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上饶师范学院自编讲义
微生物学实验指导
上饶师范学院生命科学系
2006年9 月
实验一光学显微镜??油镜的使用…………………………2
实验二细菌的革兰氏染色……………………………………4
实验三放线菌的形态观察……………………………………6
实验四酵母菌形态观察………………………………………7
实验五霉菌形态观察………………………………………9
实验六培养基的制备………………………………………11
实验七高压蒸汽灭菌………………………………………13
实验八微生物的分离、纯化………………………………15
实验九微生物大小的测定…………………………………17
实验十微生物数量的测定…………………………………19
光学显微镜??油镜的使用一、实验目的和内容
目的:复习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术,了解油浸系物镜的基本原理,掌握油浸系物镜的使用方法。
内容:1.学习油浸系物镜的使用方法。 2.用油镜观察大肠杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。
二、实验材料和用具
大肠杆菌E.coli、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的染色装片。
香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。
三、操作步骤
一观察前的准备
1.将显微镜置于平稳的实验台上,镜座距实验台边沿约为4cm。坐正,练习用左眼观察。
2.调节光源:将低倍物镜转到工作位置,把光圈完全打开,聚光器升至与载物台相距约1mm左右。转动反光镜采集光源,光线较强的天然光源宜用平面镜,光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜,对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时,光线宜强;观察末染色装片时,光线不宜太强。
二低倍镜观察染色装片
首先上升镜简,将枯草芽孢杆菌
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放线菌分离培养基筛选及杂菌抑制方法研究
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3秒自动关闭窗口放线菌液体培养如何不长菌球 - 微生物 - 小木虫 - 学术 科研 第一站
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放线菌液体培养如何不长菌球
各位大神，求助，放线菌液体培养的过程中，如何避免长成球状？入什么样的培养基或者什么方法可以避免？
只能避免长成大球状，因为放线菌液体培养时就是球状的，只能说长成微小颗粒球状最好。
你可以在配置培养基的时候加入少量玻璃珠，这样生长时能够将菌体打碎。
培养基选择上尽量选择营养丰富的培养基，TSB这类的。
还有在接菌的时候保证接种量，不要只粘一个小点的孢子。 貌似我做的也是有很小的球球，菌丝团在一起的，一般加玻璃珠就好了 加吐温，或者大豆油，增加溶氧系。。。
var cpro_id = 'u1216994';
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E-mail： & QQ：8835100当前所在位置：&&一种培养游动放线菌获取雷帕霉素发酵液的方法
一种培养游动放线菌获取雷帕霉素发酵液的方法
项目编号：
技术简要说明
本发明公开了一种利用游动放线菌获取雷帕霉素发酵液的方法，属于发酵工程技术领域。步骤如下：在斜面培养基上培养游动放线菌（Actinoplanes）CGMCC?No.8430，将培养好的斜面菌种接种到摇瓶种子培养基，再将培养好的种子液接种到种子罐中，之后接种到发酵培养基中发酵培养，得雷帕霉素发酵液。本发明通过培养基的优化及培养条件的控制，能够使游动放线菌产生较高浓度的雷帕霉素，在30L发酵罐的发酵实验中，雷帕霉素的产量可达到750mg/L左右，在200L发酵罐的发酵实验中，雷帕霉素的产量可达到840mg/L左右，使雷帕霉素更容易满足工业化生产的需要，且高浓度更有利于后续的提取工作。
该专利技术资料仅供研究查看技术是否侵权等信息，商用须获得专利权人授权。
该专利全部权利属于天津北洋百川生物技术有限公司，未经天津北洋百川生物技术有限公司许可，擅自商用是侵权行为。
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专利权信息
专利类型：发明
专利申请日：
公开(公告)日：
申请(专利权)人：天津北洋百川生物技术有限公司
申请人：天津北洋百川生物技术有限公司
公开(公告)号：CNA
分类号：C12P17/18(2006.01)I
发明(设计)人：乔长晟;石漫漫;李雪;朱明
国别省市：
总流量：108
录入日期： 19:52
温馨提示：该专利受国家知识产权法保护。如您希望使用该专利，请联系专利权人，获得专利权人的授权许可。
一种培养游动放线菌生产雷帕霉素发酵液的方法，其特征在于，所述游动放线菌为保藏编号CGMCC?NO.8430的菌株，具体方法如下：（1）菌种活化将甘油保存的游动放线菌（Actinoplanes）转接至保藏分离培养基，于恒温培养箱中，28℃培养7?15d，至斜面由橙色变为黄褐色；（2）摇瓶种子培养选择生长良好的活化斜面，取1cm2大小的菌种转接于新鲜种子培养基中，于28℃，180?250r/min的立式摇床上，培养40?55h；（3）种子罐种子培养：将摇瓶种子培养液以6%?15%接种量接种于种子罐培养基中，28℃，培养38?52h，得种子液；（4）发酵培养将种子液以8?15%的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，通入无菌空气并开启搅拌，于28℃，培养30?48h后，一次性补加赖氨酸；继续发酵110h?160h，得到雷帕霉素发酵液。
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ip：61.142.9.*来自：印度CZ88.NET发酵有时也写作酦酵其定义由使用场合的不同而不同通常所说的发酵多是指生物体对于有机物的某种分解过程发酵是人类较早接触的一种生物化学反应如今在食品工业生物和化学工业中均有广泛应用其也是生物工程的基本过程即发酵工程对于其机理以及过程控制的研究还在继续
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培养基Medium是供微生物植物组织和生长和维持用的人工配制的养料一般都含有碳水化合物含氮物质包括微量元素以及维生素和水等有的培养基还含有抗菌素和色素用于单种微生物培养和鉴定外文名Medium作&&&&用供微生物、植物和动物组织生长保存方法防潮、避光、阴凉处保存保存温度2-25℃
培养基Medium是供和动物组织生长和维持用的人工配制的养料一般都含培养基有含氮物质包括以及和水等有的培养基还含有激素和血清
培养基由于配制的原料不同使用要求不同而贮存保管方面也稍有不同一般培养基在受热吸潮后易被污染或分解变质因此一般培养基必须防潮避光阴凉处保存对一些需严格灭菌的培养基如组织培养基较长时间的贮存必须放在3-6℃的冰箱内由于液体培养基不易长期保管均改制成粉末1.配料
配方换算→在容器中加入少量水蒸馏水自然水→按照配方称取各种药品依次加入→加足所需水量一药一勺取药后立即盖上瓶盖
淀粉溶解少量冷水调成糊状
加热溶解特别是加有琼脂的培养基一定要煮沸琼脂的熔解温度95-97℃ 且需要边加热边搅拌以防止烧焦
用1N的盐酸或的1N NaOH把培养基调节到所要求的值
滤纸或棉花进行过滤
一般培养基放在三角瓶或试管中灭菌使用
若作静置培养则100ml培养基/250ml的三角瓶最多不能超过150ml培养基/250ml的
三角瓶否则灭菌时培养基沸腾容易污染棉塞造成染菌若作摇瓶培养则15-20ml培养基/250ml的三角瓶保证通气良好
(2)试管分装
液体培养基一般装4-5ml约试管的1/4高度
固体斜面培养基一般装3-4ml约试管的1/5高度
分装好后塞上棉塞在用牛皮纸将棉塞包裹好防止灭菌时水份进入把棉塞弄湿
按配方上要求的温度压力进行高压蒸汽灭菌如果灭菌的温度太高营养成分会被破坏培养
基中的糖氨基酸会使培养基的颜色变深
灭菌后需要摆斜面的试管要趁热斜着摆放使其凝固成为一个斜面约占试管长度的1/2
培养基在30℃下放置一天无污染的即可使用一般用牛皮纸包裹好存放于2-8℃冰箱中备用1选择适宜的营养物质　　总体而言所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源氮源无机盐生长因子水及能源但由于微生物营养类型复杂不同微生物对营养物质的需求是不一样的因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基自养型微生物能从简单的无机物合成自身需要的糖类脂类蛋白质核酸维生素等复杂的有机物因此培养自养型微生物的培养基完全可以(或应该)由简单的无机物组成例如培养化能自养型的氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thiooxdans)的培养基组成见表3.9在该培养基配制过程中并末专门加入其他碳源物质而是依靠空气中和溶于水中的CO2为氧化硫硫杆菌提供碳源　　就微生物主要类型而言有细菌放线菌酵母菌霉菌原生动物藻类及病毒之分培养它们所需的培养基各不相同在实验室中常用牛肉膏蛋白胨培养基(或简称普通肉汤培养基)培养细菌用高氏I号合成培养基培养放线菌培养酵母菌一般用麦芽汁培养基培养霉菌则一般用查氏合成培养基　　2营养物质浓度及配比合适　　培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用例如高浓度糖类物质无机盐重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长反而起到抑菌或杀菌作用另外培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代谢产物的形成和积累其中碳氮比(C/N)的影响较大严格地讲碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质的量比值有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比例如在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中培养基碳氮比为4/1时菌体大量繁殖谷氨酸积累少当培养基碳氮比为3/1时菌体繁殖受到抑制谷氨酸产量则大量增加再如在抗生素发酵生产过程中可以通过控制培养基中速效氮(或碳)源与迟效氮(或碳)源之间的比例来控制菌体生长与抗生素的合成协调　　3控制pH条件　　培养基的pH必须控制在一定的范围内以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相同一般来讲细菌与放线菌适于在pH7-7.5范围内生长酵母菌和霉菌通常在pH4.5-6范围内生长值得注意的是在微生物生长繁殖和代谢过程中由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累会导致培养基pH发生变化若不对培养基pH条件进行控制往往导致微生物生长速度下降或(和)代谢产物产量下降因此为了维持培养基pH的相对恒定通常在培养基中加入pH缓冲剂常用的缓冲剂是一氢和二氢磷酸盐(如KH2PO4 和K2HPO4)组成的混合物K2HPO4溶液呈碱性KH2PO4溶液呈酸性两种物质的等量混合溶液的pH为6.8当培养基中酸性物质积累导致H+浓度增加时H+与弱碱性盐结合形成弱酸性化合物培养基pH不会过度降低如果培养基中OH-浓度增加OH-则与弱酸性盐结合形成弱碱性化合物培养基pH也不会过度升高　　但KH2PO4 和K2HPO4缓冲系统只能在一定的pH范围内(6.4-7.2)起调节作用有些微生物如乳酸菌能大量产酸上述缓冲系统就难以起到缓冲作用此时可在培养基中添加难溶的碳酸盐(如CaCO3)来进行调节CaCO3难溶于水不会使培养基pH过度升高但它可以不断中和微生物产生的酸同时释放出CO2将培养基pH控制在一定范围内　　在培养基中还存在一些天然的缓冲系统如氨基酸肽蛋白质都属于两性电解质也可起到缓冲剂的作用　　4控制氧化还原电位(redox potential)　　不同类型微生物生长对氧化还原电位(F)的要求不一样一般好氧性微生物在F值为+0.1V以上时可正常生长一般以+0.3一+0.4V为宜厌氧性微生物只能在F值低于+0.1V条件下生长兼性厌氧微生物在F值为+0.1V以上时进行好氧呼吸在+0.1V以下时进行发酵F值与氧分压和pH有关也受某些微生物代谢产物的影响在pH相对稳定的条件下可通过增加通气量(如振荡培养搅拌)提高培养基的氧分压或加入氧化剂从而增加F值在培养基中加入抗坏血酸硫化氢半胱氨酸谷胱甘肽二硫苏糖醇等还原性物质可降低F值　　5原料来源的选择　　在配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成分特别是在发酵工业中培养基用量很大利用低成本的原料更体现出其经济价值例如在微生物单细胞蛋白的工业生产过程中常常利用糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)豆制品工业废液及黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等都可作为培养基的原料再如工业上的甲烷发酵主要利用废水废渣作原料而在我国农村已推广利用人畜粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料另外大量的农副产品或制品如鼓皮米糠玉米浆酵母浸膏酒糟豆饼花生饼蛋白胨等都是常用的发酵工业原料　　6灭菌处理　　要获得微生物纯培养必须避免杂菌污染因此对所用器材及工作场所进行消毒与灭菌对培养基而言更是要进行严格的灭菌对培养基一般采取高压蒸汽灭菌一般培养基用1.05kg/cm2121.3℃条件下维持15-30min可达到灭菌目的在高压蒸汽灭菌过程中长时间高温会使某些不耐热物质遭到破坏如使糖类物质形成氨基糖焦糖因此含糖培养基常在0.56kg/ cm2112.6℃15-30分钟进行灭菌某些对糖类要求较高的培养基可先将糖进行过滤除菌或间歇灭菌再与其他已灭菌的成分混合长时间高温还会引起磷酸盐碳酸盐与某些阳离子(特别是钙镁铁离子)结合形成难溶性复合物而产生沉淀因此在配制用于观察和定量测定微生物生长状况的合成培养基时常需在培养基中加入少量螯合剂避免培养基中产生沉淀常用的螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)还可以将含钙镁铁等离子的成分与磷酸盐碳酸盐分别进行灭菌然后再混合避免形成沉淀高压蒸汽灭菌后培养基pH会发生改变(一般使pH降低)可根据所培养微生物的要求在培养基灭菌前后加以调整　　在配制培养基过程中泡沫的存在对灭菌处理极不利因为泡沫中的空气形成隔热层使泡沫中微生物难以被杀死因而有时需要在培养基中加入消泡沫剂以减少泡沫的产生或适当提高灭菌温度指一类利用动植物或微生物体包括其提取物制成的培养基如牛肉膏培养基等固体培养基又称为或综合培养基是一类按微生物的营养要求精确设计后用多种高纯化学试剂配制成的培养基如铵盐培养基等指一类主要以化学试剂配制同时还加有某种或某些天然成分的培养基例如马铃薯蔗糖培养基一类配制成的液体状态的基质液体培养基一类配制成的固体状态的基质根据性质又分为固化培养基非可逆性固化培养基天然固态培养基滤膜指在中加入少量的凝固剂而配制成的半固体状态的培养基又称预制指含有除水分外的一切成分的商品培养基一类根据某微生物的特殊营养要求或其对某化学物理因素的抗性而设计的培养基具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能广泛用于筛选等领域
一类在成分中加有能与目的菌的无色发生的指示剂从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便的从近似中找出目的菌菌落的培养基例如美蓝培养基EMB牛肉膏培养基
0.3g 蛋白胨1.0g0.5g琼脂1.5g水100ml
在烧杯内加水100ml放入牛肉膏蛋白胨和氯化钠用蜡笔在烧杯外作上记号后放在火上加热待烧杯内各组分溶解后加入琼脂不断搅拌以免粘底等琼脂完全溶解后补足失水用10%或10%的调整pH值到7.2-7.6分装在各个试管里加棉花塞用1.05千克每平方厘米121摄氏度维持15-30分钟
牛心培养基
取新鲜牛心除去和血管250克用刀细细剁成肉末后加入500毫升和5克蛋白胨在细菌培养基烧杯上做好记号煮沸转用文火炖2小时过滤滤出的肉末干燥处理滤液pH值调到7.5左右每支试管内加入10毫升肉汤和少量碎末状的干牛心灭菌备用
根瘤菌培养基
葡萄糖10g0.5g3g0.2g酵母粉0.4琼脂20g水1000ml1%溶液1ml
先把琼脂加水煮沸溶解然后分别加入其他组分搅拌使溶解后分装灭菌备用淀粉硝酸盐培养基高氏一号培养基
可溶性淀粉2.0g0.1g磷酸氢二钾0.05g氯化钠0.05g硫酸镁0.05g0.001g琼脂2g水100ml
先把放在烧杯里用5ml水调成糊状后倒入95ml水搅匀后加入其他药品使它溶解在烧杯外做好记号加热到煮沸时加入琼脂不停搅拌待琼脂完全溶解后补足失水调整pH值到7.2-7.4分装后灭菌备用
面粉琼脂培养基
面粉60g琼脂20g水1000ml
把面粉用水调成糊状加水到500ml放在文火上煮30分钟另取500ml水放入琼脂加热煮沸到溶解后把两液调匀补充水分调整pH值到7.4分装灭菌备用BG-11培养基
NaNO3 1.5gK2HPO4 ·3H2O0.04gMgSO4·7H2O0.075gCaCl2 ·2H2O0.036g Citric Acid
0.006gFerric ammonium citrate0.006gEDTA (dinatrium-salt) 0.001gNa2CO3 0.02gA5 + Co solution * A5溶液1000×1ml Distilled Water 蒸馏水919ml
K2HPO4 . 3H2O
MgSO4 . 7H2O
CaCl2 . 2H2O
Soil extract
FeCl3·6H2O
A5 solution 1000×
distilled water
Soil Extract(土壤提取液)配置方法
取花园土未施过肥0.5kg置于烧杯或三角瓶中加入蒸馏水1000毫升瓶口用透气塞封口在水浴中沸水加热2小时冷却数小时在无菌条件下过滤取上清液将灭菌蒸馏水加入上清液至总体积1000毫升土壤提取液保存在4&C备用
Composition of the A5 solution
Add to 100 ml of distilled water:
MnCl2 . 4H2O
ZnSO4 . 7H2O
CuSO4 . 5 H2O
(NH46Mo7O24 .4H2O
EDTA-Fe的配置方法
将EDTA和FeCl3·6H2O分别溶于水和HCl(0.1N)混匀即可
distilled water
FeCl3·6H2O
Preparation: to 997 mL of glass-distilled water, add 1.0 g proteose peptone, 15.0 g agar, and the following stock solutions:
working solution
g/1000 mL H2O
CaCl2. 2H2O
MgSO4. 7H2O
A5 solution
FeCl3 (0.05%)
A5溶液和EDTA-Fe溶液配制方法同上萨市Sabourauds培养基
蛋白胨10g琼脂20g40g水1000ml
先把蛋白胨琼脂加水后加热不断搅拌待琼脂溶解后加入40g麦芽糖或葡萄糖搅拌使它溶解然后分装灭菌备用
本培养菌是培养许多种类所常用的
马铃薯糖琼脂培养基
把马铃薯洗净去皮取200g切成小块加水1000ml煮沸半小时后补足水分在滤液中加入10g琼脂煮沸溶解后加糖20g用于培养的加入蔗糖用于培养的加入葡萄糖补足水分分装灭菌备用
把这培养基的pH值调到7.2-7.4配方中的糖如用葡萄糖还可用来培养和
豆芽汁培养基
黄豆芽100g琼脂15g葡萄糖20g水1000ml
洗净黄豆芽加水煮沸30分钟用纱布过滤滤液中加入琼脂加热溶解后放入糖搅拌使它溶解补足水分到1000ml分装灭菌备用
把这培养基的pH值调到7.2-7.4可用来培养细菌和放线菌
豌豆琼脂培养基
豌豆80粒琼脂5g水200ml
取80粒干豌豆加水煮沸1小时用纱布过滤后在中加入琼脂煮沸到溶解分装灭菌备用琼脂马铃薯-蔗糖-琼脂培养基
20%马铃薯煮汁1000ml蔗糖20g琼脂18g
把马铃薯洗净去皮后切成小块称取马铃薯小块200g加水1000ml煮沸20分钟后过滤在滤汁中补足水分到1000ml即成20%马铃薯煮汁在马铃薯煮汁中加入琼脂和蔗糖煮沸使它溶解后补足水分分装灭菌备用使用该培养基对pH值要求不严格可以不测定
综合马铃薯培养基
20%马铃薯煮汁1000ml3g硫酸镁1.5g葡萄糖20g维生素10mg琼脂18g
先配制20%马铃薯煮汁方法同上在煮汁中加入上述各种组分加热溶解后补足水分调整pH值到6分装灭菌备用 该培养基用于培养和保存等菌种在时通过调节IAA和CTK的比值能影响分化出根或芽CTK/IAA高时愈伤组织分化芽
CTK/IAA低时分化根CTK/IAA比例适中维持愈伤组织不分化
愈伤组织诱导培养基制备
以MS培养基为基础向洁净铝锅中顺序加入20×母液100mL,微量元素100×母液20mL,铁盐100×母液20mL 维生素100×母液20mL肌醇200×母液10mL,200×母液10mL配制得MS培养基后再加入0.5mg·L-1的BA8mL0.5mg·L-1的NAA8mL然后加入实际配制培养基体积约2/3-3/4的蒸馏水加入40g蔗糖后搅拌使其溶化用0.5mol·L-1的NaOH和0.5 mol·L-1的HCl调整pH值至5.8-6.0加入14g琼脂将铝锅置于电炉上,搅拌加热使琼脂完全溶化然后用蒸馏水定容至终体积2L继续加热几分钟使之混合均匀后分装于三角瓶中
烟草叶片愈伤组织诱导烟草取一无菌用解剖刀切取1-2片无菌苗叶片置于无菌培养皿中并用解剖刀将叶片切成2mm2左右的小片然后将其接种于准备好的培养基上每瓶接种5小片一共接种6瓶接种后的三角平置于24条件下黑暗培养1周然后在同样温度下有光照和全黑暗下培养3周直至愈伤组织形成(两种情况各置3瓶)观察愈伤组织诱导结果统计愈伤组织诱导率
器官分化及植株再生培养
将诱导的愈伤组织按类型分别转入分化培养基上,置于连续光照温度20-22℃条件下培养3周统计愈伤组织再生植株情况
愈伤组织诱导的总体情况
烟草愈伤组织诱导培养4周后愈伤组织基本形成即排除因生长时间不够而未形成愈伤的情况具体情况见表一中所示6瓶培养物均有愈伤形成且都未发生污染但诱导率几乎各不相同其中 在光照条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为60.0℅在黑暗条件下培养的3瓶平均愈伤诱导率为46.7%由于实验过程中即烟草叶片取得偏小接种时可能已有部分外植体的大部分脱水死亡使整个实验的愈伤组织诱导率偏低,愈伤块偏小RPMI1640培养基是一个全营养型培养基广泛应用于细胞和的培养如人鼠杂交瘤细胞人以及和最初设计用于悬浮细胞培养和人白血病细胞的
选择性培养基是指根据某种的特殊营养要求或其对某化学物理因素的抗性而设计的培养基其功能是使混合菌样中的劣势菌变成优势菌从而提高该菌的筛选效率
酵母菌富集培养基
葡萄糖5%0.1%0.1%磷酸二氢钾0.25%0.05%七水合硫酸镁0.1%七水合0.01%酵母膏0.05%0.003%pH4.5
Ashby无氮培养基
富集好氧自生
甘露醇1%磷酸二氢钾0.02%七水合硫酸镁0.02%氯化钠0.02%0.01%碳酸钙0.5%EMB培养基
常用于鉴别
蛋白胨10g乳糖5g蔗糖5g磷酸氢二钾2g伊红Y0.4g美蓝0.065g蒸馏水1000gpH7.2
2216E培养基配方
分离的培养基配方
蛋白胨5g酵母膏1g0.01g琼脂15-20g1000ml煮沸氢氧化钠5%的溶液调PH值7.6-7.8
可用于检测水中的含量
首先按以下组成配制
蛋白胨10gNaCl5g
琼脂15-20g
将上述物质溶解后用蒸馏水定容至1000mL调节pH为7.6灭菌后冷却至60℃左右再按下面的比例在无菌操作条件下加入灭菌的乳糖溶液伊红水溶液以及美蓝水溶液摇匀后立即倒平板溶液中的乳糖在高温下会破坏因此一般使用压力为70kPa温度为115℃的条件灭菌20分钟
基础培养基100mL20%乳糖溶液2mL
2%伊红水溶液2mL0.5%美蓝水溶液1mL天然培养基是指来自动物体液或利用提取的一类培养基如血清淋巴液鸡胚浸出液等建立早期细胞都是利用但是由于制作过程复杂批间差异大因此逐渐为合成培养基所替代广泛使用的是血清另外各种组织提取液促进细胞贴壁的胶原类物质在培养某些特殊细胞也是必不可少
目用于组织培养的血清主要是牛血清培养某些特殊细胞也用人血清马血清等选择用牛血清培养细胞的原因来源充足制备技术成熟经过长时间的应用考验人们对其有比较深入的理解牛血清对绝大多数哺乳动物细胞都是适合的但并不排除在培养某种细胞时使用其他动物血清更合适
牛血清是细胞培养中用量最大的含有丰富的必须的营养成份具有极为重要的功能牛血清分为小牛血清新牛血清胎牛血清应取自剖腹产的胎牛新牛血清取自出生24小时之内的新生牛小牛血清取自出生10-30天的小牛显然胎牛血清是品质最高的因为胎牛还未接触外界血清中所含的抗体补体等对细胞有害的成分最少
血清的主要成分血清样本血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物其组成成份虽大部分已知但还有一部分尚不清楚且血清组成及含量常随供血动物的性别年龄生理条件和营养条件不同而异血清中含有各种碳水化合物激素无机物等这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的
血清主要作用
1 提供维生素脂类物质衍生物等是细胞生长必须的物质
2 提供激素和各种生长因子胰岛素氢化可的松地塞米松雌二醇睾酮孕酮等生长因子如成纤维细胞生长因子血小板生长因子等
3 提供结合蛋白结合蛋白作用是携带重要地低分子量物质如携带维生素以及激素等转铁蛋白携带铁结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用
4 提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤
5 对培养中的细胞起到某些保护作用有一些细胞如内皮细胞样细胞可以释放蛋白酶血清中含有抗蛋白酶成分起到中和作用这种作用是偶然发现的则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用因为胰蛋白酶已经被广泛用于的消化血清蛋白形成了血清的粘度可以保护细胞免受机械损伤特别是在搅拌时粘度起到重要作用血清还含有一些微量元素和离子他们在解毒中起重要作用如SeO3硒等
血清培养基主要问题
1 血清的成份可能有几百种之多对其准确的成份含量及其作用机制不清楚尤其是对其中一些多肽类生长因子激素和脂类等尚未充分认识这给研究工作带来许多困难
2 血清都是批量生产各批量之间差异很大而且血清保存期至多一年因此要保证每批血清的相似性极为困难从而使实验的标准化和连续性受到限制
3 对大多数细胞在体内状态血清不是它们接触的生理学液体只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态血清可能促进某些细胞的生长成纤维细胞同时抑制另一类细胞生长
4 血清含一些对细胞产生毒性的物质如氧化酶能与来自高度繁殖细胞的多胺反应如形成有作用的聚精胺补体抗体等都会影响细胞生长甚至造成细胞死亡
5 动物个体不同血清产地批号不同每批质量差异甚大其成分不能保持一致
6 取材中可能带入病毒对细胞产生潜在影响可能导致实验失败或实验结果不可靠性
7 大规模生产中血清来源越来越困难价格昂贵是构成对生产成本的主要部分之一
血清的质量标准
血清质量高低取决于两方面因素一是取材对象二是取材过程用于取材的动物应健康无病并且在指定的出生天数之内取材过程应严格按照操作规程执行制备出的血清要经过严格的质量鉴定WHO公布的用动物细胞体外培养生产规程中的要求
1 牛血清必须来自有文件证明无牛海绵状脑病的牛群或国家并应具备适当的监测系统
2 有些国家还要求牛血清来自未用过反刍动物蛋白饲料的牛群
3 证明所用牛血清中不含对所生产疫苗病毒的抑制物
4 血清要通过滤膜过滤除菌保证无菌
5 无细菌霉菌支原体和病毒的污染有些国家要求无污染
6 对细胞有良好的支持繁殖作用
我国在对牛血清的质量2000年版中国生物制品主要原辅料质控标准中提出比较严格的标准要求包括含量细菌真菌支原体牛病毒细菌支持检查一配制用水
培养基的大部分是水所以水的质量直接影响培养基的质量按Waymouth标准水的电阻应为200万欧姆一般实验室里以玻璃蒸馏器制备的
或可以符合使用条件
培养基有天然人工两种一般实验室使用的是RPMI-1640粉末培养基以双蒸或三蒸水配制NaHCO3或HCl调pH至7.2-7.4若pH值超过7.6或远低于6.8则大多数细胞不能生长RPMI-1640不耐高压灭菌使用前需经灭菌0.22μm孔径滤膜滤过处理
培养中常使用小牛血清或胎牛血清血清亦不能高压灭菌无菌的小牛血清需在56℃水浴30分钟灭活补体置4℃冰箱存放待用配制时含量视培养细胞种类时间而定一般用1015%由于血清成分复杂条件不易控制可选用
为防止培养时期细菌的污染可在培养基中添加适当抗菌素一般用量与组织相同卡那霉素100单位/毫升或双抗--青霉素100单位/毫升链霉素100微克/毫升
五植物血凝素PHA
非增殖期的细胞不能制备染色体如人外周血淋巴细胞但在离体培养过程中在PHA的作用下可被刺激转化为淋巴母细胞而进入有丝分裂
经实验测定其分裂高峰分别于培养后44-48小时和68-72小时
PHA有粘蛋白质两种重要成分促使有丝分裂蛋白质起PHA激活的细胞数随其浓度而增加直至全部免疫活性细胞均
被激活为止但PHA浓度过高会引起凝集一般采用4%浓度为好同一种培养基的配方在不同著作中常会有某些差别因此除所用的是标准方法应严格按其规定进行配制外一般均应尽量收集有关资料加以比较核对再依据自己的使用目的加以选用记录其来源每次制备培养基均应有记录包括培养基名称配方及其来源和各种成份的牌号最终pH值消毒的温度和时间制各的日期和制备者等记录应复制一份原记录保存备查复制记录随制好的培养基一同存放以防发生混乱培养基的各种成分必须精确称取并要注意防止错乱最好一次完成不要中断可将配方置于傍侧每称完一种成分即在配方上做出记号并将所需称取的药品一次取齐置于左侧每种称取完毕后即移放于右侧完全称取完毕后还应进行一次检查培养基所用化学药品均应是化学纯的使用的蒸煮锅不得为铜锅或铁锅以防有微量铜或铁混入培养基中使细菌不易生长最好使用不锈钢锅加热溶化也可放入大烧杯或大烧瓶中置高压蒸汽灭菌器或流动蒸汽消毒器中蒸煮溶化在锅中溶化时可先用温水加热并随时扰动以防焦化如发现有焦化现象该培养基即不能使用应重新制备待大部分固体成分溶化后再用较小火力使所有成分完全溶化迄至煮沸如为琼脂培养基应先用一部分水将琼脂溶化用另一部分水溶化其它成分然后将两溶液充分混合在加热溶化过程中因蒸发而丢失的水分最后必须加以补足培养基各成分完全溶解后应进行pH的初步调正因培养基在加热消毒过程中pH会有所变化例如牛肉浸液约可降低pH0.2而肠浸液pH却会有显著的升高因此对这个步骤操作者应随时注意探索经验以期能掌握培养基的最终pH保证培养基的质量pH调正后还应将培养基煮沸数分钟以利培养基沉淀物的析出培养基在使用前通过高压或过滤灭菌防止污染应该注意以下事项
确认工作细胞库是否被污染确认毒种工作种子批是否被污染确认所用培养基及其添加成分(如小牛血清NaHCO3等)是否被污染均可用细菌真菌及支原体无菌试验来确认并排除同时要对无菌试验培养基的灵敏度进行验证实际生产中可以从配制好的培养液中取少量加入营养琼脂于恒温培养箱内培养48小时即可观察有无污染
其它高压灭菌设备过滤除菌设备均应进行验证确保灭菌和除菌效果;前者应在投产前及其后的每6个月进行验证后者应在每次除菌前后进行验证工作(至少应在除菌后进行一次)
另外应将有毒区与无毒区严格分开并有各自独立的空气净化系统及孵室有毒区对无毒区应保持相对负压防止病毒对培养细胞(尤其是细胞库)的污染[1]
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