放射性标记、凝胶电泳等经典分析方法费时、费力以及无法实时获取基因表达产物信息的缺陷。论文主要内容归纳如下:
第一部分荧光分子探针用于基因表达产物碱基损伤修复蛋白的检测
1、利用双链荧光探针建立了简单快速的UDG酶活性分析的新方法。UDG酶是一种能特异消除损伤碱基尿嘧啶的蛋白,在防止基因突变,调节免疫功能等方面具有重要意义。目前采用的放射性标记和电泳分析UDG酶活性的方法,不利于酶促反应过程实时监测和活性分析。本章设计双链荧光探针作为切割底物和检测分子,通过监测尿嘧啶切割过程中溶液荧光信号的变化,建立了UDG酶高灵敏分析方法,检测下限可达0.033U/mL;考察了反应溶液中金属离子、化学药物以及底物浓度等条件变化对切割反应初速度的影响,开展了UDG酶促反应机制和动力学过程研究;这种新方法还可快速、准确检测肿瘤细胞中UDG酶活性,检测灵敏度与放射性同位素法相当。以上结果不仅证明荧光分子探针技术用于碱基损伤修复蛋白活性检测的可行性,而且有望为临床诊断提供新的辅助手段。
2、利用双链荧光探针建立了简单、快速的APE1酶活性分析的新方法。APE1是细胞中水解AP位点的糖苷酶,主要参与碱基损伤修复、调节细胞周期、细胞凋亡等生命过程。为了避免传统的APE1酶活性分析方法操作复杂、费时的缺陷,我们以含有AP位点的双链荧光探针作为反应底物,在均相溶液中实时监测AP位点水解反应过程,建立了一种APE1酶活性分析的新方法,其线性检测范围为0.024-2U/mL,检测下限为0.024U/mL;通过考察和优化溶液的金属离子、化学药物以及底物浓度等实验条件,在均相溶液中实现了酶促反应机制和动力学过程研究;这种新方法还可用于肿瘤细胞中APE1活性水平的检测,与其他方法相比,该方法不仅灵敏度达到放射性同位素法的水平,而且特异性强、检测结果准确,有望在肿瘤早期诊断上发挥重要作用。
3、利用双链荧光探针建立了DNA连接酶活性分析的新方法。核酸连接是生命科学中倍受关注的生命活动。其活性分析和机理研究有助于进一步拓展核酸连接反应在疾病检测、基因载体及核酸修饰与分析等方面的应用。利用双链分子探针作为核酸连接的模板和信号分子,通过实时监测荧光信号降低来监测T4DNA连接酶反应过程,为连接酶活性分析、连接机理及其动力学过程研究提供了一种简便快捷的方法。
4、利用单链探针分子信标建立了简单、快速的hOGG1酶活性分析的新方法。根据hOGG1酶能切割损伤碱基8-oxoG和裂解DNA链双重功能的特性,将8-oxoG设计在分子信标茎部,发展了一种可作为hOGG1酶底物的新型荧光探针。通过实时监测hOGG1酶识别切割8-oxoG后引起的溶液荧光信号变化,建立了一种分析hOGG1酶活性的新方法,检测线性范围为0.0125-5U/mL,检测下限为0.0125U/mL;通过考察和优化反应溶液中金属离子、化学药物以等实验条件,开展了hOGG1酶促反应机制和动力学过程研究;这种新的荧光分析方法用于多种肿瘤细胞hOGG1活性水平准确检测的结果表明:这种新方法可望为临床肿瘤早期诊断提供辅助手段。
第二部分荧光分子探针用于基因表达产物mRNA的检测
5、利用分子信标体外定量检测肿瘤抑制基因ING1 mRNA的表达。基于肿瘤抑制基因ING1 mRNA的序列保守区设计合成分子信标,将其与体外转录的ING1 RNA杂交,得到了ING1分子信标/RNA杂交标准曲线;通过考察杂交缓冲溶液的离子强度、pH值以及其他核酸分子对分子信标与细胞mRNA杂交过程的影响和体系优化,在均相溶液中实现了ING1 mRNA表达水平的定量检测,并利用RT-PCR法验证了检测结果。与其他mRNA检测方法相比,该方法简单、快速,而且检测过程不经过扩增步骤,进一步保证了实验结果的准确,还能用于基因芯片来发展高通量的检测方法。
6、利用单链探针分子信标定量检测p21 mRNA的表达。为了进一步拓展分子信标在mRNA检测中的应用,在前一章的工作基础上,利用分子信标检测了p21 mRNA的表达水平。基于p21 mRNA的保守序列设计了分子信标,将其与通过基因重组和体外转录得到的p21 RNA杂交,构建了p21分子信标/RNA杂交标准曲线;通过考察杂交缓冲溶液的离子类型、浓度、pH值以及溶液中的核酸分子对分子信标检测法的影响和体系优化,在均相溶液中定量检测了基因转染和5-氟尿嘧啶处理的MCF-7细胞,以及RNAi处理的CNE2细胞中p21 mRNA的表达水平。这种检测技术操作简单,无需对细胞mRNA进行转录和扩增,即可直接实现靶基因mRNA表达水平的检测。
7、5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导的HNE1细胞ING1 mRNA表达变化检测与生物学特性分析。利用分子信标检测了5-氟尿嘧啶处理基因转染前后鼻咽癌HNE1总RNA杂交后引起的溶液荧光信号变化,用这种荧光信号变化值直接表示ING1 mRNA表达水平的高低;利用细胞生长速度检测法、流式细胞术、蛋白质杂交法和MTT法等分析手段考察ING1 mRNA表达变化对细胞生理特征的影响。对基于不同分析方法得到的实验结果进行比较分析,发现ING1 mRNA表达水平能作为判断细胞生长速度、细胞周期分布、蛋白质表达水平和对抗肿瘤药物敏感性的一个有效指标。
【关键词】：
【学位授予单位】：湖南大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2007【分类号】：Q78【目录】：
Abstract8-16
本文所用英文缩写词表16-18
第1章 绪论18-33
1.1 基因表达产物检测的重要性18-20
1.2 基因表达产物常用检测技术及其优缺点20-22
1.3 荧光分子探针技术及其在基因表达产物检测中的应用22-30
1.3.1 FRET 的发生原理22-23
1.3.2 FRET 能量供受体对的成员23-30
1.4 本论文拟开展的工作30-33
第2章 基于双链荧光探针对UDG 酶的活性分析33-44
2.1 前言33
2.2 实验部分33-36
2.2.1 实验设计原理33-34
2.2.2 仪器与试剂34
2.2.3 实验方法34-36
2.3 实验结果与讨论36-43
2.3.1 双链荧光探针发生FRET 效率的检测结果36-37
2.3.2 尿嘧啶切割反应的实时监测37-38
2.3.3 外界因子对尿嘧啶切割反应的影响38-39
2.3.4 UDG 酶活性分析39-40
2.3.5 反应机理与动力学模型的讨论40-41
2.3.6 肿瘤细胞中UDG 表达水平检测41-43
2.4 小结43-44
第3章 基于双链荧光探针对 APE1 酶的活性分析44-55
3.1 前言44
3.2 实验部分44-47
3.2.1 实验设计原理44-45
3.2.2 仪器与试剂45-46
3.2.3 实验方法46-47
3.3 实验结果与讨论47-53
3.3.1 UDG 酶作用对探针荧光信号的影响47-48
3.3.2 AP 位点水解反应的实时监测48-49
3.3.3 APE1 的活性定量分析49-50
3.3.4 外界因子对水解反应的影响50-51
3.3.5 化学药物对APE1 活性的影响51-52
3.3.6 反应机理与动力学模型的讨论52-53
3.3.7 肿瘤细胞中APE1 表达水平检测53
3.4 小结53-55
第4章 基于双链荧光探针对 T4DNA 连接酶的活性分析55-63
4.1 前言55
4.2 实验部分55-58
4.2.1 实验设计原理55-56
4.2.2 试剂与仪器56-57
4.2.3 实验方法57-58
4.3 实验结果与讨论58-62
4.3.1 双链荧光探针发生FRET 的效率检测58
4.3.2 T4 DNA 连接酶催化的连接反应实时监测58-59
4.3.3 金属离子对DNA 连接反应的影响59-60
4.3.4 药物对DNA 连接反应的影响60-61
4.3.5 T4 DNA 连接酶的活性分析61-62
4.4 小结62-63
第5章 基于分子信标对hOGG1 酶的活性分析63-71
5.1 前言63
5.2 实验部分63-66
5.2.1 实验原理63-64
5.2.2 试剂和仪器64-66
5.3 实验结果与讨论66-70
5.3.1 分子信标M81 的性能检测结果66
5.3.2 分子信标M81 热稳定性分析66
5.3.3 8-oxoG 切割反应的实时监测66-67
5.3.4 外界因子对hOGG1 酶活性的影响67
5.3.5 hOGG1 对80xoA 切割能力考察67-68
5.3.6 hOGG1 的活性分析68
5.3.7 酶促反应的动力学研究68-69
5.3.8 肿瘤细胞中hOGG1 表达活性分析69-70
5.4 小结70-71
第6章 基于分子信标对 ING1 m RNA 的定量检测..71-81
6.1 前言71-72
6.2 实验部分72-76
6.2.1 实验材料72
6.2.2 仪器与试剂72-73
6.2.3 实验方法73-76
6.3 结果与讨论76-80
6.3.1 转染ING1 的MCF-7 细胞系的建立76
6.3.2 ING1cRNA 的制备和标准曲线的建立76-77
6.3.3 MB/cRNA 杂交影响因子考察77-78
6.3.4 5-FU 处理MCF-7 细胞引起ING1 转录水平升高78
6.3.5 ING1 转染引起MCF-7 细胞中ING1 mRNA 水平升高78-79
6.3.6 抑制p53 基因表达引起ING1 转录水平下调79-80
6.4 小结80-81
第7章 基于分子信标对p21m RNA 的体外定量检测81-90
7.1 前言81
7.2 实验部分81-84
7.3 结果与讨论84-89
7.3.1 p21cDNA 的电泳检测和序列测定84-85
7.3.2 p21MB 特异性和热力学特性考察85-86
7.3.3 p21 MB/cRNA 杂交影响因子考察86-87
7.3.4 p21 cRNA/MB 杂交标准曲线的构建87
7.3.5 5-FU 处理MCF-7 细胞引起p21m RNA 水平升高87-88
7.3.6 ING1 高表达的MCF-7 细胞中p21m RNA 水平升高88
7.3.7 抑制p53 基因表达引起p21mRNA 水平下调88-89
7.4 小结89-90
第8章 基于分子信标对HNE1 细胞ING1mRNA 检测与生物学特性分析90-98
8.1 前言90
8.2 实验部分90-93
8.2.1 试剂和仪器90-91
8.2.2 实验方法91-93
8.3 结果与讨论93-97
8.3.1 应用MB 检测细胞中p331NG1 mRNA 的表达93-94
8.3.2 MB 用于固定化细胞中p331NG1m RNA 成像94
8.3.3 细胞生长速度测定和ING1 蛋白表达检测94-95
8.3.4 免疫组化法确定P53 蛋白的表达分布95
8.3.5 p33~(ING1) 高表达促使细胞周期停滞于G1 期95-97
8.4 小结97-98
结论98-100
参考文献100-116
附录 A 攻读学位期间发表的学术论文和授权专利116-118
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