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淘豆网网友近日为您收集整理了关于乙型肝炎中错配修复基因突变研究的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：乙型肝炎中错配修复基因突变研究 青岛大学硕士学位论文乙型肝炎中错配修复基因突变的研姓名:王丽申请学位级别:硕士专业:遗传学指导教师:王培林;王修海中文摘要乙型肝炎患者错配修复基因突变的研究青岛大学医学院2001级遗传学专业硕士学位研究生王丽硕士生导师王培林教授摘要居的: 检测乙型肝炎患者外周血中错配修复基因hMSH2、hMLHI突变的情况,探讨错配修复基因突变在乙型肝炎发生、发展过程中的作用,以进一步研究乙型肝炎及相关性肝病的分子遗传学发病机制。方法: 应用聚合酶链反应(polymerasechain reaction,PCR)、PCR结合单链构象多态性(PCR—SSCP)技术、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、硝酸银染色方法,对40例乙型肝炎患者和17例肝硬化患者及20例正常人外周血的hMSH2、hMLHl基因的第5和第12外显子突变情况进行检测分析。结果: ①40例乙型肝炎患者SSCP检测在1例患者中发现有异常条带,突变率为2.5%,20例正常人中SSCP检测未发现有异常条带,二者的突变率的差异没有显著性意义(P&0.05):②17例肝硬化患者中SSCP检测在3例患者(来源：淘豆网[/p-5059004.html])中发现有异常条带,突变率为17.6%,与正常对照组突变率相比差别有显著性意义(P&O.05),肝硬化患者错配修复基因突变率明显高于正常对照者;③乙型肝炎患者hMSH2、h^{LHl基因突变率与肝硬化患者相比,差异有显著性意义(P&O.05),肝硬化患者hMSH2、hM[.Hl基因突变率高于乙型肝炎患者。结论: ①乙型肝炎忠者外周血中hMSH2、hMl,H1基因的突变率与正常人相比没有显著性意义;②与之相对照的肝硬化患者外周血中hMSH2、hMLHl基因突变率和正常人相比有显著性意义,提示错配修复基凶突变在肝硬化发病机制中起一定的作用:⑨肝硬化患者外周血中hMSH2、h~ILHl基因突变率明显高于乙型肝炎患者,提示hMSH2、hMLHl基因突变在乙型肝炎进一步进展为肝硬化过程中起一定的作用。关键词乙型肝炎: 错配修复基因; 单链构象多态性(SSCP): 微卫星不稳定性: 突变英文摘要The study of the mutation of mismatch repair genehM(来源：淘豆网[/p-5059004.html])SH2 and hMLHl in hepatitis B patientsAbstractObjective:To detect the mutation frequency of exon5 and exon 1 2 of hMSH2 andhMLHl gene,investigate the relationship between the mutation of hMSH2、hMLHlgene and the progress ofhepatitis B,explore the pathogenesis ofhuman hepatitis B。Methods:GenomeDNAof40 patientswithhepatitisB,17 patientswith cirrhosisand 20 normal samples WaS subtracted,exon5 and exonl2 of hMSH2 and hMLHl wasamplified with PCR。The result(来源：淘豆网[/p-5059004.html]) WaS analyzed wiⅡl SSCP。Results: QMutations were identified in 1/40 hepatitis patients while there are nopatients in normal people.There were no significant difference in the mutation rate ofhMSH2 and hMLHl gene(P&0.05);②Mutations were identified in 3/1 4 cirrhosispatients while there are no patients in normal people.The mutation rate of hMSH2 andhMLHl gene in the cirrhosis patients was significantly higher than that in normal people.(P&0.05);(来源：淘豆网[/p-5059004.html])⑨The mutation rate ofhMSH2 and hMLHI gene in the cirrhosis patients wassignificantly higher than that in hepatitis patients(P&0.05).Conclusions: ①There were nosignificant difference in the mutation rate ofhMSH2 and hMLHl gene in hepatitis patien④The mutation rateof hMSH2 and hMLHl gene in the cirrhosis patients was significantly higher than that innormal people,which indicate that the mutation of hMSH2 and hMLHl gene is close(来源：淘豆网[/p-5059004.html])lyassociated with the pathogene③The mutation rate of hMSH2 andhMLHl gene in the cirrhosis patients WaS significantly higher than that in hepatitispatients,which indicate that the mutation of hMSH2 and hMLHl gene does some use inthe development from hepatitis B to cirrhosis.Postgreduate Wang li(ics)Directed by Wang peilinWang xiuhaiKey words:Hepatitis B;M Single strand conformationpolymorphism(SSCP); Microsat(来源：淘豆网[/p-5059004.html]) Mutation刖若乙型肝炎患者错配修复基因突变的研究刖吾乙型肝炎是一种严重危害人类健康常见病和多发病,也是一种难治性疾病,是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致。近年来,关于乙型肝炎患者遗传物质损伤的遗传学研究, 国内、外已有不少的报道。 Rogler等发现,HBV DNA整合伴有整合位点处细胞DNA顺序缺失,整合的HBV DNA还可作为启动点引起染色体易位…。Kurvink等首先报道了肝炎患者淋巴细胞的姊妹染色单体交换(sister chromatidexechange,SCE)频率显著高于正常人【2J。国内、外学者对乙型肝炎患者的外周血淋巴细胞的SCE率也进行了探讨分析。刘权章和本实验室分别检测了乙型肝炎患者中的SCE频率.结果证明乙型肝炎患者的SCE率较正常人显著增高。SCE技术是研究DNA损伤与修复的敏感指标,即可用于定性分析,又可提供定量分析的指标。上述研究表明,乙肝患者SCE频率升高,与HBV感染有关;HBV感染损伤了患者的DNA;胡远贵(19(来源：淘豆网[/p-5059004.html])92)研究丝裂霉素C诱发乙肝患者SCE频率,体外诱导乙肝患者SCE频率升高;这说明SCE频率越高,其DNA修复力与代偿力越低,乙肝患者DNA损伤修复率是正常人的~半。人体内的错配修复是细胞复制后一种修复机制,起着维持DNA复制保真度、控制基因突变的作用。最近在遗传性非息肉性大肠癌()中分离到了DNA错配修复基因家族,目前发现参与错配修复功能的基因有6个:hMSH2、hMSH6、hMSH3、hM[。H1、hPMSl和hPbIS2。陔系统中任一基因突变,都会导致细胞错配修复功能缺陷,结果产生遗传不稳定,表现为复制错误或微卫星不稳定,因而易发生癌变。现己发现错配修复基因在多种胃肠肿瘤中有突变。Wani等发现hMSH2。hMLHl缺陷在中低分化肝细胞癌中经常出现,说明错配修复基因突变在肝细胞癌发生中可能起一定的作用‘”。以往的研究已证明,乙型肝炎与肝细胞癌的发生密切相关。因此,探讨错配修复基因突变与乙型肝炎的相关性,一方面有助于揭示乙型肝炎发生的分子机制,另一方面也将有助于进一步阐明HBV相关的肝细胞(来源：淘豆网[/p-5059004.html])癌的发生发展机制。目前己在多种肿瘤中发现有错配修复基因的突变,但关于乙型肝炎的错配修复基因突变的研究,在国内外还未见有相关报道。本课题首先选择40例乙型肝炎患者作为实验组,17例肝硬化患者及20例『E常人分别作为对照组,提取受试者的外周血基因组DNA,PCR扩增突变率高的h/VILHl和hMSH2基因的共3个外显子。应用PCR—SSCP技术检测每一外显子是否有异常带型,并分析突变在乙肝、肝硬化患者及『F常人中分布的情况。用这种方法研究乙型肝炎患者错配修复基因突变的情况,前言可以为进一步阐明乙型肝炎的发生机制提供分子遗传学的证据。材料与方法材料和方法1.研究对象:57份患者外周血取自2003年3月一2003年12月期问青岛市传染病院、青岛市市立医院及青岛大学医学院生物教研室。所取标本均经临床渗断证实为慢性乙型肝炎和慢性乙型肝炎伴肝硬化。20份正常人外周血取自松山医院。外周血取出后立即提取基因组DNA。2.试剂与材料2.1试剂及来源2.1.1 PCR试剂购自上海生工生物工程有限公司。Taq DNA(来源：淘豆网[/p-5059004.html]) polymersedNTP10×PCR BufferMgCI zAgarose I2.1.2 PCR引物见表1,由上海生工生物工程公司合成。表l PCR引物材料与方法续表PCR引物2.1.3 DNA分子标记物购自上海生工生物工程公司P”。190““/“891 DNA Marker分子量34bp~501bp2.1.4其它试剂,如固定、染色、显色等所需试剂,购自北京天象人生物工程公司。2.2器材及其来源10pl、20蛆、200“1微量加样器DNA thermal CyclerEPC3000三恒电泳仪DBY一Ⅲ28型电泳仪YXJ一1低速离心机TGL一16C高速台式离心机SHZ—B水浴恒温振荡器FR一200紫外与可见分析装置HollandPERKIN ELMER北京阜外定惠寺六一仪器厂北京阜外定惠寺六一仪器厂深圳沙头角国华仪器厂上海安亭科学仪器厂上海跃进医疗器械厂上海复日科技有限公司3.方法3.1外周血中总DNA的提取:①取新鲜ACD抗凝血2ml加入1.5倍体积的双蒸水置于lOml试管中,(来源：淘豆网[/p-5059004.html])剧烈摇动均匀,置冰水浴中15min.期『自J不断剧烈摇动至溶液透明,3000rpm/min离心lOmin,去上清血红蛋白液。②用生理盐水洗涤自细胞沉淀,3000rpm/min离心lOmin,弃上清液,再重复该步骤2次。③将白细胞沉淀悬浮于2ml的sE液(蛋白酶K缓冲液)中,加入IO%SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K(10mg/m1)至终浓度分别为1%和100“g/m】,置37。|C。陋材料与方法温培养箱中过夜,期间颠倒混匀数次。④在白细胞悬浮液中加入1/3体积的饱和NaCl溶液,剧烈摇动混匀,3000rpm/min离心lOmin以去除蛋白及SDS沉淀。⑤将上清液吸入另一个试管中,加等体积的氯仿颠倒混匀5mi n,3000rpm/mj n离心5min,取上清液。⑥加入2。5倍体积预冷的无水乙醇,轻轻摇动试管,可见DNA形成絮状沉淀漂浮在乙醇溶液中。⑦将DNA团块用tip头挑出,放于lml EP管中用75%乙醇洗涤2次,将沉淀置于超净工作台中风干后,加入50N TE液溶解。⑧在UV一250紫外分光光度仪上测得UV。。/UV。比值大于1.8,说明DNA质量良好,将EP管放置一20℃备用。3.2 PcR扩增及产鞭分析3.2.1 患者外周血DNA的hMSH2和hMLHl基因的三个外显予的扩增以从乙型肝炎患者和肝硬化患者及正常对照者外周血中提取的DNA为模板,以人工合成的寡核苷酸为引物,在美国PE公司生产的DNA Thermal Cycler(7l'C1)上进行PCR扩增。259l反应体系包含:10Xbuffer 2.5蛆MgCl z(25mM) 1.5蛆引物up 50 nM弓I物down 50 nM4X dNTP(10Mm)0.59lTaqDNA聚合酶0.29l样本DNA 3此去离子水 15.3 m整个反应体系置于lml EP管中,用手指轻弹EP管,使反应物混合均匀,加209l石蜡油覆盖液面,防止PcR反应时液体蒸发。PCR反应程序:94℃ 5min预变性94℃ 15sec, 51~55℃lmill,72℃40sec,35个循环72℃ 3min 延伸引物改变时,根据引物及扩增产物的长度调整反应条件。为防止PcR试验中交叉污染,排除假阳性和假阴性的结果,PeR试剂的配制材料与方法和分装、加样、PCR热循环及产物检测分别在隔开的场所内进行:反应管、加样器、吸头等均严格分开使用;每次扩增均对反应场所及所使用的加样器等进行紫外消毒。每次扩增均设阳性及阴性对照。阳性结果均重复实验。3.2.2 PCR产物的检测一-6%t}变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染操作①玻璃板及间隔片的清洗洗涤剂清洗玻璃板和间隔片,自来水反复冲洗,双蒸水冲洗3次,烤干,9鼹乙醇擦拭,自然干燥。取5眦PCR产物与等体积的加样缓冲液混匀后加入l_5mm厚、12cm长的6%非变性聚丙烯酰胺凝胶中(交联度为丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺=29:l:离子强度为1 xTBE),200V,25mh室温下电泳1.5h。②制备6%非变性聚丙烯酰胺凝胶15ml取下凝胶,将其置于固定液中(10%乙醇、0.5%冰醋酸)固定lOmin后,倾去固定液,用双蒸水清沈凝胶2次。③将凝胶置于染色液中(0.2%硝酸银)摇动染色lOmin,倾去染色液,用双蒸水快速、彻底冲洗凝胶2次。④将凝胶置于显色液中(0.75%NaOH、0.2%甲醛)进行显色至肉跟观察条带显示清晰为止。倾去显色液,用双蒸水冲洗凝胶2次。⑤将显色好的凝胶转移到保鲜膜上封闭保存,摄影纪录或用扫描仪扫拙后储存于电脑中,以便分析。3.2.3 PCR—SSCP技术检测基因突变取hMSH2和hMLHl基因的PCR扩增产物39l加入等体积变性示踪剂(95%甲酰胺、lOmM EDTA、0.25%溪酚蓝、0.25%--甲苯青)混匀离心,95℃热变性lOmin后迅速置于一20℃骤冷lOmin。6%非变性聚丙烯酰胺凝胶中(交联度为丙烯酰胺:甲叉双丙烯酰胺=29:1:离子强度为1×TBE)预电泳0.5h后,迅速加入6pl变性产物,200V,25mA室温下电泳3h,电泳后银染操作如前。为提高SSCP检出率,减少假阴性结果,采用不同的电压(150V、200V、250V)在不同的温度(室温、4℃)下进行电泳,相同样本的检测结果一致。4.统计学分析采用四格表精确概率法;×2检验,由SPSS统计软件处理。.8-结果结果1.错配修复基因hMSH2的第5和第12外显子和hMLHI的第12外显子的PCR扩增结果:实验中,以从40例乙型肝炎患者和17例肝硬化伴乙型肝炎患者及20例Jr常对照者外周血中提取的DNA为模板,经PCR扩增,聚丙烯酰胺凝胶电泳结果:77例标本均扩增出外显子的特异性片段,PCR产物的长度分别为223bp、283bp和418bp。其检测结果见图1,2,3,4,5,6:489bp404bp331bp242bp190bp147bp110bp67bp图1 部分标本错配修复基因hMSH2的exon5的PCR扩增产物电泳结果M:pUCl9 DNA/MSPl(Hpall)Marker,34~50IA,B,C,D:乙型肝炎患者l2,3,4的外周血;E,F:肝硬化患者l,2的外周血Figl PCR products of mismatch repair gene hMSH2 with exon5M:pUCl9 DNA/MSPl(Hpa 1I)Marker.34~501A,B,C,D:patient l,2,34 with hepatitis B:E,F:patient l,2 with cirrhosiS播放器加载中，请稍候...
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