基因组中的非编码区内主要是一些调控序列
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&&&& &&&& &&&& &&&&&&&&第一章～第八章&&&&基因genes：基因是负责编码RNA或一条多肽链DNA片段，包括编码序列、编码序列外的侧翼序列及插入序列。是决定遗传性状的功能单位。&&&&结构基因structuregenes：基因中编码RNA或蛋白质的DNA序列称为结构基因。&&&&基因组genome：一个细胞或病毒的全部遗传信息。（细胞或生物体的一套完整单倍体的遗传物质的总和。）真核生物基因组是指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列，包括编码序列和非编码序列。&&&&GT-AG法则：真核生物基因的外显子与内含子接头处都有一段高度保守的一致性序列，即：内含子5’端大多数是以GT开始，3’端大多是以AG结束。&&&&端粒：以线性染色体形式存在的真核基因组DNA末端都有一种特殊的结构叫端粒。该结构是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，仅在真核细胞染色体末端存在。端粒DNA由重复序列组成，人类端粒一端是TTAGGG另一端是AATCCC.&&&&操纵子：是指数个功能上相关的结构基因串联在一起，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号所构成的基因表达单位。所转录的RNA为多顺反子。&&&&操纵元件：是一段能够被不同基因表达调控蛋白质识别和结合的DNA序列，是决定基因表达效率的关键元件。&&&&顺式作用元件：是指那些与结构基因表达调控相关、能够被基因调控蛋白特异性识别和结合的特异DNA序列。包括启动子、上游启动子元件、增强子、反应元件和poly(A)加尾信号。&&&&反式作用因子：是指真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。&&&&启动子：是能够被RNA聚合酶特异性识别并与其结合并开始转录的核苷酸序列。（TATAbox、CAATbox、GCbox）&&&&增强子enhancer：是一段短的DNA序列，其中含有多个作用元件，可以特异性地与转录因子结合，增强基因的转录活性。它可位于被增强的转录基因的上游或下游，也可相距靶基因较远。&&&&多顺反子mRNA(polycistronicmRNA)即每一个mRNA分子带有几钟蛋白质的遗传信息（来自几个结构基因），利用共同的启动子及终止信号，组成“操纵子”的基因表达调控单元。&&&&病毒基因组的特点：一、：种类单一；病毒的核酸通常是DNA分子或者是RNA分子。二：RNA病毒基因组有单、双链和正、负链之分。根据是否可以作为mRNA模板，指导蛋白质合成，分成正链RNA病毒和负链RNA病毒两大类。1、单股正链RNA病毒基因组可以作为mRNA行使模板功能：病毒颗粒中的RNA进入宿主细胞后，可直接作为mRNA，翻译出所编码的蛋白质，包括衣壳蛋白和病毒的RNA聚合酶。然后再病毒RNA聚合酶的作用下以病毒基因组RNA为模板合成出负链，在以负链为模板复制病毒RNA，并以复制的病毒RNA和衣壳蛋白自我装配成为成熟的病毒颗粒。这些病毒称为单股正链RNA病毒。2单股负链RNA病毒需要先合成与其互补的MRNA：先以病毒基因组RNA为模板转录生成互补RNA，再以这个互补RNA作为mRNA翻译出遗传密码所决定的蛋白质。3、双链RNA病毒基因组含有正、负两条RNA链。4、部分RNA病毒基因组可以被反转录为DNA：有一类特殊的单股正链RNA病毒，即逆转录病毒，在这些病毒颗粒中带有依赖RNA的DNA聚合酶，即逆转录酶，能使RNA反向转录生成DNA。逆转录病毒基因组一般包括三个基本的结构基因，即：gag,pol,env，分别编码核心蛋白、逆转录酶和膜蛋白。三、DNA病毒基因组有环状DNA分子和线性DNA分子。四、其他：形式多样、大小不一、基因重叠；、动物/细菌病毒与真核/原核基因相似：内含子；具有不规则的结构基因；基因编码区无间隔：通过宿主及病毒本身酶切；无帽状结构；结构基因没有翻译起始序列。&&&&原核基因组的特点：一、原核生物基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成；二、操纵子结构是原核生物基因组的结构特点之一：原核生物的绝大多数结构基因按功能相关性成簇地串联排列与染色体上，构成信息区，连同其上游的调控区（包括启动子和操纵基因）以及下游的转录终止信号构成一个基因表达单位，即操纵子结构。一个操纵子只含一个启动序列和数个可转录的结构基因。在同一个启动序列控制下，操纵子可转录出多顺反子mRNA。三、基因密度非常高，基因组序列中编码区所占的比例较大。可表达基因约50%，大于真核生物小于病毒。重复序列很少。四、在原核生物基因组中的非编码区内主要是一些调控序列。五、基因一般是连续的，无内含子；六、细菌基因组中的可移动成分能产生转座现象。&&&&转座因子的类别和遗传效应：细菌基因组中的可移动成分能产生转座现象。1、原核生物转座因子可以分为：插入序列、转座子、Mu噬菌体。2、转座因子的几个遗传效应。①转座因子的转座不是本身的移动，而是由转座因子复制出一个新的拷贝转移到基因组中的新位置上去。②新的转座因子转到靶点后，靶点序列会倍增为两个靶点序列，并分别排列在转座因子的两侧，形成同向重复序列。③在转座过程中能够形成共同体。④转座因子转座后能促使染色体畸变。⑤转座因子可以从原来的位置上切除，这个过程成为切离。⑥转座可引起插入突变。⑦给受体基因组增添了新的标志基因。&&&&真核基因组的特点：①真核生物基因组远大于原核生物基因组，结构复杂，基因数庞大，具有多个复制起点；②基因组由染色体DNA和染色体外DNA组成。③真核基因为单顺反子，而细菌和病毒的结构基因多为多顺反子；④基因组中非编码区多于编码区；⑤真核基因多为不连续的断裂基因，由外显子和内含子镶嵌而成；⑥存在大量的重复序列；⑦功能相关的基因构成各种基因家族；还存在一些假基因⑧存在可移动的遗传因素；⑨体细胞为双倍体，而精子和卵子为单倍体。&&&&转座子（transposon,Tn）这是一类长度在bp之间较大的转座因子，如Tn.它们除了带有与转座有关的基因以外，还带有其他基因，如Tn903Tn5带有卡那霉素抗药基因等。&&&&质粒plasmid:是存在于细菌染色体外的、具有自主复制能力的环状双链DNA分子。&&&&卫星DNA：是出现在非编码区的串联重复序列。其特点是具有固定的重复单位，该重复单位首尾相连形成重复序列片段，通常存在于间隔DNA和内含子中。串联重复序列是形成卫星DNA的基础。分类：大卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA。&&&&回文结构：在DNA链上，两个拷贝反向串联在一起，中间没有间隔序列。&&&&RFLP：即限制性片段长度多态性，个体之间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。由于碱基组成的变化而改变了限制性内切酶的酶切位点，从而导致相应的限制性片段的长度和数量发生变化，称为RFLP。&&&&多基因家族multigenefamily：核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的基因，其编码产物常具有相似的功能。&&&&假基因pseudogene与某些有功能的基因结构相似，但不能表达基因产物的基因。&&&&引起DNA损伤的因素及机制：&&&&1、紫外线引起DNA损伤：①形成胸腺嘧啶二聚体②引起DNA之间的交联、DNA与蛋白质的交联、甚至DNA链的断裂。&&&&2、电力辐射引起DNA损伤：①可导致碱基变化：由.OH自由基引起，包括DNA链上的碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等②可导致脱氧核糖的变化：脱氧核糖分解，最后可引起DNA链断裂。③可导致DNA断裂：使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开。④引起DNA链交联：包括DNA-DNA链间链内交联和DNA-蛋白质交联。&&&&3、烷化剂引起DNA损伤：①烷化剂导致碱基烷基化②烷化剂导致碱基脱落③烷化剂导致DNA断链④烷化剂导致DNA链交联&&&&4、碱基类似物、修饰剂引起碱基对的改变&&&&5、其他因素：丫啶类化合物引起碱基插入和碱基缺失；氧自由基。&&&&6、DNA也会产生自发性损伤：①DNA复制时产生碱基错配；②DNA修复使产生碱基错配；③碱基自发改变导致DNA损伤：互变异构位导致DNA突变；脱氨基作用导致DNA突变；碱基丢失导致DNA突变。&&&&DNA损伤（突变）可分为：链内共价交联、链间共价交联、DNA链断裂、碱基突变（转换和颠换）、插入或缺失、DNA重组等。&&&&DNA损伤修复机制：1、某些DNA损伤可以直接修复：DNA断裂口可以直接修复；二聚体可被光复活酶直接修复；烷基化碱基可以直接修复。2、切除修复是细胞内最普遍的修复方式：过程①识别：DNA特异内切酶或糖苷酶识别DNA损伤位点；②切除：在损伤位点的5’上游切断DNA链，沿5’-3’方向逐步切除DNA损伤部分③合成：DNA聚合酶在缺口处催化DNA合成并沿5’-3’方向延伸④连接：在DNA连接酶的作用下，新合成的DNA片段与原来的DNA链连接。切除修复可分为单个核苷酸切除修复和核苷酸片段切除修复。3、重组修复是DNA损伤较多时的修复方式4、SOS修复是DNA损伤严重时的应急性修复方式。5、细胞周期检查点控制是真核生物诱导修复的主要机制&&&&基因表达：是指生物基因组中结构基因所携带的遗传信息经过转录、翻译等一系列过程，合成特定的蛋白质，进而发挥其特定的生物学功能和生物学效应的全过程。&&&&ρ因子依赖性和非依赖性两种机制介导转录的终止：1、不依赖ρ因子的终止子有两个重要特征：①一个反向重复序列，使RNA末端形成一个发夹结构②在信息链上有一连串的T，因而RNA末端发夹结构之后紧接着出现一串U，RNA/DNA杂交分子的rU-dA碱基对结合力较弱，当发夹结构形成时，RNA聚合酶停止移动，RNA链从DNA上脱落。&&&&2、有一些基因的RNA转录终止阶段依赖ρ因子。当RNA聚合酶移动至终止子部位时，ρ因子与其结合，并发挥ATP酶和解链酶活性，使RNA与DNA分离，转录过程终止。&&&&原核生物的tRNA转录后的加工：1、剪切作用将多顺反子初级转录产物分离并切除多余序列；2、有些tRNA分子在3’端需要修复或添加CCA序列；3、通过某些碱基的化学修饰在tRNA分子中形成希有碱基。蛋白质编码区（开放阅读框ORF）:在mRNA的核苷酸序列中，有一段序列是一个特定蛋白质多肽链的序列信息，这一段核苷酸序列从起始密码子开始、倒终止密码子结束，称为蛋白质编码区或开放阅读框，此段核苷酸序列决定蛋白质的一级结构。&&&&SD序列：mRNA起始密码子AUG上游8～13个碱基处存在的一段特定的核苷酸序列，该序列称为SD序列，是mRNA的起始密码子之所以能与小亚基定位结合的关键。SD序列与小亚基中16SrRNA3’端的序列互补，当mRNA与小亚基结合时，SD序列与16SrRNA3’端的互补序列配对结合，使起始密码子定位于翻译起始部位。&&&&真核生物mRNA的加工：1、甲基化鸟苷酸以5’端磷酸基团连接mRNA5’端形成帽子结构。2、多聚腺苷酸的加入形成mRNA的3’尾。3、mRNA前体经剪接过程除去内含子序列。4、mRNA分子中的少数碱基可被甲基化。5、RNA编辑：是通过对mRNA的加工使遗传信息在mRNA水平上发生改变。&&&&时间特异性：在多细胞生物从受精卵到组织、器官形成的各个不同发育阶段，相应基因严格按照一定时间顺序开启或关闭，这就是基因表达的时间特异性。&&&&空间特异性：在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现。&&&&分子伴侣（伴侣蛋白）：是一类序列上没有相关性但有共同功能的保守性蛋白，他们在细胞内能协助其他多肽结构完成正确的折叠、组装、转运和降解。&&&&管家基因：在生物体生命的全过程都是必须的，且在一个生物个体的几乎所有细胞中持续表达的基因。&&&&原核生物转录水平调控：原核生物基因多以操纵子的形式存在。操纵子由调控区与信息区组成，上游是调控区，包括启动子与操纵元件两部分。启动子是同RNA聚合酶结合并启动转录的特异性DNA序列，操纵元件是特异的阻遏物结合区。1、启动子决定转录方向、模板链、转录效率。2、不同的σ因子可以竞争结合RNA聚合酶，打开特定的一套基因。3、阻遏蛋白在转录水平对基因表达具有负调控作用。4、正调控蛋白结合于特异DNA序列后促进基因的转录。5、到位蛋白通过DNA重组倒位而调节基因表达、6、RNA聚合酶抑制物可与RNA结合并抑制转录。7、衰减子可以在转录过程中控制转录水平。&&&&严谨反应：细菌在缺乏氨基酸的环境中，RNA聚合酶活性降低，RNA合成减少或停止。&&&&衰减子attenuator：细菌中的mRNA转录和蛋白质翻译合成是偶联在一起的。这一特点使细菌的一些操纵子中的特殊序列可以在转录过程中控制转录水平。这些特殊结构称为衰减子。衰减子又称为弱化子，位于一些操纵子中第一个结构基因之前，是一段能减弱转录作用的顺序。&&&&乳糖操纵子的作用机制&&&&1、乳糖操纵子（lacoperon）的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵元件O，一个启动子P和一个调节基因I（是调节基因，编码产生阻遏蛋白）。&&&&2、阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，抑制RNA聚合酶与启动子结合，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。&&&&3、CAP的正性调节：lac启动子是弱启动子，在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡萄糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。&&&&4、协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。&&&&CAP：是大肠杆菌分解代谢物基因活化蛋白，这种蛋白可将葡萄糖饥饿信号传递个许多操纵子，使细菌在缺乏葡萄糖时可以利用其他能源。CAP结合DNA是由cAMP控制的。cAMP结合于CAP，诱导CAP发生构象改变，使之能够结合于特定的DNA序列，激活临近基因的转录。cAMP水平降低时，cAMP与CAP解离，CAP转回到无活性的构象，并与DNA解离，这将关闭葡萄糖以外的其他的与糖代谢相关的操纵子。由于CAP的作用依赖于cAMP，因此，CAP又称为cAMP受体蛋白。&&&&原核生物翻译水平的调控：一、SD序列是影响翻译的重要因素：1、SD序列的顺序及位置影响翻译起始效率。2、mRNA二级结构可以屏蔽SD序列。二、mRNA的稳定性（降解速度）是翻译调控的另一重要机制。mRNA的5’端与核糖体结合，可明显提高其稳定性。三、翻译产物也可以对相应的mRNA的翻译进行调控：1、核糖体蛋白控制其mRNA的翻译。2、翻译终止因子RF2调节自身的翻译。四、小分子RNA可以抑制特定mRNA的翻译。&&&&基因重排：指某些基因片段改变原来存在顺序，通过调整有关基因片段的衔接顺序，再重排成为一个完整的转录单位。&&&&真核生物在转录水平的调控：主要是通过反式作用因子、顺式作用元件和RNA聚合酶的相互作用来完成的，主要是反式作用因子结合顺式作用元件后影响转录起始复合物的形成过程。&&&&一、转录起始复合物的形成是转录的可调控环节：真核生物RNA聚合酶识别的是由通用转录因子与DNA形成的蛋白质-DNA复合物，只有当一个或多个转录因子结合到DNA上，形成有功能的启动子，才能被RNA聚合酶所识别并结合。&&&&转录起始复合物的形成过程为：①TFⅡD结合TATA盒；②RNA聚合酶识别并结合TFⅡD-DNA复合物形成一个闭合的复合物；③其他转录因子与RNA聚合酶结合形成一个开放复合物，开放转录。&&&&二、反式作用因子是真核细胞内重要的基因表达调控蛋白。反式作用因子（trans-actingfactor）：真核细胞内含有的大量可以通过直接或间接结合顺式作用元件而调节基因转录活性的蛋白质因子。在结构上含有与DNA结合的结构域。&&&&在转录调控过程中，反式作用因子的作用是：促进或抑制TFⅡD与TATA盒结合；促进或抑制RNA聚合酶与TFⅡD-DNA复合物的结合；促进或抑制转录起始复合物的形成。&&&&反式作用因子三个基本特征①一般具有三个功能域：DNA识别结合域、转录活性域和结合其他蛋白结合域；②能识别并结合上游调控区中的顺式作用元件；③对基因的表达有正性或负性调控作用，激活和阻遏基因的表达。&&&&反式作用因子结构域具有多种结构模式：&&&&1、DNA结合域有不同的结构模式：①锌指结构借助半胱氨酸和组氨酸与锌离子结合；②同源结构域具有螺旋－回折－螺旋结构：许多反式作用因子结合DNA的结构域中具有一段相同的保守序列，是60个左右氨基酸组成的螺旋－回折－螺旋结构的区域，称为同源结构域（homeodomain,HD）,简称同源域。③亮氨酸拉链结构使两个单体结合并形成DNA结合域。④螺旋-环－螺旋结构易于形成二聚体⑤碱性α-螺旋含较多的碱性氨基酸。2、转录活化结构域是反式作用因子的转录激活区。其模型有：①酸性α-螺旋结构。带有负电荷的α-螺旋区。②富含谷氨酰胺结构域存在于多种转录因子中。③富含脯氨酸结构域常与DNA结合结构域相连。&&&&三、转录起始是由多种激活的反式作用因子进行复合调控⑴反式作用因子的活性调节：①表达式调节——反式作用因子合成出来就具有活性；②共价修饰——磷酸化和去磷酸化，糖基化；③配体结合——许多激素受体是反式作用因子；④蛋白质与蛋白质相互作用——蛋白质与蛋白质复合物的解离与形成。⑵反式作用因子与顺式作用元件的结合：反式作用因子被激活后，即可识别并结合上游启动子元件和增强子中的保守性序列，对基因转录起调节作用。⑶反式作用因子的作用方式——成环、扭曲、滑动、Oozing。⑷反式作用因子的组合式调控作用：每一种反式作用因子结合顺式作用元件后虽然可以发挥促进或抑制作用，但反式作用因子对基因调控不是由单一因子完成的而是几种因子组合发挥特定的作用。&&&&真核生物转录后水平的调控机制&&&&mRNA的加工和运输可形成转录后水平的调控：&&&&①5’端加帽和3’端多聚腺苷酸化的调控意义：5’端加帽和3’端多聚腺苷酸化是保持mRNA稳定的一个重要因素，它至少保证mRNA在转录过程中不被降解。②mRNA选择性剪接对基因表达调控的作用③mRNA运输的控制调节进入细胞质的mRNA量。&&&&第九章细胞信号传导&&&&信息分子：携带生物信息，在细胞之间进行传递的小分子化学物质&&&&受体：靶细胞中能够被体内一些生物活性物质如激素、细胞因子所识别，并与之结合将信号传至细胞内产生生物效应的物质，也即细胞接受细胞外信号的接收装置，直接参与细胞的信息传递。受体的化学性质主要为蛋白质。&&&&受体的作用：1、识别外源性信息分子，与受体相对应，信息分子亦可以称为配体；2、将配体的信号进行转换，使之称为细胞内分子可以识别的信号，并传递到其他分子，引起细胞的应答。&&&&受体与信息分子的结合特点：高度亲和力、高度特异性、可逆行、可饱和性、放大效应。&&&&受体的分类：1、细胞表面受体：水溶性、表面信号分子：离子通道受体、G蛋白偶联受体、单次跨膜受体。2、细胞内受体：脂溶性化学信号。可以位于细胞质也可以位于细胞核内。&&&&蛋白激酶（proteinkinase）：能够将γ-磷酸基团从磷酸供体分子上转移至底物蛋白的氨基酸受体上的一大类酶。&&&&蛋白磷酸酶（proteinphosphatase）是具有催化已经磷酸化的蛋白质分子发生去磷酸化反应的一类酶分子，与蛋白激酶相对应存在，共同构成磷酸化与去磷酸化这一重要的蛋白质活性的开关系统。对蛋白激酶所引起的变化产生衰减信号&&&&接头蛋白也称调控结合元件(modularbindingdomain)即信号分子中存在着的一些特殊的结构域，大约50-100个氨基酸构成，信号分子通过这些特殊结构域相互识别和作用而有序衔接，形成不同的信号传递链。①SH2结构域信号分子与含磷酸酪氨酸蛋白分子②SH3结构域信号分子与含脯氨酸蛋白分子③PH结构域磷脂分子PIP2、PIP3④PTB结构域同SH2：信号分子与含磷酸酪氨酸蛋白分子&&&&G蛋白的循环和活化：一、G蛋白的组成三聚体G蛋白由α、β、γ三种亚基组成。α亚基具有GTP水解酶活性，又有调节效应蛋白作用，β和γ亚基具有调节α亚基作用，也有调节效应蛋白的作用，而且β亚基上有脂链，故具有固定作用。这三个亚基可以聚合在一起形成αβγ三聚体，也可以解离为α和βγ形式。当G蛋白与GDP相结合时无活性，而与GTP结合时则活化成激活状态。二、G蛋白循环受体与信息分子结合后，受体构象改变，并使与受体相偶联的G蛋白构象改变，使GTP置换了GDP。G蛋白激活后，离开受体并解离成βγ和α亚基GTP，α亚基水解GTP，并调节腺苷酸环化酶的活性，调节细胞内cAMP等第二信使的浓度，从而把信息传导给下游分子，同时，与α亚基结合的GTP水解成GDP，然后α亚基GDP复合物重新与βγ亚基结合形成无活性的三聚体，完成一次信息传导。G蛋白这种有活性和无活性状态的转换称为G蛋白循环&&&&与转录因子偶联的受体：多位于胞内，与一些疏水性信息分子相识别，如类固醇激素、甲状腺素、前列腺素、维生素A等。这种受体主要包括三个区域，①羧基端为激素等信息分子的结合区域，②氨基端为转录活化区，调控某些基因的启动子或上游的调控基因，③中央部分为DNA的结合区，富含碱性氨基酸，平时此区与抑制蛋白结合形成复合物。受体与信息分子结合时，发生构象变化，抑制蛋白脱落，暴露出DNA的结合区，转入胞核内，与特定DNA部位结合，调控转录活性。&&&&cAMP－PKA途径-活化：①信号分子与受体结合，引起受体构象变化②受体活化G蛋白（结合GTP，α与βγ解离）③活化后的G蛋白激活腺苷酸环化酶（AC）④AC催化ATP生成cAMP⑤cAMP活化PKA（依赖cAMP的蛋白激酶）⑥PKA使目标蛋白磷酸化，调节代谢酶的活性或调节基因的表达&&&&cAMP－PKA途径-失活：信息分子与受体解离，受体失活→G蛋白失活（GTP被水解成GDP，αβγ亚基重新聚合）→AC失活→cAMP被磷酸二酯酶水解→PKA失活&&&&胰岛素受体介导的信号传导通路&&&&（一）胰岛素受体介导的IRS-1-Ras-MAPK信号通路：这一通路主要涉及胰岛素受体的基因表达调控的信号传导。步骤：1、受体二聚体的形成及其磷酸化。2、募集接头蛋白Grb2。3、Grb2的SH3募集SOS.4、Ras的活化。5、MAPK的级联激活。6、转录因子的磷酸化及其转录调控作用。&&&&（二）胰岛素受体介导的IRS-PI3K-PKB信号通路：此通路与胰岛素对代谢的调节密切相关，与细胞存活密切相关。步骤：1、PI3K的p85亚单位通过SH2结构域与发生了洛氨酸磷酸化的IRS-1结合，p110催化亚单位激活。2、活化的PI3K催化PIP2磷酸化（D-3）生成PIP3。3、PIP3与PKB的PH（pleckstrin-homologydomain）功能区结合，PKB构象变化并转位到胞膜，同时PIP3依赖的蛋白激酶（PDK）也与PIP3结合，使二者相互靠近。4、PDK催化PKB发生磷酸化，激活PKB。5、PKB可磷酸化多种蛋白，介导代谢调节、细胞存活等效应。&&&&第十章细胞增生和凋亡的分子机制&&&&细胞周期中的四个checkpoint:&&&&（1）G1晚期限制点监控G1期细胞大小及环境中是否有生长因子（2）G1?S转折监控DNA是否损伤（3）G2?M转折监控DNA是否损伤、DNA是否已正确完整地复制。（4）有丝分裂中期关卡监控姐妹染色单体是否已稳定的附着在纺锤体上。&&&&参与细胞周期调控的蛋白质&&&&1、周期蛋白（cyclin)2、周期蛋白依赖性激酶（Cdk）3、周期蛋白-周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CKI）4、Rb蛋白及E2F-DP1转录因子5、调节CdK磷酸化和去磷酸化的蛋白激酶和磷酸酶6、泛素（ubiquitin）和使蛋白泛素化的酶&&&&（一）cyclin和Cdk复合物驱动细胞周期进程&&&&周期蛋白B和Cdk1的复合物又称成熟促进因子。Cdk是种蛋白激酶，单独存在的Cdk无活性，与相应的cyclin结合后变构而激活，并受磷酸化和去磷酸化的调控在有无活性间转换，有活性的Cdk复合物能够磷酸化底物蛋白，调控它们的活性，驱动细胞周期，而Cdk复合物的活性又受CKI的抑制。（二）CKI抑制Cdk1及周期蛋白-Cdk复合物的活性CKI分类：Ink4家族：p15,p16,p18,p19蛋白。主要抑制Cdk4或Cdk6，抑制cyclinD与Cdk4或Cdk6结合，也抑制其复合物利用ATP磷酸化底物的功能。Cip/Kip家族：p21,p27,p57蛋白。是细胞接受到接触抑制、DNA损伤、低氧或某些细胞因子信号后的产物，主要功能是与cyclin–Cdk复合物结合，抑制它们的活性。（三）Rb蛋白与E2F-DP1结合，使E2F-DP1不能引起基因的转录，起负调控的作用。（四）使Cdk磷酸化和去磷酸化的酶也调节Cdk活性（五）泛素-蛋白酶体介导蛋白质降解也起调节细胞周期的作用。&&&&周期蛋白：是一类呈细胞周期特异性或时相性表达、累积与分解的蛋白质，它与周期素依赖性激酶共同影响细胞周期的运行。&&&&调控蛋白的协同作用&&&&（一）Cdk4/6和Cdk2的活化是限制点处调控的关键因素分别与cyclinD、E先后结合，导致RB磷酸化释放E2F-DP1，靶基因转录，细胞由G1?S，然后cyclinD、E经SCF复合物多泛素化而降解。（二）Cdk1的活化是G2M关卡处关键调控因素cyclinB与Cdk1结合，导致底物蛋白的磷酸化，G2?M。（三）APC介导多泛素化蛋白降解是细胞离开M期进入G1期的关键调控因素cyclinA/B–Cdk1?APC磷酸化?连接姐妹染色体蛋白降解，M?G1。（四）DNA损伤关卡致G1、G2期停滞1、通过系列磷酸化导致G2停滞DNA损伤?活化ATM和ATR?磷酸化Chk2和Chk1?cdc25C?与14-3-3结合?cdc25C无法活化Cdk1?G2停滞?DNA修复。2、P53致G1、G2停滞&&&&细胞凋亡（apoptosis)：是机体细胞在正常生理或病理状态下发生的一种自发的程序性死亡过程，它的发生受机体的严密调控。细胞凋亡的形态特点：染色体固缩、膜起泡、核膜消失、DNA断裂?凋亡小体形成。&&&&主要的细胞凋亡信号转导途径&&&&（一）外源性死亡受体途径的关键步骤是死亡诱导信号复合物的形成有8种受体，都属于TNF?家族成员。Fas结合FasL?Fas三聚体，激活死亡结构域?募集FADD分子?Fas-FasL-FADD?死亡诱导信号复合物（DISC），并激活死亡效应域?caspase8自我激活?激活caspase3?细胞凋亡。&&&&（二）内源性线粒体途径的关键步骤是细胞色素C从线粒体膜间隙释放到细胞浆进入胞浆的细胞色素C与Apaf1、ATP/dATP结合?形成凋亡体（apoptosome）?Apaf1通过胱天蛋白酶募集域（CARD）与caspase9前体的CARD相互作用而募集caspase9前体?caspase9自我激活?激活caspase3?细胞凋亡。&&&&（三）正、负调节和两条凋亡途径的串话&&&&第十七章细胞增生和凋亡相关基因与疾病&&&&原癌基因（proto-oncogene)是一类广泛存在生物体中，高度保守的基因，其产物具有调控细胞增生的重要功能，当其受某些因素的影响，能发生突变（活化）成为癌基因，导致细胞恶性转化。&&&&原癌基因的特点：1、广泛存在于生物体；2、高度保守，功能相似；3、产物有重要功能；4、某些因素作用下，可发生突变，使细胞恶性转化。&&&&原癌基因的产物：是信号转导途径及基因转录的关键分子。生长因子、生长因子受体、非受体洛氨酸蛋白激酶、G蛋白。&&&&原癌基因的活化机制：1、点突变2、基因扩增3、基因重排4、染色体易位5、插入诱变&&&&癌基因&&&&的功能：1、转化（transformation)细胞形态发生变化，持续增生。调控转化的原癌基因产物主要是位于细胞及胞浆。2、永生化（immortalization)细胞分化受阻，不衰老死亡。调控永生化的原癌基因产物主要是位于细胞核内的转录因子。&&&&抑癌基因（tumorsuppressorgene）：指存在于正常细胞内的一大类可抑制细胞生长并具有潜在抑癌作用的基因，当这类基因发生突变、缺失或失活时，可引起细胞恶性转化而导致肿瘤的发生。&&&&抑癌基因的作用：1、RB和P53调节细胞周期关卡2、调节信号转导抑制细胞增生3、促进DNA修复维持基因组稳定&&&&第十一章基因分析的基本策略&&&&Sanger双脱氧链末端终止法原理：在DNA聚合酶催化下，以单链或双链DNA为模板，采用DNA引物引导新链DNA的合成。DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接，合成DNA所用的底物是2’-脱氧核苷三磷酸。2’,3’ddNTP与普通dNTP不同，它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基。在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中，但由于没有3’羟基，不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链不能继续延伸。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳就可以分辨出具有特定末端不同长度的DNA片段。&&&&Maxam-Gilbert化学裂解法原理：用化学试剂处理具末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，产生一组具有不同长度的DNA链的反应混合物，经电泳分离得出待测DNA片段的核苷酸序列。&&&&基因拷贝数的分析SouthernBlot原理：根据基因序列合成探针，利用同源互补序列可以退火形成异源双链的原理，探测检测对象中能与探针结合的DNA序列。Southernblot的基本步骤：DNA的酶切消化和基因探针的标记；酶切消化：要保证基因的完整性。探针标记：探针序列的确定和检测信号的选择。&&&&Northernblot定性分析mRNA。技术的关键是在于RNA的制备和（变性）电泳。&&&&PCR技术的基本原理：作为引物的一对寡核苷酸与模板DNA同源序列按照碱基互补配对原则形成局部双链，然后在TaqDNA聚合酶作用下引导新链DNA的合成，经过25-30个变性、退火和延伸的循环，获得特异性的DNA片段扩增产物。&&&&RT-PCR技术：以RNA为模板体外扩增cDNA的技术，可用于定性和相对定量（半定量）。基本步骤：提取总RNA，然后将其中的mRNA在体外逆转录成cDNA，再以cDNA为模板进行特定基因的PCR扩增。&&&&转录后RNA剪接的分析RNA酶保护试验（RPA）：是一种液相杂交技术，通过RNaseA和RNaseT1专一性降解单链RNA，分析受到保护的杂交双链RNA，以确定RNA的剪接情况、剪接位点以及基因内含子的可能位置等。&&&&蛋白质的定性定量分析：指的是对特定基因产物蛋白质的定性和定量及定位分析。&&&&一、从总蛋白质中鉴定特定的蛋白质&&&&Westernblot技术：是一种免疫印迹技术，以偶连标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质分子。基本步骤：蛋白质样品的制备和SDS-PAGE电泳分离，蛋白质转膜，标记的抗体与膜上蛋白质进行抗原抗体的结合，检测并分析标记物信号。（在样品中蛋白质表达水平很低时，可通过免疫沉淀收集蛋白质。）&&&&二、在细胞水平分析特定蛋白质&&&&流式细胞术：用荧光标记的抗体结合细胞表面或内部的特定蛋白质分子（抗原），经过流式细胞仪分析荧光信号，从而根据细胞表达特定蛋白质的情况对基因的表达活性作出判断。&&&&三、细胞定位分析特定的蛋白质&&&&免疫组织化学（或免疫细胞化学）技术&&&&基本步骤：抗体的制备与标记，标本（组织或细胞）的制备，组化染色和结果的观察。&&&&第十二章基因功能分析的基本策略&&&&特定基因功能研究的基本策略：通过特定基因的导入和特定基因的剔除或表达的抑制，制备模式生物体或体外培养的细胞模型，观察和检测其表型（包括整体、细胞、分子水平）的变化，从而分析、鉴定特定基因的功能。&&&&转基因模型包括转基因动物模型和转基因的细胞模型。转基因动物（transgenicanimal):应用转基因技术培育的携带外源基因并能稳定遗传的动物。&&&&转基因动物的制备基本步骤：将目的基因（或基因组片段）导入实验动物的受精卵（或着床前胚胎细胞），然后将其植入受体动物的输卵管或子宫中，发育成携带有外源基因的个体，并通过分析其基因组中外源基因的整合状况及其揭示外源基因功能的表型，在此基础上经过常规的遗传育种方法培育出转基因动物。&&&&转基因动物的应用：1、确定特定基因的功能2、发现新基因功能3、发现新基因（突变）4、研究基因表达的时空性5、建立动物模型6、产生需要的器官或组织&&&&基因敲除（geneknockout）：指通过DNA同源重组定向地将外源基因替换宿主细胞染色体DNA中特定的基因，从而使特定的基因在细胞内或生物体内失活的过程1打靶载体的构建：同源序列要足够长，要含有筛选用的标志基因。2胚胎干细胞的体外培养3打靶载体导入胚胎干细胞4同源重组胚胎干细胞的筛选5基因敲除胚胎干细胞注射入胚泡6胚泡植入假孕小鼠的子宫中7杂交育种获得纯合的基因敲除动物&&&&基因敲除动物（geneknockoutanimal）：采用同源重组定向剔除特定基因的技术，所制备的某特定基因丧失功能的动物。基因敲除小鼠：应用基因敲除技术，使两条染色体上特定等位基因都丧失功能的小鼠。&&&&基因表达的抑制或沉默是通过在RNA水平的干涉来分析特定基因功能的方法。（1）反义RNA封闭目标RNA的功能（2）RNA干涉（RNAinterference,RNAi）使特定基因沉默。&&&&反义RNA（antisenceRNA)：能与mRNA互补配对的RNA分子。两种方法：1、人工合成反义RNA?导入细胞?抑制mRNA2、构建载体?导入细胞?转录反义RNA?抑制mRNA&&&&RNA干涉是指由短双链RNA诱导的同源mRNA的降解过程，可使基因表达受到抑制。原理：双链RNA激活Dicer（酶复合物，由核酸内切酶和解旋酶组成），识别异常的双链RNA并将其切割成短双链RNA（siRNA，21-23bp），siRNA与Dicer结合形成RNA诱导沉默复合物（RISC），双链RNA经解旋酶作用，成为单链RNA，识别并结合靶RNA分子，致核酸内切酶的切割，失去编码蛋白质的功能。两个步骤：1、长双链RNA成为小干涉性RNA（SiRNA);2、RISC形成，识别SiRNA同源的mRNA，并切割。&&&&选择目标RNA干涉靶点的注意点：1、避开蛋白结合部位，选择AUG下游50-100bp区的AA（N19）TT或AA（N21）序列；2、GC比50%左右，长30nt；&&&&3、与其它RNA序列无同源性。&&&&主要步骤：1、确定目标RNA并选择被干涉靶点；2、准备针对目标RNA的siRNA；3、用siRNA干涉目标RNA;4、目标RNA含量和蛋白质水平的分析。&&&&第十三章基因工程&&&&DNA重组（DNArecombination）：不同来源的DNA分子通过共价连接（磷酸二酯键）而组合成新的DNA分子，这一过程称为DNA重组。重组DNA技术又称为分子克隆技术或基因工程技术。&&&&分子克隆：在体外对DNA分子按照既定目的和方案进行人工重组，将重组分子导入宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该DNA分子的大量拷贝。&&&&基因工程(geneticengineering)：有目的地通过分子克隆技术，利用克隆基因表达、制备特定的蛋白或多肽产物，或定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程。&&&&基因工程的研究内容：1.目的基因的获取：从生物有机体的基因组中分离带有目的基因的DNA片段；2.重组：在体外将带有目的基因的DNA片段连接到能自我复制并具有选择标志的载体分子上，形成重组分子；3.将重组分子导入受体细胞（细菌）:K-12。4.带有重组子的细菌扩增，获得大量的繁殖群体。5.筛选：从大量的细胞繁殖群体中筛选出带有重组DNA分子的克隆。6.分析和表达：将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步分析并实现功能蛋白的表达&&&&分子克隆常用的工具酶：一、限制性核酸内切酶：是细菌产生的一类能识别和切割双链DNA分子内特定的碱基顺序的核酸水解酶。分类：可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。Ⅱ型酶作用特点：只有限制性活性，无甲基化活性；只需Mg++作为催化反应辅助因子，无须ＡＴＰ。识别顺序一般为4～6个碱基，通常是回文结构（反转重复顺序），即具有180°的旋转对称。二、DNA连接酶（DNALigase）：T4DNALigase。催化两个独立双链DNA片段5’-磷酸基和3’-羟基之间形成磷酸二酯键；修复双链DNA中一条链上的缺口。三、DNA聚合酶（DNAPolymerase）1、DNApolymeraseI（全酶，Kornbergpolymerase）具有至少3种活性：5’?3’聚合酶活性；5’?3’外切酶活性；3’?5’外切酶活性。应用：1、催化DNA缺口平移（nicktranslation）反应，制备高比活DNA探针；2.第二cDNA链合成3.对双链DNA3’突出末端进行末端标记；4.Sanger测序2、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰklenow片段：5’?3’聚合酶；3’?5’外切酶；缺失5’?3’外切酶活性应用：全酶第2-4。四、逆转录酶（reversetranscriptase）依赖于RNA的DNA聚合酶，这是一种有效的转录RNA成为DNA的酶，产物DNA又称cDNA（complementaryDNA）。用于mRNA为模板合成cDNA，是构建cDNA文库和RT-PCR技术中的关键工具酶。五、末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）:将dNTP加到DNA3’羟基。作用：①3’端标记DNA探针②在载体和待克隆片段上形成同聚物尾，以利DNA重组。六、碱性磷酸酶（AP）：催化去除DNA、RNA、NTP及dNTP的5’磷酸基团。1.在用32P标记5’末端前，去除DNA或RNA的5’磷酸基；2.在连接反应中，去除载体DNA片段5’磷酸基，防止自身环化。&&&&载体(Vector)能在连接酶作用下和外源DNA片段连接并运送DNA分子进入受体细胞的DNA分子&&&&良好的载体应具备以下条件：1.必须有自身的复制子；2.载体分子上必须有限制性内切酶酶切位点,即多克隆位点（multicloningsite,MCS），以供外源DNA插入3.载体应具有可供选择的遗传标志，以区别阳性重组子和阴性重组子；4.载体分子必须具有足够的容量5.可通过特定的方法导入宿主(氯化钙，磷酸钙，电击，等)。6.对于表达载体还应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导顺序，增强子，加尾信号等调控DNA元件。&&&&一、质粒载体：小片段DNA克隆，测序。特点1、分子量相对较小，能在细菌内稳定存在，有较高的拷贝数。2、具有一个以上的遗传标记，便于对宿主细胞进行选择，如抗生素的抗性基因、β-半乳糖苷酶基因（lacZ）等。3、具有多个限制性内切酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这个位点有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，而便于筛选。&&&&二、l噬菌体载体：构建基因文库（shotgun基因组文库、cDNA文库）及表达文库。λDNA可以作为载体，通过替换自身序列的方式携带外源DNA，这种载体称为替换型载体&&&&三、粘性质粒适合克隆较大的DNA片段：由质粒和λ噬菌体的cos粘性末端构建而成。粘粒载体大小为4-6kb，插入片段则可大至29-50kb．应用于大分子量DNA克隆。特点：①含有质粒的抗药性标记如Ampr基因。②带有λ噬菌体的粘性末端（cos区）③具有一个或多个限制性内切酶的酶切位点。④粘性质粒本身不大⑤非重组体粘粒很小，不能在体外包装，因而重组体的本底很低，有利于筛选。&&&&四、M13噬菌体载体：制备单链DNA,人工诱变&&&&五、病毒载体可将外源DNA带入哺乳动物细胞&&&&六、BAC：大片段DNA克隆，0.1-0.4MB。构建物理图谱&&&&基因工程的操作程序：一、制备目的基因和相关载体：1、从基因组文库分离筛选基因。2、通过cDNA文库分离筛选基因。3、人工合成基因：根据核苷酸序列。4、PCR扩增目的基因:已知基因序列或同源序列。载体：λ噬菌体和粘性质粒适用于构建基因组文库，PUC系列质粒适合构建CDNA文库和克隆一些较小的DNA片段，M13噬菌体则适用于克隆一些待测序的DNA片段。二、将目的基因和有关载体进行连接：1、粘性末端最适合DNA片段连接；2、人工接头用于处理不易连接的DNA片段；3、加入同聚物尾是处理不易连接的DNA片段的另一有效方法；4、平端DNA片段可以在T4DNA连接酶的作用下，与某些限制性内切酶产生的平端载体相连接。三、将重组的DNA导入受体细胞：1、转化是直接将DNA导入\细菌的方法；2、感染是利用噬菌体将外源DNA导入宿主细胞的方法；3、转染是将外源DNA导入真核细胞的方法。四、DNA重组体的筛选和鉴定：1、采用遗传学方法可以筛选特定的重组DNA：①利用抗性标记可筛选带有载体的细菌克隆②利用不同标记可筛选出带有重组体的细菌克隆。a、插入灭活法利用特定抗性基因的失活进行筛选；b、?-互补筛选是利用功能互补的基因片段。2、免疫学方法是利用特异性抗体检测表达产物3、核酸杂交法适合从文库中筛选特定的DNA4、PCR技术可对特定的DNA进行直接鉴定；5、酶切鉴定是利用限制性酶酶切图谱鉴定特定的DNA。五、DNA重组体的扩增、表达和其他研究&&&&获取目的基因的方法：&&&&基因组文库：是含有某种生物体全部基因的随机片&&&&段的重组DNA克隆群体，它象一个储存有基因组全&&&&部序列的信息库，称为基因组文库。&&&&cDNA文库：一群含重组cDNA的细菌或噬菌体克隆群体，含有某种生物的全部的mRNA的信息。&&&&转化：质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA导入处于感受态的宿主菌并使其获得新的表型的过程&&&&感染：以噬菌体、粘性质粒和真核细胞病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。&&&&转导：指以噬菌体为载体，在细菌之间转移DNA的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞DNA的过程。&&&&转染：指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。&&&&蓝白筛选原理：某些质粒带有大肠杆菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因区外又另外引入了一段含多种单一限制酶位点的DNA序列。这些位点上如果没有克隆外源性DNA片段，在质粒被导入lac-的大肠杆菌后，质粒携带的半乳糖苷酶基因将正常表达，与大肠杆菌的半乳糖苷酶基因互补，产生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物X-gal和诱导剂IPTG后，出现蓝色的菌落。如果在多克隆位点上插入外源DNA片段，将使lacZ基因灭活，不能生成半乳糖苷酶，结果菌落出现白色。由于这种颜色标志，重组克隆和非重组克隆的区分一目了然。&&&&大肠杆菌体系中表达外源基因所必须具备的条件①要求外源基因的编码区不能含有内含子②表达的外源片段要位于大肠杆菌启动子的下游，并形成正确的阅读框架（ORF）③转录出的mRNA中必须有能与16s核糖体RNA3’端相匹配的SD序列，才能被有效翻译成蛋白质。④蛋白产物必须比较稳定（不易被细胞内的蛋白酶快速降解），且对宿主无害。&&&&原核表达系统（大肠杆菌系统）影响外源基因表达的因素①启动子的强弱；②基因的剂量；③影响RNA转译效率的因素:SDATGmRNA④外源基因密码子的选择；⑤表达产物的大小；⑥表达产物的稳定性。&&&&真核细胞表达外源基因的条件：1、首先必须具备哺乳动物细胞表达的功能元件。要求哺乳动物细胞表达载体带有能在真核细胞中表达外源基因的真核转录调控元件；2、注意选择转染的受体细胞，不同类型的细胞具有不同的特性3、注意选择适当的选择标记。&&&&第十九章基因诊断&&&&基因诊断：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接监测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。&&&&基因诊断常用技术方法：聚合酶链反应(PCR)、核酸分子杂交技术、DNA序列测定、DNA芯片分析、限制性内切酶酶谱分析、单链构象多态性检测&&&&DNA变性：在物理或化学因素的作用下，导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键则不受影响。DNA复性：当促使变性的因素解除后，两条DNA链又可以通过碱基互补配对结合形成DNA双螺旋结构。退火：指将温度降至引物的TM值左右或以下，引物与DNA摸板互补区域结合形成杂交链。&&&&PCR概念CR是近年来发展起来的一种体外扩增特异DNA片段的技术，它根据体内细胞分裂时DNA半保留复制机理，能快速、特异地在体外将目的DNA片段扩增数百万倍。&&&&PCR技术的基本原理：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸３个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA?单链DNA，94℃。退火：引物＋单链DNA?杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度至70℃左右，TaqDNA聚合酶以４种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物３’末端为起点的5’→3’DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。&&&&PCR反应体系：耐热的TaqDNA聚合酶、化学合成的寡聚核苷酸引物(primer)、4种dNTP、以及合适的缓冲液体系。&&&&PCR的反应条件的控制：&&&&1、PCR反应的缓冲液：Tris-HCl缓冲液，KCl促进引物的退火，浓度太高时会抑制TaqDNA聚合酶活性。加入BSA或明胶有利于保护TaqDNA聚合酶活性。必要时加入适量二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺利于破坏模板二级结构，提高PCR反应特异性。&&&&2、镁离子浓度一般用量1.5-2.0mmol/L，TaqDNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。&&&&3、底物浓度工作浓度20-200umol/L，dNTPs浓度过高可加快反应速度，也增加碱基的错配率和实验成本。降低浓度会导致反应速度下降，可提高反应的特异性。在PCR反应中，4种dNTP必须以等摩尔浓度配制，以减少PCR反应的错配误差并提高使用效率。&&&&4、TaqDNA聚合酶75-80℃时具有最高的聚合酶活性，150个核苷酸/秒；具有良好的热稳定性，95℃仍有活性，应用浓度一般为1-2.5u/100ul反应体积。&&&&5、引物0.1-0.5umol/L。引物浓度偏高会引起错配或非特异性扩增、生成引物二聚体，使目的DNA片段产率下降。退火温度与引物Tm值有关，引物Tm值在55-80℃范围较为理想。&&&&6、反应温度和循环次数&&&&变性温度和时间：94℃、30s让模板充分变性，温度太高，对Taq酶不利。&&&&退火温度和时间特异性低于引物Tm值5℃45-55℃30秒-1分钟&&&&延伸温度和时间72℃左右lkb以内1分钟3～4kb需3～4分钟&&&&循环次数25～30次&&&&TaqDNA聚合酶的特性：&&&&5’-3’聚合酶适性：将4种核苷酸以碱基配对方式，按引物5’-3’方向合成新的DNA链。&&&&逆转录酶活性：可直接用于RNA的扩增。&&&&类似末端转移酶的活性：非模板依赖&&&&5’-3’外切酶活性：&&&&缺乏3’-5’外切酶活性：无校正功能，错配率增高。&&&&核酸分子杂交：具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补原则退火形成双链。实质:核酸变性和具有同源序列的两条单链的复性过程。&&&&核酸分子杂交的原理：具有互补序列的两条单链核酸分子在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）碱基互补配对结合，重新形成双链；在这一过程中，核酸分子经历了变性和复性的变化，以及在复性过程中个分子间键的形成和断裂。杂交的双方是待测核酸和已知序列。&&&&影响杂交的因素：1、核酸分子的浓度和长度：核酸浓度越大，复性速度越快。探针长度应控制在50-300个碱基对为好。2、温度：温度过高不利于复性，而温度过低，少数碱基配对形成的局部双链不易解离，适宜的温度是较TM值低25度。3、离子强度：在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度的增加，杂交反应率增加。高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，所以进行序列不完全同源的核酸分子杂交时必须维持杂交反应液中的盐浓度和洗膜液中的盐浓度。4、杂交液中的甲酰胺：甲酰胺能降低核酸杂交的TM值。它有以下优点：在低温下探针更稳定；能更好地保留非共价结合的核酸。5、核酸分子的复杂性：是指存在于反应体系中的不同顺序的总长度。两个不同基因组DNA变性后的相对杂交速率取决于样品浓度绝对一致时的相对复杂性（即DNA中的碱基数）。6、非特异性杂交反应：在杂交前应对非特异性杂交反应位点进行封闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。&&&&探针：指能与某种大分子发生特异性相互作用，并在相互作用之后可以检测出来的生物大分子。&&&&核酸探针：指能识别特异碱基顺序的带有标记的一段单链DNA或RNA分子。&&&&探针的种类和优缺点：1、cDNA探针：通过逆转录获得cDNA后，将其克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒而使cDNA得到大量的扩增。提取质粒后分离纯化作为探针使用。它是目前应用最为广泛的一种探针。2、基因组探针：从基因组文库里筛选得到一个特定的基因或基因片段的克隆后，大量扩增、纯化，切取插入片段，分离纯化为探针。3、寡核苷酸探针：根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针。4、RNA探针：采用基因克隆和体外转录的方法可以得到RNA或反义RNA作为探针。&&&&探针的标记法1、缺口平移法：2、随机引物法3、PCR标记法4、末端标记法&&&&DNA芯片技术就是一种大规模的集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。其方法包括芯片的制备、样品的准备、分子杂交和检测分子。&&&&SSCP：单链构象多态性检测是一种基于DNA构象差别来检测点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，形成的构象就不同，这样就形成了单链构象多态性。&&&&第二十章基因治疗&&&&基因治疗genetherapy:一般是指将限定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的的治疗方法。&&&&一、基因置换可以纠正缺陷基因：&&&&基因置换（genereplacement)或称基因矫正（genecorrection）：特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，让导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因，不涉及基因组的任何改变。&&&&二、基因添加使细胞表达原来不能表达的蛋白&&&&基因添加或称基因增补（geneangmentation）：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。&&&&三、基因干预是抑制特定基因的表达&&&&基因干预（geneinterference）：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。&&&&四、导入自杀基因－－细胞自杀效应&&&&将自杀基因转移入宿主细胞中，该基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞“自杀”，清除肿瘤细胞。&&&&五、基因修饰－－改变细胞的功能特性&&&&①基因修饰肿瘤细胞的“疫苗”疗法②基因修饰TIL的过继免疫方法③免疫增强基因疗法④原位修饰肿瘤免疫原性的基因疗法&&&&基因置换或基因添加的必要条件&&&&①对导入的基因及其产物有详尽的了解②外来基因能有效地导入靶细胞③导入基因能在靶细胞中长期稳定驻留④导入基因能有适度水平的表达⑤基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害&&&&一、逆转录病毒组经过改造后作为基因载体：优点：高效地感染分裂的宿主细胞（100%）；在感染后，逆转录病毒能够将前病毒基因组稳定地整合到宿主基因组的随机位点上；利用重组逆转录病毒能将目的DNA传递给整个细胞群体；逆转录病毒载体可感染多种人和动物的细胞，宿主范围非常广；不产生任何有免疫原性的病毒蛋白，对宿主细胞无毒性作用，可建立细胞系长期持续表达外源基因。缺点：只能整合至分裂相的细胞；容量小（不超10kb)；病毒滴度不高；由于其随机整合，有激活癌基因的潜在危险。&&&&二、腺病毒基因组可作为载体携带治疗基因：优点：①转染效率高、安全；②宿主范围广③与细胞分裂无关④重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注，对患者进行治疗⑤容量大，可插入7.5KB外源基因⑥制备较易，病毒滴度较高。缺点:①不能整合到染色体,表达时间短暂(1-6周);②具有免疫原性;反复治疗效率降低;③缺陷病毒可与宿主基因组或其它病毒发生重组,产生危险系数高的新病毒&&&&三、腺病毒相关病毒载体适合治疗基因的稳定长效表达优点:是非病原微生物,未发现野生型AAV与人类疾病有关;它既能感染分裂细胞,又能感染非分裂细胞;宿主范围广,能感染多种宿主细胞;插入突变的危险性相当低。缺点：只能包装小于5kb的目的基因片段，相对转基因能力受限；整合时需要辅助病毒感染才能进行复制，增加包装的难度；很难大量生产。&&&&四、单纯疱疹病毒载体适合将治疗基因导入神经细胞&&&&优点：HSV载体能携带30-50kb的外源基因，可在多种细胞中复制；能感染分裂和非分裂细胞，对神经细胞易感。缺点：病毒不能整合入宿主细胞染色体，只能短暂表达；对感染的细胞产生毒性作用。&&&&治疗基因调控策略：1、利用基因内部调节机制使治疗基因受控表达：使用正常细胞的组织特异性顺式元件；使用病变细胞的组织特异性顺式元件。2、利用基因外部调节机制使治疗基因受控表达。3、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达。4、利用诱导表达系统控制治疗基因的诱导表达。&&&&反义RNA：碱基序列正好与有意义的mRNA互补的RNA称为反义RNA。可以作为一种调控特定基因表达的手段。反义核酸技术：是通过合成一种短链且与DNA或RNA互补的，以DNA或RNA为目标抑制翻译的反义分子，干扰目的基因的转录、剪接、转运、翻译等过程的技术。&&&&核酶：是一种可以催化RNA切割和RNA剪接反应的由RNA组成的酶，可以作为基因表达和病毒复制的抑制剂。&&&&三链DNA：当某一DNA或RNA寡核苷酸与DNA高嘌呤区可结合时可形成三链，能特异地结合在DNA的大沟中，并与富含嘌呤链上的碱基形成氢键，阻止基因的转录。&&&&&&&& 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