荧光定量PCR实验相对定量法中的RQ代表什么意义？还有RQ min和RQ max？RT。求大侠解答。。。这个值是怎么得出的？
RQ就是相对定量的意思。 relative quantification。
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PCRPCRPCRPCRPCR
nPCR100%PCRDNA2Y= X(1+E)n E E =
1105n30E n&30EY
PCRPCRPCRPCRPCR
Tn=Tn-11+En [0
EnTnnPCRTn-1n-1PCRT0PCR(K1010)CPcrossing point,K= T01+ECP
T0+CP*lg(1+E)
1/lg(1+E)*lg T0 +lgk/lg(1+E)
PCREKCPlg T0y=kx+b,- 1/lg(1+E)lgk/lg(1+E)PCRRT-PCR
PCR(Slope)- 1/lg(1+E)E=10-1/Slope-1 ,Slope=-3.337,E=101/3337-1=0.99,(1+E)EE=10-1/SlopeE122PCR10PCRN2=N0En2, N3=(10*N0)En3,N2=N3En2-n3=10,ngE=1, E=101/nE=2n=3.32; E=1.8n=3.91.
SYBR Green I
SYBR Green
Green IPCRDNASYBR Green I 497nm520nmPCR94557240
SYBR Green
I SYBR Green
SYBR Green ISYBR Green IDNA
PCRPCR-ELISAPCR1PCRPCR2cDNAPCRmimic3PCRPCR96PCR96PCR
2PCRPCR301010/452396
APCRPCRPCRPCR
BPCRPCRCtPCR
2CtCtPCRTexas
PCRPCRPCRPCRPCR
1)genebankwww.ncbi.nlm.nih.gov
2)Primer5.0Oligo6.0beacon designs3.0www.
D2025bp,Tm5565GC40%60%100-250bp
B2030bpTm6570510GC40%70%
3blast(www.ncbi.nlm.nih/blast)
4FAMTexas redLC-Red640LC-Red705PCRTaqmanbeacon
6120bpPCRPCRTEDNA6.0102345107/ml106/ml105/ml104/ml103/ml
725pmol/ul2025pmol/ulul
(OD33)40000
1PCR buffer0.3-0.5pmol/ul0.10.3pmol/ul2.5-4.0mMMg2+1-2UTaq0.20.4mMdNTPs0.2-1UUNG0.3-0.6mMdUTP2-5ul2050ul
lightcycler502
blastprimer
803PCREDTAPCRKRNA
CPCR10%75%10%70%
PCRdUTPUNG4
Q-PCRPCRPCRreal-time 190Taq DNA5PCR2real-time Q-PCR
PCRDNAPCRPCRPCRPCRreal-time Q-PCRPCRPCRPCRPCRreal-time Q-PCRthresholdPCR15baseline31510CtCtCtCtCt
DNASYBR green 1Real-time Q-PCRPCRSYBR green 1SYBR green 1DNAdsDNAdsDNAdsDNAmelting curve
PCRreal-time Q-PCRTaqManPCR53FRET5PCRTaq5-353DNAPCR
molecular beaconDNAPCRPCRsunrise primesscorpion primeshybridization probe3donor5acceptorPCRFRETmelting curve
1*nRNADNAbeta-actin,3-GAPDH
CTPCRCTCT=12
DNARNA260nmDNARNA
Q-PCRmRNADNASNPsreal-time Q-PCR
MRDReal-time Q-PCRAMLt(821) (q 22q22)AML-18MTG8AML-1real-time Q-PCRMRDCMLBCR-ABLALLTEL-AML1FLt(14;18)(q32;q21)bcl-2real-time Q-PCRReal-time Q-PCR
IL-1IL-23IFN-IFN-CSFTNFTGF-MCP-1MIP-1mRNAreal-timePCRRT-PCR
ATPATP-binding cassette
superfamilyMDR-1P-P-gpMRPLRPBCRPTopoGSH-S-GSTCPKCdeoxycytidine kinasebcl-2p53c-mycMDRreal-timePCRRT-PCRmRNA
Q-PCRPCRreal-time Q-PCRmRNARNARTPCRReal-time Q-PCR12real-time Q-PCRmultiplex3real-time Q-PCR
以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。如何判定荧光定量结果的真实性？
我是南农的一名小博，一直在用promega的荧光定量试剂做荧光定量实验。自认为对荧光定量实验有充分的了解，实验操作也很娴熟，但是最近的实验让我对自己产生了很大的怀疑。
如果你说的是荧光定量PCR的话：
根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。
在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。
定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。1.终点定量不准确
理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大【1】。
传统的定量方法，如溴乙锭染色或放射性核素掺入标记后的光密度扫描等，测定的都是PCR的终产物，而不是起始DNA拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。
对于绝大多数实验，比如甲肝的诊断、药物疗效的监测等，需要测定的都是PCR放大之前标本中的DNA原始拷贝数，经过PCR扩增以后的DNA拷贝数已经不能反映真实情况。在这种情况下，就不能采用终点定量，而要根据CT值确定DNA起始拷贝的数量。
2. CT值与起始模板拷贝数成线性关系
CT值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。重复实验中可以直观地看到，尽管平台期DNA拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。如果用不同浓度的DNA作PCR，可以看出DNA浓度越高，CT值越小。DNA浓度每增加1倍，CT值减小1个循环。CT值与模板DNA的起始拷贝数成反比.
其数学证明为：
既第n次PCR循环时的荧光信号强度(Rn)等于背景信号强度(RB) 加上每个分子的荧光强度(即单位荧光强度，RS) 与分子数目的乘积，， 是初始目标分子数， 是目标分子扩增效率, 是循环数， 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。当循环次数时, 两边取对数，得;整理得：由上可得，对于每一个特定的PCR反应来说，、、和都是常数，所以值与成反比，也就是说，值与起始模板拷贝数()的对数成反比。
3.数据分析的几个概念【2】：基线（Baseline）:扩增曲线中的水平部分；
调整原则：如果CT值&18，不需调整，使用自动分析结果；如果CT&18，修改终点，再分析一次；起点一般取3-6，终点一般取12-15.阈值线（Threshhold）：荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。
手动调节阈值线的原则：要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值.
4.数据分析三部曲①曲线分析（Amplification Plot）：
该步骤主要是对扩增曲线进行整体或单个的调整，主要包括：对数曲线与线性曲线的转换、模板或内标检测探针的选择、基线的调整、阈值的设定等几个方面。
主要有整体曲线的观察：分析是否存在污染（主要是试剂污染）；分析是否有因物理或其他因素造 成的异常曲线情况；阴性对照分析：观察是否存在污染；阳性对照分析：观察是否在质控范围内；标准品分析：观察标准品分布是否均匀，梯度是否正常，Ct值是否正常。②标准曲线分析（Standard Curve）该面板主要用于标准曲线参数的分析，通过对曲线各个参数的统计，可以判断实验定量的准确程度或者试剂的稳定程度。其主要包括三个参数：Slope（斜率）、Intercept（截距）和R2（线性相关性）。上图为外标定量方法原理图。模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。标准品与待测样本的扩增效率一致。
Log(浓度)与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中的起始模板量。Slope（斜率）：理论值为-3.32。可以从两个方面来分析，首先是标准曲线的10倍梯度关系，如果梯度正确，斜率数值会比较接近理论值；其次是试剂的扩增效率，当梯度正确的情况下，扩增效率越高越接近理论值。Intercept（截距）：不同公司的试剂截距有很大的不同，主要是指只有1个病毒扩增时，曲线出现的Ct值。R2（线性相关性）：指示本次实验标准品的线性关系。注：优质试剂的标准品每次实验的参数是比较稳定的，做质控分析后偏差应在±2SD范围内，Ct值变异系数应小于10%。③定值浓度或Ct值：通过上述步骤分析后，可以得到一个比较准确的定量结果或Ct值，如果在上述步骤中没有记录到异常曲线或者情况，则可以发出正确的报告，对于异常的曲线或者情况，则需单独分析，确定重复实验的必要性。---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------参考文献【1】《实时荧光定量PCR原理和实验》，陈云地，美国应用生物系统公司；【2】《实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告》，周向阳，广西临床检验中心；侵删。
如果你说的是Luciferase assay荧光会随时间衰减。(时间一致)荧光会随温度变化。(温度一致)荧光会被某些杂质影响。(冲洗细胞、取用试剂时规范操作)荧光底物冻融会显著降低荧光活性(冻存前分装)荧光有一定的误差范围，需要多次取重复。看了发的广告才意识到似乎说的是RT-PCR，请答主确认一下是哪个。RT-PCR主要的影响因素一个是RNA降解，可以通过跑电泳观察rRNA条带锐利度和比例看出来。第二是引物的扩增效率。如果扩增效率低于80%或高于100%，得出的结果往往是不可信的。这可以通过比较几对引物的扩增曲线、查阅数据库中细胞、组织的一般表达数据来得出粗略的衡量。还有就是做标准样调查斜率和线性也可以一定程度上表征。现在有些杂志会要求扩增数据，比如我发的一篇就附上了 (S1_Fig) Plos One本身不要求，但我原来是想投更高的杂志的。后来被一个审稿人针对不断打压才降到了Plos One。第三是内参。内参是经常被忽视的因素。实际上细胞中没有哪个RNA是真的永久不变的，18s rRNA和U6， GAPDH，ACTB，PSMB4等RNA表达都会变，而且在不同的细胞/组织，不同的处理条件下变化还不一样。在我做的两个课题中，虽然细胞系同样是MCF10A，p53模型里PSMB4最稳定，但是另外一个miRNA模型里PSMB4被调控幅度达到50%以上。必须对每一个模型分别进行内参的评估。评估可以互相比对、比对总RNA，以及比对deep-seq和microarray
realtime么？个人经验就是多跑几个内参，内参和目的基因的CT最好不要差的太多，差太多算deltaCT会有很大的误差
每一次都带内参基因一起跑cycle，重复孔一定要。然后样本要来自三次以上重复实验
为毛感觉这个问题应该在某生命科学类的技术论坛，而不是出现在我大知乎？
我说下我之前的一些经历，我一直在用诺唯赞生物（vazyme）的荧光定量试剂做荧光定量实验。vazyme的试剂为了防止反复冻融对酶活性造成影响，所以试剂比较粘稠，实验之前要反复颠倒混匀。这我才想起来，我当时是拿了试剂也没细看说明书，就直接抽吸了。针对我的实验问题，vazyme的张博士（也就是荧光定量试剂的研发总监）还亲自跟我联系，并给我提供了鉴定荧光定量结果的真实性的方法。根据张博士的建议，我进一步对vazyme和promega的试剂进行了对比试验。结果证明自己之前认为完美的数据，竟然都是假的，我居然一直被表面的CT值欺瞒了这么久。不过幸好发现的早，不然就难逃延期的厄运了。现在将自己的实验分享给一起奋战的战友们，不要再犯同样的错误。实验不易，且做且珍惜啊。我把自己的实验的具体结果奉上：　　图一 promega(上图)和vazyme(下图)试剂在相同cDNA和相同程序下产生的标准曲线图　　由图中可以看出promega和vazyme试剂标准曲线的相关性几乎一样，但是promega的扩增效率仅仅只有一个大于0.9，而vazyme试剂的扩增效率均在0.9以上。说明vazyme的试剂扩增效率更高。众所周知只有在扩增效率大于0.9的条件下，才可以粗略使用2-ΔΔct进行数据分析。　　图二 promega(上图)和vazyme(下图)试剂在相同cDNA和相同程序下产生的溶解曲线图　　从图中可以看出，promega(上图)比vazyme(下图)试剂得到的溶解曲线峰值高，但是vazyme试剂得到的溶解曲线在主峰之前没有小峰，说明vazyme试剂的扩增特异性更好。　　之前的我只是一味的通过ct值的大小和溶解曲线的峰值来判定试剂的好坏。现在终于明白标准曲线才是判定定量体系和定量结果有效性的王道。只有通过标准曲线才能判定所获得ct值是否有意义，计算的结果是否真实。
已有帐号？
无法登录？
社交帐号登录您好,我想问一下实时荧光定量pcr的数据分析!我有普通组,实验组1,实验组2,三个组,既要检测这三个组中每个组不同部位之间是否有差异,也要比较这三组中同一部位之间是否有差异,用2-△△ ct法算的话,应如何算?对于每组不同部位的比较的话,将其中一个处理为1进行比较吗?那对于三个组中的同一部位的比较的话,难道也要将其中一组处理为1吗?我不太清楚,看文献也没怎么看懂,希望大侠不吝赐教,
高83073箍涡
用2-△△ ct法算的话,应如何算?假设检测A基因,CT分别为（这里记住CT越大,表明相对含量越低）普通组/Test1：28实验组1/Test2：29实验组2/Test3：30这时候要设对照了,假设Test1为对照组（普通组）,当然是以普通组为对照那么,相对含量为：普通组/Test1：1实验组1/Test2：2^-(28-29)=1/2=0.5实验组2/Test3：2^-(28-30)=1/4=0.25A基因在实验组1和实验组2中的表达量,分别下降2倍和4倍!所以,就出来啦,结果对于每组不同部位的比较的话,将其中一个处理为1进行比较吗?如实验组1TestisBrainLiverMuscle可以把任何一个作为1,作为对照,但是要在figure 的legend中注明出来,说清楚就好了!那对于三个组中的同一部位的比较的话,难道也要将其中一组处理为1吗?是的,可以,如Brain普通组/Test1实验组1/Test2实验组2/Test3就以普通组/Test1,为对照组,设为1,其他为相对含量,也要在figure 的legend中注明出来说清楚!
可不可以不管组内还是组间，将其中一个处理为1，就拿我的这个实验而言，普通组是没有,加任何东西的，实验组1加了A物质，实验组2加了B物质，看心，肝，脾，肺，肾这5个组织的表达差异，我将普通组的心处理为1（即△△ ct=0），剩下的部位在算△△ ct时，都用各自算出的△ ct值减去普通组心的△ ct值，算出2-△△ ct，再用来统计分析看同一组中5个部位表达如何以及同一部位不同组表达如何？谢谢您
可以啊，结果就是这个样子的！！！You set the mRNA expression of gene X in heart as control!
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这个很简单。你把普通组的某个部位的相对量设为1。其他的，不管是组内的，还是组间的，都用△△ct的方法算出相对量。再进行比较。基本概念就是设一个点为基点，其他的都是相对值。不要每比一次都设一个1。再麻烦您一下，就拿我的这个实验而言，普通组是没有添加任何东西的，实验组1添加了A物质，实验组2添加了B物质，看其心，肝，脾，肺，肾这5个组织的表达差异，如您所说的话，我将普通组的心处理为1（即△△ ct=0...
就是这个意思
扫描下载二维码荧光定量PCR实验室所需仪器设备清单,_实验百科_中国百科网
荧光定量PCR实验室所需仪器设备清单,
    
荧光定量PCR实验室所需仪器设备清单 所有四区均需预备的仪器设备为： & 专用工作服和工作鞋 & 专用办公用品 & 一次性手套、一次性吸水纸 & 可移动紫外灯（近工作台面） & 微量加样器一套（覆盖1~1000ul） & 以上物品各一套。
一、试剂贮存和预备区 & 2~8℃和-15℃冰箱 & 混匀器（可加热） & 耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心） & 天平 & 高压锅 二、标本制备区
& 2~8℃冰箱和-20℃或-80℃冰箱 & 高速台式冷冻离心机 & 混匀器 & 水浴箱或PCR仪 & 耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心）&生物安全柜B2级&& 超净工作台 & 超声波水浴仪（处理大分子DNA用）
三、扩增反应混合物配制和扩增区 & 核酸扩增仪 & 耐高压处理的离心管和加样器吸头（带滤心） & 国产离心机
四、扩增产物分析区
& 酶标仪、洗板机、恒温箱（PCR—ELISA） & 加样器吸头（带滤心） & 电泳仪及电泳槽 & 杂交仪 & 核酸转移仪 & 国产离心机
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