本人是学物理的，因为交叉学科涉及到一点基因转染的问题。我是用自己制备的转染试剂，测试它的转染效率。请问有没有和我同样情况的做过这样的实验，我想用质粒pEGFP-C1转染海拉细胞，需要加目的基因吗
本人是学物理的，因为交叉学科涉及到一点基因转染的问题。我是用自己制备的转染试剂，测试它的转染效率。请问有没有和我同样情况的做过这样的实验，我想用质粒pEGFP-C1转染海拉细胞，需要加目的基因吗 10
补充：那基因转染效率怎么测呢 没有流式细胞仪用什么方法测？我在文献里看到可以用BCA检测出总蛋白的浓度从而将结果统一标准化成 RLU/mg protein (每毫克蛋白所对应的相对光子数)。这种方法可以吗 怎么测呢
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pEGFP-C1本身带EGFP报告基因，可以直接通过荧光测试转染效率。但最好还是有不同长度的质粒，转染不同的细胞进行综合比较。仅供参考。
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理工学科领域专家植物雌激素α-玉米赤霉醇对HUVEC组织因子基因表达的转录调控作用-α-玉米赤霉醇 植物雌激素 基因表达 HUVEC 调控作用 血管内皮细胞组织因子 estradiol mol／L 人脐静脉内皮细胞 activity 转录调控机制 报告基因质粒 基因重组技术 脂质体转染法 荧光素酶表达 抑制AngⅡ 正常对照组 细胞裂解液
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植物雌激素α-玉米赤霉醇对HUVEC组织因子基因表达的转录调控作用
首都医科大学病理生理学教研室，北京100054 中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所病理生理学系，北京100005
文章摘要: 目的 探讨植物雌激素α-玉米赤霉醇(ZAL)影响血管内皮细胞组织因子(TF)基因表达的转录调控机制，并与内源性动物类雌激素17β联雌二醇(17β联estradiol，E2)进行比较分析。方法 进行人脐静脉内皮细胞(HUVECs)原代培养，利用基因重组技术构建4个含人TF基因5′上游不同长度序列的荧光素酶报告基因质粒，用脂质体转染法分别转入以下6组细胞：①正常对照组；②10^-7mol／L，E2刺激组；③10^-7mol／L ZAL刺激组；④10^-6mol／L AngⅡ刺激组；⑤10～mol／L E2+10^-6mol／L AngⅡ刺激组；⑥10^-7mol／L ZAL+10^-6mol／L AngⅡ刺激组；测定细胞裂解液中荧光素酶比活性(relative luciferase activity，BLA)的变化。结果 转染pGL3-TF-171/+71的各组细胞BLA均较低，不同刺激组之间无显著差异；AngⅡ可使质粒pGL3-TF-593／+71，pGL3-TF-316／+71，pGL3-TF-236／+71荧光素酶表达大量增加，E2、ZAL均可不同程度地抑制AngⅡ的上述效应，2者间无显著差异。结论 含有1个NF-κB位点和2个AP-1位点的-236bp-171bp区域在E2或ZAL影响TF基因转录中有重要作用。
文章关键词:同一种细胞，不同质粒转染，那G418筛选浓度都一样吗_百度知道
同一种细胞，不同质粒转染，那G418筛选浓度都一样吗
跟文献上的细胞一样，但庹粕舵壬芊橇扼讴钒庭跟他的质粒不一样，文献上说G418筛选浓度为500mg/ml，那我可以直接用这个浓度筛选我转染以后的浓度吗？质粒的不同对同一细胞的G418筛选浓度影响大吗？
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出门在外也不愁苍天无眼，为何我的转染一直不成功请高手指点(转染,无眼,传代,质粒)
04:49:49&&&来源：&&&评论：&&
[苍天无眼，为何我的转染一直不成功请高手指点(转染,无眼,传代,质粒)] 我用含有p53基因的pCDNA3质粒转染入人胚肺成纤维细胞，步骤如下：1 第一天铺板：将细胞铺板于24孔板，使第2天细胞密度达到80％左右。培养液是含有10％胎牛血清的DMEM液。2 第二天转染：（1）将质粒1ug与50ulDMEM原液混合，invitrogen公司的lipofectamine2000脂质体2ug与50ulDMEM原液混合，在5min内将二者混合，室温孵化20min。
（2）用D 关键词:[转染 传代 无眼 质粒 胎牛血清 脂质体 质粒转染]…
我用含有p53基因的pCDNA3质粒转染入人胚肺成纤维细胞，步骤如下：1 第一天铺板：将细胞铺板于24孔板，使第2天细胞密度达到80％左右。培养液是含有10％胎牛血清的DMEM液。2 第二天转染：（1）将质粒1ug与50ulDMEM原液混合，invitrogen公司的lipofectamine2000脂质体2ug与50ulDMEM原液混合，在5min内将二者混合，室温孵化20min。
（2）用DMEM原液洗细胞3次。
（3）将500ulDMEM原液加入质粒和脂质体的混合液中，混匀后加入细胞中。3 第三天传代：将24孔板中1孔细胞传代于6孔板的1个孔中。相当于1：5传代。4 第四天加G418：将16ul的50mg/ml的G418加入2ml含有10％胎牛血清的DMEM
中，混匀，加入细胞中。G418终浓度为400ug/ml.5 观察细胞，第8天换新的G418筛选。令人痛心的是我的细胞在第9天开始脱落死亡，12天左右基本就没有细胞了。我都做了接近2个月了，还是不成功，请高手多多指点。我用的是promega的转染级质粒提取盒。
回复转染的效率怎么样？回复我用含有p53基因的pCDNA3质粒转染入人胚肺成纤维细胞，步骤如下：1 第一天铺板：将细胞铺板于24孔板，使第2天细胞密度达到80％左右。培养液是含有10％胎牛血清的DMEM液。2 第二天转染：（1）将质粒1ug与50ulDMEM原液混合，invitrogen公司的lipofectamine2000脂质体2ug与50ulDMEM原液混合，在5min内将二者混合，室温孵化20min。
（2）用DMEM原液洗细胞3次。
（3）将500ulDMEM原液加入质粒和脂质体的混合液中，混匀后加入细胞中。3 第三天传代：将24孔板中1孔细胞传代于6孔板的1个孔中。相当于1：5传代。4 第四天加G418：将16ul的50mg/ml的G418加入2ml含有10％胎牛血清的DMEM
中，混匀，加入细胞中。G418终浓度为400ug/ml.5 观察细胞，第8天换新的G418筛选。令人痛心的是我的细胞在第9天开始脱落死亡，12天左右基本就没有细胞了。我都做了接近2个月了，还是不成功，请高手多多指点。我用的是promega的转染级质粒提取盒。我试回答你的问题吧。我想你应该设计合适的对照。建议用带EGFP基因（或GFP）的pC3质粒为对照。用你上述的转染方法，只是加G418的时间不必等到第四天。转染后48小时就可以了。转染了pC3-EGFP质粒的细胞在24小时后应该观察到绿色荧光，同时可以判断一下转导效率；同步转染和加压筛选，观察转染了pCDNA3-EGFP质粒的细胞是否会全部死掉；如果同样也死掉了，说明质粒可能有问题，或转染方法有问题（看不到绿色荧光）；如果转染了pCDNA3-EGFP质粒的细胞加压后不死，并形成了抗性克隆，至少有些细胞克隆还仍有绿色荧光，而转染了pCDNA3-P53质粒的细胞都死掉了，则说明不是转染或质粒的问题，而是P53基因的表达使细胞发生了凋亡，这正是P53基因的功能。所以你不必试图获得表达P53基因的肺成纤维细胞，即使获得了抗性克隆，也可能恰恰不是你要的细胞，因为它们已经都凋亡了。以上意见供你参考。回复to
dongxy ：多谢大哥！（1）我第2天转染，第4天加g418，也就是转染后48h加压筛选吧。（2）我试验目的就是获得表达p53的细胞。g418加压筛选只是获得抗性细胞，不会使细胞凋亡(Apoptosis)吧。to
lwk2003 ：我的转染效率接近于0，烦人呀。我再用阳性对照做一下吧。回复我个人认为你的实验设计上有一些问题。关键是P53在肿瘤细胞的表达和想获得表达P53的阳性克隆之间的矛盾。正如dongxy 所说，P53在细胞的凋亡中发挥重要作用，所以可能在你还没有获得G418阳性克隆之前，细胞就已经凋亡了。我现在做的课题也涉及到这种问题，因为在转染后24小时细胞就开始有凋亡信号了，所以获得G418阳性克隆就几乎不可能了。所以建议你在实验的每一步中确定后在进行下一步的实验，这样容易找到问题出在那里。good luck！回复to lwk2003:多谢！我查阅了很多文献，很多人也做过p53基因的细胞转染，应该没有问题。照你的说法，我该怎样做哪？thanks！回复建议转染过程中换培养基（如1640），lipofectamine2000转染用DMEM效率好像很底回复to lwk2003:多谢！我查阅了很多文献，很多人也做过p53基因的细胞转染，应该没有问题。照你的说法，我该怎样做哪？thanks！做P53基因转染的人是不少。但不是都想获得稳定表达的细胞株。用G418选择培养出的抗性细胞克隆并不一定表达P53基因；也就是说，PCDNA3质粒中筛选基因的表达和目的基因的表达不完全同步。P53基因的确会导致细胞凋亡(Apoptosis)，因此很多人做瞬时转染实验。关键看你的实验目的。回复to sonata :应该不是DMEM的问题，invitrogen说可以用的，影响不大。to dongxy ：我要检测p53突变后其下游基因及蛋白的变化，因此一定要做稳定转染，瞬时转染不合适的。多谢。回复我觉得12天细胞差不多死光是正常现象，可能是你的转染效率比较低。细胞死的差不多了不要放弃，继续培养两星期，最终应该能得到阳性的克隆。但是用lipofectamine2000转染得到的G418抗性克隆不一定都表达目的基因。电转要好些。回复to rockmountain :多谢！我还要做脂质体，实验室没有电转条件。回复TO qyt：细胞的生长状态对转染的效率影响很大，首先确定细胞的生长状态好再进行转染。另外你也可以找另外一种细胞同时进行比较，我用lipofectamine2000转染Hep-2细胞效率就比较高，而转染另外的细胞就没有Hep-2细胞高。因此细胞不同转染效率也会不同，对我来说简直是大相径庭。你的实验步骤没有什么问题，DNA和脂质体的比例也比较合适。我建议还是确定转染后再进行下一步。
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08:59:42&&&来源：&&&评论：&&
[关于稳定转染的问题(转染,对照组,传代,肿瘤细胞)] 我用lipofactamine2000转染肿瘤细胞,说明书上说转染后24小时按1:6或1:8传代,48或72小时后加G418筛选.我的细胞今天是转染24小时,我本来想给它传代的,但一看细胞大部分死了,活得状态也有变化,我怕一操作更糟糕,就没动,但对照组的细胞已经长得很满了.想请教各位做过稳转的战友,我该不该传,以什么比例传,能直接在原来的孔(6孔板)中筛选吗?顺便说一下,我转的是抑癌基因,空质粒对 关键词:[转染 传代 对照组 肿瘤细胞 死亡 实验组 抑癌基因]…
我用lipofactamine2000转染肿瘤细胞,说明书上说转染后24小时按1:6或1:8传代,48或72小时后加G418筛选.我的细胞今天是转染24小时,我本来想给它传代的,但一看细胞大部分死了,活得状态也有变化,我怕一操作更糟糕,就没动,但对照组的细胞已经长得很满了.想请教各位做过稳转的朋友,我该不该传,以什么比例传,能直接在原来的孔(6孔板)中筛选吗?顺便说一下,我转的是抑癌基因,空质粒对照组也有死亡,但不如实验组严重.
非常期待各位的答复并致以最诚挚的谢意!谢谢大家!
回复我觉得你的转染条件好像没有选好，转染后细胞状态这么差，到底是质粒内毒素导致的细胞死亡，还是转染用量太大导致的细胞毒性，你应该重新摸一下转染条件，要是按照你上面的情况，再传代后细胞肯定存活得很少，那样就不容易筛选了。回复
抑癌基因转染肿瘤细胞，细胞当然不能生长好啦抑癌基因的功能不就是抑止肿瘤细胞的生长，最终导致其凋亡或死亡么回复1.优化一下你的实验条件，提高转然效率，减少对细胞的毒性。2.质粒和lipofectamine对细胞都会有伤害，所以死的就多了。3.脱离的时间越长，细胞死亡数越多4.96孔板最适合做转然5.细胞死的不够数会对结果有影响回复我用lipofactamine2000转染肿瘤细胞,说明书上说转染后24小时按1:6或1:8传代,48或72小时后加G418筛选.我的细胞今天是转染24小时,我本来想给它传代的,但一看细胞大部分死了,活得状态也有变化,我怕一操作更糟糕,就没动,但对照组的细胞已经长得很满了.想请教各位做过稳转的朋友,我该不该传,以什么比例传,能直接在原来的孔(6孔板)中筛选吗?顺便说一下,我转的是抑癌基因,空质粒对照组也有死亡,但不如实验组严重.
非常期待各位的答复并致以最诚挚的谢意!谢谢大家!请问楼主近来进展如何？稳定转染克隆筛选到了吗？我也要转抑癌基因去。希望能和你多交流！谢谢！
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