图文大播报
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在这里我跪求前辈高手认真回复，我在这里跪谢！很急 我附上几张图片
本帖最后由 zppyw 于
08:29 编辑
先说下目前情况，体脂在16%，73.5kg，167cm
力量水平：深蹲无人保护，标准动作极限：130kg-140kg& &1-3次& &硬拉：125kg-1-3次& &卧推无人保护：120kg-1次
训练年数：1年零2个月
目前补剂：乳清蛋白、复合维生素、谷氨酰胺
训练组重量：小肌肉10-12rm&&大肌肉8-10rm
注：我是想参加比赛，真心爱这个东西，现在每天围着这个转了。
训练计划：
胸、二头：上斜、卧推、仰卧上拉、杠铃弯举、哑铃弯举、卷腹
腿、小腿：深蹲、弓步、腿弯举、站姿提踵
肩、三头：哑铃坐推、侧平举、直立划船、站姿推举、窄距卧推、站姿臂屈伸、反向卷腹
背、前臂：引体向上、俯身划船、硬拉、腕弯举、反向腕弯举、卷腹
这个是我目前在练的计划，只练了3个月，之前练的不是很标准，而且我不懂休息，竟然胸背一起练，一周2个循环
弄的身体很累，但是还是坚持了下来，后来慢慢懂后，开始写了计划，重新学习动作，现在可以非常标准了
肌肉收缩感觉明显，训练时泵感十足，第二天的酸胀痛每次训练都有，但是我现在最大的问题不是怎么练，而是怎么恢复的问题
照目前的计划，只要我超过每个动作3组，我的睡眠就出现问题，导致第二天没有精神，无法用大重量训练。
于是我放弃所有组数，老老实实从一组开始练，过了一个月再增加一组，我发现我在每个动作1-2组的时候睡眠
非常好，而且训练完神清气爽，第二天肌肉也是疼的。
我有以下几个问题：
1、按照计划，不算腹部的组数，每天的训练量差不多在8-10组左右，这个量也太低了，是我太弱，还是各位高手太强？
2、我非常想知道，我的训练计划有没有问题，为什么我的组数超过3组就失眠？我的训练 伙伴就没有这个问题，是我真的太弱了，
神经各方面比较弱吗？
3、我按照目前的训练计划下去，只练2组，可以吗？我现在就是在纠结这个问题，我现在想的是2组练几个月后，等身体水平上去后，再慢慢增加组数可以吗？
4、高手前辈们，你们刚开始也是直接4组吗？难道我的基础真的这么差吗？如果是的话 我愿意重新开始。
5、如果有上海的前辈，我愿意拜师，我真心爱这个东西，我觉得我有这个天赋的
我是真心求教，因为自己现在觉得不长了，我心情很不好 ，我所列举的目前的力量都是测试过的，而且都是标准动作状态。完全是没有吓吹牛的，深蹲的数据甚至都说的保守了。我希望大家仔细看看我写的计划再回答
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个人建议，大的肌肉群可以一天一练，胸、背、肩、二头和三头、腿，然后休息，腹部可以每天练，每天练的组数不超过二十组，一个肌肉群可以四五个动作，你试试一个月，我就是这么练的，还有计划也不是一成不变的，适合自己的才是最好的。
本帖最后由 swbshb888 于
20:01 编辑
楼主小兄弟先发些照片和视频看看吧，介绍一下身高体重，无图无视频都是纸上谈兵。根据你说的力量水品：深蹲130--140公斤1--3次 硬拉只能125公斤1--3次 卧推确可以120公斤1次 貌似很不合乎常理。我今年都47岁了我的训练计划是4天一个循环：第一天背部+二头（宽距引体累计50次）然后杠铃哑铃弯举各两组8-12重量，在杠铃划船6组10--12次的重量训练，最后硬拉4组结束。第二天肩部训练 大重量杠铃推举6组用4--6次的重量训练，4组颈后推举用8--10次的重量，接下来哑铃高次数肩部推举4组，杠铃提拉4组 最后侧平举和俯身侧平举各两组结束。第三天：腿部训练深蹲10组10X10。第四天胸部训练：热身以后选用一个最大极限只能推5次的重量做卧推训练用这个重量做5组（注意这个重量第一次做不可能每组都能推5次一般是第三组就只能推4次最后一组只能推3次了）然后减轻6公斤你又可以推5次了用这个重量在做5组（次数和前面一样一般是最后一组只能推3次了）然后和前面一样在减掉5--6公斤推5组。三个重量一共15组卧推， 然后做几组每组只能做8-10次的卧推组训练，目的是为胸部肌肉大量充血，最后做几组6--8次的上斜卧推和几组重量为10--12次的哑铃上斜卧推。最后做4组双杠臂屈伸进一步强化一下三头肌结束。腹肌我都是每天当热身单杠垂悬举腿几组。以上训练胸部训练大概需要70--80分钟，其余训练我都是50--60分钟里面完成。基本上都是每天早上5点多开始训练风雨无阻。我四天一个循环几乎从不休息身体没有任何疲劳感，训练结束半小时就恢复体力了。记得我2012年5月刚开始恢复训练的时候一天练两次，清晨大重量训练结束 晚上小重量训练半小时也没有疲劳感，2014年以来由于训练的重量加大了才改成一天训练一次，依旧是4天一个循环无休日。你说的每个动作只做2组对肌肉不会有什么强大刺激的 除非你做很多动作，但是练这个最有效的就是最基本的基础动作。每个动作两组是不会有效果的。你说的你训练组数多了晚上睡觉不好可能是你体质有关， 晚上睡不着有疲劳感你需要慢慢加强自己的体质。体质不好练这个影响你的工作和生活的。&&小兄弟我就是上海的，呵呵&&我都是靠日常饮食补充营养的。
不是高手，个人之见，建议你去问石瓦性格版主。
楼主这个身高和肌肉比例，做卧推、深蹲、硬拉是比较占便宜的，运动距离比长腿长胳膊的短，做功少。但这个重量，确实很普通。天赋如果有，也被你自己搞没了。
如果要冲击力量举，石版有个如何卧推150公斤的文章，很有价值。如果要健美，文章很多。你恢复慢可能和动作过多运动量太大有关，肩背如果是一次搞，13个动作，每个3组就是39组，这里面还包括引体，硬拉这种大运动量动作。为什么不拆开两天呢。
本帖最后由 swbshb888 于
22:41 编辑
不是高手，个人之见，建议你去问石瓦性格版主。
楼主这个身高和肌肉比例，做卧推、深蹲、硬拉是比较占便 ...
和身高有什么关系？卧推&&硬拉 深蹲有关系的是体重 如果楼主练了一年有这个力量那是绝对有天赋的 不过他硬拉也太弱了！只是他深蹲 卧推 硬拉无图无视频难辨真假如果是真的绝对有天赋。看看体重和力量的换算表格吧一次的极限力量（公斤）：
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22:38 上传
力量和身高也是有关系的，深蹲和硬拉同体重身高矮的相对占优势！&
和身高有什么关系？卧推&&硬拉 深蹲有关系的是体重 如果楼主练了一年有这个力量那是绝对有天赋的 不过 ...
腿短，硬拉则杠铃从地上提起来的距离短，做功少。胳膊短，则卧推腕部移动距离短，同理。所以矮但是肌肉多的人有天然优势。
这个重量，真的是普通。
腿短，硬拉则杠铃从地上提起来的距离短，做功少。胳膊短，则卧推腕部移动距离短，同理。所以矮但是肌肉多 ...
人家才练了一年 没看见吗？一年有这个力量还普通？ 那么也许你半年就达到了所以说他普通！
我瘦体重和楼主一样，高10厘米。当初练了一年后和楼主数据差不多（硬拉半年）。我不是专门练重量的。我就普通水平，离天赋差远了。第二年增长就慢多，第一年最快。&
人家才练了一年 没看见吗？一年有这个力量还普通？ 那么也许你半年就达到了所以说他普通！
完全同意你的观点，这个体重的话深蹲和卧推重量都已经非常牛了。我们健身房一个小伙，体重也是这个体重，5年+的训练年限，而且平时比较侧重力量训练，深蹲和卧推差不多这个重量，但是硬拉肯定轻松过160的。如果一年能达到这个水平，绝对是相当有天赋了
话是这么说，不过健美始终看的事大小，不是推起来的重量，真的见过力量很强，不涨肌肉的健身爱好者。所以我觉得有天赋应该是肌肉涨的特别快，不是重量涨的特别快&
不知道吃蛋白粉对力量的帮助到底有多大
我是最近才开始吃的，开始锻炼的第一年什么都吃不起，从推空杆开始练（只有脂肪的胖子一个，完全没力气）
练了整整一年，也就140磅，65KG的水平。，你太牛逼了。。。
当然重量这玩意。。。你还是上照片吧
和身高有什么关系？卧推&&硬拉 深蹲有关系的是体重 如果楼主练了一年有这个力量那是绝对有天赋的 不过 ...
大哥，我上了照片，你能仔细分析下原因吗？我觉得我练的不多的，我大肌肉群一般3-4个动作&&但是组数超过3组 就有点疲惫了。
哪个区的？是不是晚上训练导致睡眠不良？&新手园地& & & 硬件问题Linux系统管理Linux网络问题Linux环境编程Linux桌面系统国产LinuxBSD& & & BSD文档中心AIX& & & 新手入门& & & AIX文档中心& & & 资源下载& & & Power高级应用& & & IBM存储AS400Solaris& & & Solaris文档中心HP-UX& & & HP文档中心SCO UNIX& & & SCO文档中心互操作专区IRIXTru64 UNIXMac OS X门户网站运维集群和高可用服务器应用监控和防护虚拟化技术架构设计行业应用和管理服务器及硬件技术& & & 服务器资源下载云计算& & & 云计算文档中心& & & 云计算业界& & & 云计算资源下载存储备份& & & 存储文档中心& & & 存储业界& & & 存储资源下载& & & Symantec技术交流区安全技术网络技术& & & 网络技术文档中心C/C++& & & GUI编程& & & Functional编程内核源码& & & 内核问题移动开发& & & 移动开发技术资料ShellPerlJava& & & Java文档中心PHP& & & php文档中心Python& & & Python文档中心RubyCPU与编译器嵌入式开发驱动开发Web开发VoIP开发技术MySQL& & & MySQL文档中心SybaseOraclePostgreSQLDB2Informix数据仓库与数据挖掘NoSQL技术IT业界新闻与评论IT职业生涯& & & 猎头招聘IT图书与评论& & & CU技术图书大系& & & Linux书友会二手交易下载共享Linux文档专区IT培训与认证& & & 培训交流& & & 认证培训清茶斋投资理财运动地带快乐数码摄影& & & 摄影器材& & & 摄影比赛专区IT爱车族旅游天下站务交流版主会议室博客SNS站务交流区CU活动专区& & & Power活动专区& & & 拍卖交流区频道交流区
白手起家, 积分 112, 距离下一级还需 88 积分
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本帖最后由 linblue 于
09:43 编辑
开机无法正常启动，提示错误：
6(9M[09@T``IQYIFBCHL_CV.jpg (45.91 KB, 下载次数: 2)
09:21 上传
进入rescue救援模式尝试修复，但挂载是提示错误：
挂载失败.jpg (31.62 KB, 下载次数: 2)
09:25 上传
手动挂载根目录，查询fstab文件，发现为乱码：
乱码.jpg (100.99 KB, 下载次数: 2)
09:27 上传
重写fstab文件：
/dev/sda7 / ext3 defaults 1 1
LABEL=/boot1 /boot ext3 defaults 1 2
(/dev/sda7 / ext3 defaults 1 1
dev/sda1 /boot ext3 defaults 1 2 也尝试过)
修改后，系统能过挂载到/mnt/sysimage
挂载.jpg (39.05 KB, 下载次数: 2)
09:31 上传
提示.jpg (5.75 KB, 下载次数: 2)
09:32 上传
接着使用命令chroot /mnt/sysimage进行手动切换磁盘系统，提示错误：
chroot : cannot execute /bin/sh : not a directory
网上朋友提示可能系统文件/bin/sh不存在，使用：ls -l /mnt/sysimage/bin/sh
提示错误：ls:/mnt/sysimage/bin/sh :not a directory
网上朋友说可能文件系统损坏，无法修复，只能重装，由于是新手，加上很多配置文件不会重写，万不得已不想重装，请问各位高手有没有什么更好的解决方法。在线等待答案。谢谢！！！
相关讨论链接：急！！！开机时出现这个错误：warning can't access (null)？怎么解决？
正常情况下,/bin/sh是/bin/bash的连接,你看下/bin/bash是否还在,如果在的话,你拷贝下bash到sh(必要的时候先删除/bin/sh),测试下看看能不能chroot.
我觉得重装简单些,尤其是新手,很可能你将系统损坏的更严重.
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论坛徽章:379
正常情况下,/bin/sh是/bin/bash的连接,你看下/bin/bash是否还在,如果在的话,你拷贝下bash到sh(必要的时候先删除/bin/sh),测试下看看能不能chroot.
我觉得重装简单些,尤其是新手,很可能你将系统损坏的更严重.
大富大贵, 积分 15561, 距离下一级还需 4439 积分
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把重要数据备份出来，重装！
还有就是就当着学习试着从其它机器把缺失的文件补上，前提也是备份数据
白手起家, 积分 112, 距离下一级还需 88 积分
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重装能类似windows系统，只重装c盘其他盘不变的嘛？
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这个要看你原来系统的分区情况.不知道你清楚每个硬盘分区的用途不
白手起家, 积分 112, 距离下一级还需 88 积分
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不清楚，服务器在我来之前就已经安装好了。我用e2label查询，分成8个区。
.jpg (615.37 KB, 下载次数: 1)
13:57 上传
至于用途就不得而知了
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按照你的图,可能的对应关系
sda1 ---& /boot
sda2 ---& /usr
/sda3 --& /home
sda5 --& /var
sda6 --& /tmp
sda7 --& /
sda8是交换分区.
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你原来安装系统的人还能找到不?最好让他来,你是新手,很容易误操作,那样的话,系统就彻底没救了.
白手起家, 积分 79, 距离下一级还需 121 积分
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找一个相同的系统，然后拷贝／bin 目录和 ／sbin&&目录回来，
这个系统的损坏比较严重，怕是／bin下的文件都丢了，要不就是损坏了,
这种系统能难修复，建议重装
白手起家, 积分 112, 距离下一级还需 88 积分
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谢谢版主这么用心帮忙。原来人员已离职。估计修复没什么希望了，尝试重装。总要有第一次。|/|/|/|/|/|
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【交流】定点突变失败N次，急求高手指点!
我现在做定点突变3个月,可是一直变不回去!我的基因长1700bp,要突变的碱基在600bp处,用的宝生物的突变试剂盒,每次按说明书实验后一测序,就是没有突变掉.试剂盒里的酶用的是pyrobest高保真的 ，高保真的一般扩增长片断有点难，后来我又用了LA酶，但这个酶在扩增后产物末端会多个A，也不行 ！求高手指点一下，三个月过去了 没有个结果，急啊 ！你的这个基因太长，而且你要突变的碱基在600多的位置，不好突变，也没有办法突变。因为在中间没有办法通过引物来引入突变碱基。我建议你把你的片断分成两端来扩，一段有突变，一段没有突变，分别设计引物，最后把这两段连起来就可以了，当然这样做是很麻烦，至少可以去试一试。突变是可以的，把基因片段连接到一个载体上，然后在要突变处设计一对反向互不的引物，三十多个碱基的，把要突变的碱基放在正中间，然后拿构建好的载体当模板扩增，再用dpnI消化掉质粒模板，将已经形成环状的PCR产物（带两个缺口）转化进大肠杆菌就可以。具体的方法原因可以参考分子克隆，strategene公司、赛百盛公司也有这类的定点突变试剂盒。takara的那个试剂盒应该也可以，但我总觉得那些步骤对操作要求太高，还要乙醇沉淀什么的，太麻烦。我最近在做跟你一样的，基因也是1700，在600bp也有一个突变，不过还有其它的突变位点，我是这么做的：在突变位点设计两个引物，一个正义，一个反义，当然在引物中已经包含突变了，而且两个引物完全互补共25bp。用这两个引物分别和上游和下游的另外两个不含突变的引物在模板也就是质粒上面扩增（用高保真酶），得到没有末端加A的600bp和1100bp片段，然后重叠PCR得到突变的全长基因（因为他们有25bp的重叠），我现在已经做成功四个了，还有三个没有成功（共七个点突变），正在努力。这种方法分子克隆上面有，另外我还试过另一种方法，大引物法，就是用刚才这个600bp的片段做引物在原模板质粒上面做单引物扩增20循环，然后加两边的引物，这样也能做出来，但是这里因为加了原模板，所以不能保证它完全突变了，需要筛克隆（这个分子克隆上面也有，你可以参考一下。刚看了看takara的说明书，我想有个地方要问一下：你用来扩增的模板是线性的1700bp的片段还是一个含这个片段的质粒？如果是质粒，在转化之前，有没有把这个质粒去掉？质粒转化跟跟连接片段的转化相比，可是太有优势了，最后你挑克隆的时候，自然多数机会挑到的都是这种没有任何突变的“原始质粒”，哪怕你最初只用了0.1ng的模板。bact wrote:刚看了看takara的说明书，我想有个地方要问一下：你用来扩增的模板是线性的1700bp的片段还是一个含这个片段的质粒？如果是质粒，在转化之前，有没有把这个质粒去掉？质粒转化跟跟连接片段的转化相比，可是太有优势了，最后你挑克隆的时候，自然多数机会挑到的都是这种没有任何突变的“原始质粒”，哪怕你最初只用了0.1ng的模板。我用的是质粒呀，但是PCR出来后会切胶回收呀，所以肯定不会有质粒了呀，只是还有少量产物是以没有突变的质粒为模板扩出来的，所以要筛选。但是重叠PCR就不用筛选了，每一步都回纯化呀。感谢这么多高手的指点!bact,你好!我就是把目的片段连接到了一个载体上,加上载体共3kb左右吧,我就是按你说的方法做的,但我没有用dpnI消化掉质粒模板这一步.我是在PCR后做磷酸化,再连接,使产物重新成为环状,再转到大肠杆菌,刚开始时p出的产物和对照一般大,但转化后都是未突变成功.再后来P出的产物总比对照小,不知道为什么.是不是我的基因太长了(3kb),高保真酶效率太低,后来我又换了LA酶,但该酶在PCR产物后都会加个A,没办法使其再环化,能有什么办法把A去掉?请各位高手继续指点!bleding,你好,用重叠PCR的方法扩1700bp长度的基因,用什么酶好呢,保真性好的扩增效率低,扩增效率高的保真度不好吧?lielieyuyu wrote:bleding,你好,用重叠PCR的方法扩1700bp长度的基因,用什么酶好呢,保真性好的扩增效率低,扩增效率高的保真度不好吧?长了确实不是那么容易做，我也是试了好多条件才试出来，将近做了一个月，天天P。你最好用一个好点的酶，我用的是TIANGEN的2*mix，然后加的PFU。现在还刚转进质粒，还没有测序验证，所以还不敢保证没有其它的突变。我觉得你那个方法也挺好的，只是应该消化一下原模板。我在PCR后会跑电泳胶回收的啊,原来的质粒模板应该不会有了吧?此帖加精，欢迎讨论突变技术！lielieyuyu,你的质粒是3k的，平常提取出来的超螺旋状态在电泳时候正常来讲大概会在2k左右的位置，跟你的pcr产物离得就非常近了，我觉得有可能有微量的交叉部分，也可能在切胶的时候切的比较宽，造成质粒回收。另外，3k对于普通pfu的扩增来说，确实很难，但你既然有pcr产物了，说明不是酶扩增效率的问题。建议：1。减少扩增时的模板，减少最后回收到模板的机会，当然，也不要太少，不然产物会太少。
2。回收PCR产物的时候电泳时间要足够长，充分分开质粒和产物。
3。合成一对引物，把突变位点放在最3‘端，根据PCR的原理，当3’端不匹配的时候，PCR扩增无法进行（详见分子科隆第三版PCR部分），这样可以用来作是否突变的筛选，就不用一个个测序了，测序太贵，而且耽误时间。等确定了再去测序。bact,谢谢你的建议!首先我的模板是稀释了800倍的,你建议的合成一对筛选用的引物很好,这样可以节约好多时间!我再试吧!我个人一般不建议用质粒全长做模板然后PCR突变，因为载体越大PCR过程中出现突变的几率越高，我说的这个突变几率指的是在你需要突变的位置突变了，在你不需要的地方也突变了。所以我建议1、如果你的突变位点附近，比如20-30bp处有一个限制性位点，那么设计一对引物，把需要突变的位点放在其中一条引物内部，PCR扩增以后re-insert进载体，也就是替换原来没有突变的片段即可构成突变载体了。2、如果突变位点附近没有合适的内切酶位点，那么在更远处找一个合适的内切酶位点，选一段大小合适的片段，利用重叠延伸PCR的方法引入突变，看图。
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=415 height=457 title="Click to view full .jpg (415 X 457)" border=0 align=absmiddle>mybbff ，我记得以前跟别人讨论过突变几率的问题，你说的长度越长，突变几率越高，确实是这样，但是多出来的突变几率发生在载体那部分序列，并不影响我们的实验啊，发生在那1700bp的突变的可能性跟是否连接载体应该是没有关系的。在突变位点设计一条引物，与1700片断的上游引物做PCR，获得一条较长的片断，回收，以该回收片断为大引物，再与1700片断的下游引物做PCR,即可获得突变的片断。注意使用高保真的酶，模板少加，循环数要少。最好 能在 突变位点形成酶切位点，这样便于检测hnsdly,你好,我想问一下,我的片段长1700左右,突变位点在559位,P出的大引物太大了吧,能结合上吗?请问各位高手,我能不能在突变位点处设计引物,扩两条带,再用PCR拼接起来!因为我的突变位点在559位,P出的两条带一个为500多bp,一个为1200bp,这样的两条带拼接是不是有些困难!另外一种途径是用LA酶,但它会在最末端引入一个多余的A,请问有什么方法能把A去掉?lielieyuyu wrote:请问各位高手,我能不能在突变位点处设计引物,扩两条带,再用PCR拼接起来!因为我的突变位点在559位,P出的两条带一个为500多bp,一个为1200bp,这样的两条带拼接是不是有些困难!另外一种途径是用LA酶,但它会在最末端引入一个多余的A,请问有什么方法能把A去掉?去A可以用pfu酶mybbff wrote:我个人一般不建议用质粒全长做模板然后PCR突变，因为载体越大PCR过程中出现突变的几率越高，我说的这个突变几率指的是在你需要突变的位置突变了，在你不需要的地方也突变了。所以我建议1、如果你的突变位点附近，比如20-30bp处有一个限制性位点，那么设计一对引物，把需要突变的位点放在其中一条引物内部，PCR扩增以后re-insert进载体，也就是替换原来没有突变的片段即可构成突变载体了。2、如果突变位点附近没有合适的内切酶位点，那么在更远处找一个合适的内切酶位点，选一段大小合适的片段，利用重叠延伸PCR的方法引入突变，看图。其实定点突变最简单最有效就是全质粒扩增的方法，虽然可能引进不需要的突变，但是只要加大最初的模版量5－50ng，减少PCR的循环次数（12－18次），使用高保真的酶（pfu等），再用dpnI消化，就可以避免引入不需要的突变，实验结果就完全没有问题。而且节省时间和精力，本人做了不下40－50个位点的突变，每一个都是一次成功，而且大部分都是只挑了一个clone就搞定的，少数得挑2－3个clone。虽说有运气成分，但这个方法阳性率高是没说的。而且一次可以同时做几十个位点的突变，比引物延伸的方法要方便很多。其实也完全不用买试剂盒，自己就能搞定，我就是买了Takara的Pyrobest和NEB的DpnI拼凑的，为老板省了不知道多少银子，而且现在实验室也一直在用。引物的设计可以参照stratagene的说明书，质粒模版的处理可以参照分子克隆。呵呵，祝大家实验成功！smartkevin ，这种方法我用过，似乎高保真酶是个关键，主要是因为加上质粒之后，需要扩增的片段就大了许多，很多pfu就不能满足要求了，不知道takara的pyrobest性能怎么样？能不能介绍一下，你都扩增过多长的片段（包括质粒）？smartkevin,我一开始也是用的质粒扩增,但我的片段加上质粒共5k,太大了,用pyrobest试了好多次,P出的产物都变小了,你说的减少PCR的循环次数（12－18次），能有PCR产物吗?还有,想问一下如何用PFU去掉A?有没有人试过用核酸外切酶1去掉PCR产物中末端多余的碱基?lielieyuyu，我以前做的时候用的是赛百盛的试剂盒，加上质粒一共扩增8k的都能做出来，试剂盒说明书说能扩增15k的，对此我一直表示怀疑，但5k应该没问题，还有像strategene的试剂盒应该也没问题，pyrobest能不能扩增出来，还不知道。再有一点，PCR的循环数12-18是为了减少突变的几率，不过12似乎太少了，我那时候是18-25好像，记得不是很清除了，可以看看说明书。琼脂糖电泳看到片段大小不对，那可能是扩增的特异性不好，但看不到产物不一定就不行，毕竟十几个循环产物确实很少，很多时候不能通过EB染色观察到，但那个浓度只要感受态细胞转化效率高，就可以通过转化得到。bact wrote:smartkevin ，这种方法我用过，似乎高保真酶是个关键，主要是因为加上质粒之后，需要扩增的片段就大了许多，很多pfu就不能满足要求了，不知道takara的pyrobest性能怎么样？能不能介绍一下，你都扩增过多长的片段（包括质粒）？如果有stratagene的pfu当然是最好的，但是就是贵。我用的都是pyrobest的，最大扩增过8k的，没有问题。pyrobest说明书好像说扩增lamda可以到10k以上，没试过。扩增效率我觉得挺好的，一般我做单碱基突变只作12cycles，扩增的条带很亮，多碱基可用16cycles，缺失或者插入可用18cycles，具体可参照stratagene 的Quik Change 说明书中的条件。不同的是我用的延伸温度为72度，1min/kb，效果很好。12cycles可以检测到很亮的条带？我总觉得挺玄乎的。pyrobest看说明书上说是一种扩增能力不错的酶，但网上看很多人意见相反，自己没用过，一直不清楚。lielieyuyu wrote:smartkevin,我一开始也是用的质粒扩增,但我的片段加上质粒共5k,太大了,用pyrobest试了好多次,P出的产物都变小了,你说的减少PCR的循环次数（12－18次），能有PCR产物吗?“P出的产物都变小” 你是指质粒扩增吗？如果是的话可能是你的延伸时间不足。原则上单碱基突变12cycles足矣，这主要是由于起始的模版量很大的缘故，一般是5-50ng。其中有个关键因素是模版量和引物量的配比，所以扩增不出来最好先摸一下条件。可以先固定引物浓度，比如1－2uM，然后用不同的模版浓度试验一下扩增效果，我一般在10－20ng以上就能够扩增得到很好的结果了。我把我的实验结果给你看看吧lane 1 lane 2, lane 3, native plasmid + DpnI; lane 4, 6, 8, 10, mutated plasmids produced by PCR; land 5, 7, 9, 11, mutated plasmids treated by DpnI
screen.width-333)this.width=screen.width-333" width=198 height=212 title="Click to view full 1.jpg (198 X 212)" border=0 align=absmiddle>bact wrote:12cycles可以检测到很亮的条带？我总觉得挺玄乎的。pyrobest看说明书上说是一种扩增能力不错的酶，但网上看很多人意见相反，自己没用过，一直不清楚。模版量大是没问题的，你可以试试，呵呵bact wrote:12cycles可以检测到很亮的条带？我总觉得挺玄乎的。pyrobest看说明书上说是一种扩增能力不错的酶，但网上看很多人意见相反，自己没用过，一直不清楚。你用的模版量是多少？如果还是按常规的模版量（质粒 0.1ng）的话是看不到条带的我当时是按照说明书来的，模板量多大我忘了，记得说明书上说模板量太大的话，DpnI降解不完全就可能挑到没有突变的，所以一直严格按照说明书，没有加大模板量。难道DpnI很强悍？另外，你上面的图片颜色比较古怪，是不是曝光时间调的很长，然后对比度调的很高？如果直接用紫外投射仪肉眼观察的话，lane3、lane4、lane7、lane8能不能看到？以前曾经碰到有人PCR的时候产物浓度很小，琼脂糖电泳几乎看不到，我就建议他直接转化，结果也做出来了。我自己从来没有做过琼脂糖检测，都是直接转化，所以有个问题一直没有弄清楚，请教一下smartkevin，得到的PCR产物，众所周知是带缺口的环形，它电泳的速度是怎样的？跟超螺旋质粒、线性DNA还是开环质粒一个速度？bact wrote:我当时是按照说明书来的，模板量多大我忘了，记得说明书上说模板量太大的话，DpnI降解不完全就可能挑到没有突变的，所以一直严格按照说明书，没有加大模板量。难道DpnI很强悍？另外，你上面的图片颜色比较古怪，是不是曝光时间调的很长，然后对比度调的很高？如果直接用紫外投射仪肉眼观察的话，lane3、lane4、lane7、lane8能不能看到？DpnI的确很强悍，如lane 3就全部背降解。同时我一般制备的模版都是经过NaOH/EDTA处理的，转化效率很低，降低了背景。我使用的是invert的，黑色的是电泳条带。曝光时间很短，正常的曝光度。你说的条带都能看到的。bact wrote:以前曾经碰到有人PCR的时候产物浓度很小，琼脂糖电泳几乎看不到，我就建议他直接转化，结果也做出来了。我自己从来没有做过琼脂糖检测，都是直接转化，所以有个问题一直没有弄清楚，请教一下smartkevin，得到的PCR产物，众所周知是带缺口的环形，它电泳的速度是怎样的？跟超螺旋质粒、线性DNA还是开环质粒一个速度？得到的质粒是双缺口的，比超螺旋稍慢（如图所示），我记得好像是比线性的快。那可能是螺旋程度比较轻吧，所以介于超螺旋和线性之间，呵呵，猜测。谢谢smartkevin，以前 一直以为对这种方式的定点突变比较熟悉了，今天又学到了很多以前不知道的。楼主去看看，当时就犹豫应该写在核酸版还是PCR版>我应该写得很清楚。
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