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上海生工合成的的引物质量如何？！
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秀基因 个 秀蛋白 个
为什么上海生工合成的引物在网络上的负面那么多。
是不是竟争对手搞的，还是真有其事？！
我现在就用的是上海生工的引物，没有P出结果来，我倾向于怀疑我的引物本身设计的问题，所以我一直都在摸索条件。
不知道大家有没有用到上海生工合成的引物的呢。大家交流一下。
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秀基因 个 秀蛋白 个
一般设计的引物测序是没有问题的，你要先看看PCR的条件如何，最好退火温度在60度左右，引物不要太长20bp左右就可以，再就是与样品特异性好，样品本身没有问题就行了
秀基因 +10
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秀基因 个 秀蛋白 个
呵呵，谢谢。我只所以会突然对生工有点怀疑，是因为我最近委托他们合成的一管阳性对照引物中加入水后，里边有一块不溶解很大块的片状物，用这管引物来PCR，结果倒是正常。那管碎片到目前为止都有1个月了，一直没有溶解。
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秀基因 个 秀蛋白 个
我刚从上海生工合成的引物效果真的不怎么好，
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秀基因 个 秀蛋白 个
我们一直都是在生工合成的引物&&很好的啊！
如果有不溶的话 你可以联系生工，他们可以给你们重新合成的！
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秀基因 个 秀蛋白 个
其实，引物合成目前都是采取毛细血管化学合成，通常生工的引物都会给出几种纯化方式以及合成后会采取电泳、质谱双重检测以满足客户的不同要求的，一般其他合成公司好像都会省略检测步骤。所以在合成引物之前最好能自己分析好设计引物的特异性是否合适，再去选择你所需要的合成方式！这样一般出现问题的几率非常小，如果出问题那也是中500万的几率！同时你可以溶解引物后跑个电泳检测下纯度就行了，一目了然哦！生工的引物其实还是值得大家信赖的，我就一直在生工合成的！
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秀基因 个 秀蛋白 个
我们一直都在用上海生工的，还是可以的~
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秀基因 个 秀蛋白 个
有时候实验结果不理想，主要是引物的设计问题，引物质量的问题概率很低的
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秀基因 个 秀蛋白 个
还是可以的，
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秀基因 个 秀蛋白 个
为了降低成本，不惜采用劣质原料和第学历员工，质量差，经常有错误的碱基出现，其他部门，如技术部，蛋白部，抗体部的产品质量更差DNA合成石所需引物的合成酶是什么_生物吧_百度贴吧
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DNA合成石所需引物的合成酶是什么收藏
我做了好几个题，答案都是Rnase，怎么回事，难道说是因为它从大分子RNA上水解下一部分吗
叫做引发酶primase，是一种特殊的RNA聚合酶……你在哪儿看的RNase啊，出处是什么？
因为引物是一段RNA.高中阶段知道这个足矣，大学阶段知道这个还是足矣
求DNA分解石和DNA强化石
复制的引发(Priming)阶段包括DNA复制起点双链解开，通过转录激活步骤合成RNA分子，RNA引物的合成，DNA聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物RNA的3-OH末端复制引发的关键步骤就是前导链DNA的合成，一旦前导链DNA的聚合作用开始，滞后链上的DNA合成也随着开始，在所有前导链开始聚合之前有一必需的步骤就是由RNA聚合酶(不是引物酶)沿滞后链模板转录一短的RNA分子。在有些DNA复制中，(如质粒ColE)，该RNA分子经过加式成为DNA复制的引物。但是，在大部分DNA复制中，该RNA分子没有引物作用。它的作用似乎只是分开两条DNA链，暴露出某些特定序列以便引发体与之结合，在前导链模板DNA上开始合成RNA引物，这个过程称为转录激活(transcriptional activation)，在前导链的复制引发过程中还需要其他一些蛋白质，如大肠杆菌的dnaA蛋白。这两种蛋白质可以和复制起点处DNA上高度保守的4个9bp长的序列结合，其具体功能尚不清楚。可能是这些蛋白质与DNA复制起点结合后能促进DNA聚合酶Ⅲ复合体的七种蛋白质在复制起点处装配成有功能的全酶。DNA复制开始时，DNA螺旋酶首先在复制起点处将双链DNA解开，通过转录激活合成的RNA分子也起分离两条DNA链的作用，然后单链DNA结合蛋白质结合在被解开的链上。由复制因子X(n蛋白)，复制因子Y(n蛋白)，n"蛋白，i蛋白，dnaB蛋白和dnaC
蛋白等6种蛋白质组成的引发前体(preprimosome)，在单链DNA结合蛋白的作用下与单链DNA结合生成中间物，这是一种前引发过程。引发前体进一步与引物酶(primase)组装成引发体(primosome)。引发体可以在单链DNA上移动，在dnaB亚基的作用下识别DNA复制起点位置。首先在前导链上由引物酶催化合成一段RNA引物，然后，引发体在滞后链上沿5→3方向不停的移动(这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动，见后)，在一定距离上反复合成RNA引物供DNA聚合酶Ⅲ合成冈崎片段使用，引发体中许多蛋白因子的功能尚不清楚。但是，这些成份必须协同工作才能使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成RNA引物。由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合成引物的方向相反，所以在滞后链上所合成的RNA引物非常短，一般只有3-5个核苷酸长。而且，在同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在DNA滞后链模板上比较特定的位置(序列)上才能合成RNA引物。 　　为什么需要有RNA引物来引发DNA复制呢?这可能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。DNA复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错，因此，用RNA引物即使出现差错最后也要被DNA聚合酶Ⅰ切除，提高了DNA复制的准确性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物3-OH端而进入DNA链的延伸阶段。
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【交流】大家有没有自己合成Clontech 的SMART引物做过RACE的？
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这个帖子发布于3年零311天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家有没有自己合成Clontech 的SMART引物做过RACE的？
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你好，不知道你做出来了没有，希望能交流一下啊，谢谢啊！ QQ:
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我也想知道这个问题，最近一直在寻思，说明书上介绍the smart oligo is a modified oligo，不知是如何修饰的？要是自己合成的能不能用？
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求高人指点
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5'race 现在的通用方法是根据CLONTECH SMART RACE kit 改进而来的方法那个试剂盒很坑爹的，价格高的离谱。其实在实验过程中完全没有必要买试剂盒，下面我来告诉你怎么玩。原理：5'race的关键目的就是要克隆出已知片段上游的未知片段。方法就是在反转录的过程中人为的在5'端加上接头，然后利用接头上面的特异序列作为引物和你已知序列上面的一段引物扩增cDNA片段，就能得到5'未知序列片段。方法：在反转录的过程中加入5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3'这个接头引物。在反转录之后这段序列就会位于整个mRNA反转录出来的cDNA的最前端。为什么？？MMLV反转录酶有一种特性就是在反转录到序列末端的时候加上三个C来终止这个反转录过程，利用这添加上去的CCC和上面给你的那个接头引物的GGG碱基配对，MMLV就会以上面那个引物为模版将反转录出来的第一链继续延伸出接头引物的互补链，从而形成一个带接头的cDNA 5'-末端。这个就是RACE的核心原理。具体不明白的看看这篇说明书就好，GOOGLE一搜，结果满天飞的，我就不给你传文件了。SMART? RACE cDNA Amplification Kit User Manual你肯定有一下问题1.上面给你的那个接头引物能不能换掉。上面那个引物看起来好像很普通，其实里面大有玄机，如果你用DNAMAN软件预测一下引物的二级结构就可以发现，这个引物自身能形成一个类似老虎钳子的形状，而且仅仅只有GGG三个核苷酸暴露在外面用来和MMLV添加出来CCC配对。所以这个引物的设计是非常巧妙的。不建议你更换，而且你换掉以后自己要在你实验动物的基因组中验证是否存在相同或互补序列，这也是另一个问题。2.是不是用普通的方法合成该接头引物即可。答曰，可以。clontech公司提供的试剂盒里面的这段引物其实并非全是单链DNA，用于配对的那关键的GGG用的是RNA单链，为什么？原因是DNA-RNA的结合能力强于DNA-DNA。明白了把，所以那个用来坑中国人钱的试剂盒提供的引物是很容易降解的，一旦那三个G降解掉了，好了，这8K+盒子就报销了。值得庆幸的是用全DNA引物是完全能满足RACE需求的。所以，随便找个单位合成一下这引物就可以了。3.是不是所有的反转录酶都可以答曰，不是。RACE的核心技术就是MMLV延伸的CCC。别的酶不具有这种特性。4.其他方法其他方法有很多，例如传统的方法，那种利用5'帽子结构筛选完整mRNA然后去帽子加接头的方法肯定是最好的。因为严格的说只有这种方法做出来的才真正称得上是准确的RACE。但是，同学，这方法麻烦，而且，价格不菲。这个贵是很有道理的，里面那么多种酶呀…………5.实验要求RNA的质量一定要好，越少的末端降解你得到的5'RACE结果就是越准确的。6.中间已知序列特异性引物的设计，这个很容易，用primer 5 在已知序列里面随便挑一个分数高点的一般就行，实在不放心的话可以和接头引物配下对，看看有无引物二聚体，根据经验，一般没有。
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daipeng217 5'race 现在的通用方法是根据CLONTECH SMART RACE kit 改进而来的方法那个试剂盒很坑爹的，价格高的离谱。其实在实验过程中完全没有必要买试剂盒，下面我来告诉你怎么玩。原理：5'race的关键目的就是要克隆出已知片段上游的未知片段。方法就是在反转录的过程中人为的在5'端加上接头，然后利用接头上面的特异序列作为引物和你已知序列上面的一段引物扩增cDNA片段，就能得到5'未知序列片段。方法：在反转录的过程中加入5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3'这个接头引物。在反转录之后这段序列就会位于整个mRNA反转录出来的cDNA的最前端。为什么？？MMLV反转录酶有一种特性就是在反转录到序列末端的时候加上三个C来终止这个反转录过程，利用这添加上去的CCC和上面给你的那个接头引物的GGG碱基配对，MMLV就会以上面那个引物为模版将反转录出来的第一链继续延伸出接头引物的互补链，从而形成一个带接头的cDNA 5'-末端。这个就是RACE的核心原理。具体不明白的看看这篇说明书就好，GOOGLE一搜，结果满天飞的，我就不给你传文件了。SMART? RACE cDNA Amplification Kit User Manual你肯定有一下问题1.上面给你的那个接头引物能不能换掉。上面那个引物看起来好像很普通，其实里面大有玄机，如果你用DNAMAN软件预测一下引物的二级结构就可以发现，这个引物自身能形成一个类似老虎钳子的形状，而且仅仅只有GGG三个核苷酸暴露在外面用来和MMLV添加出来CCC配对。所以这个引物的设计是非常巧妙的。不建议你更换，而且你换掉以后自己要在你实验动物的基因组中验证是否存在相同或互补序列，这也是另一个问题。2.是不是用普通的方法合成该接头引物即可。答曰，可以。clontech公司提供的试剂盒里面的这段引物其实并非全是单链DNA，用于配对的那关键的GGG用的是RNA单链，为什么？原因是DNA-RNA的结合能力强于DNA-DNA。明白了把，所以那个用来坑中国人钱的试剂盒提供的引物是很容易降解的，一旦那三个G降解掉了，好了，这8K+盒子就报销了。值得庆幸的是用全DNA引物是完全能满足RACE需求的。所以，随便找个单位合成一下这引物就可以了。3.是不是所有的反转录酶都可以答曰，不是。RACE的核心技术就是MMLV延伸的CCC。别的酶不具有这种特性。4.其他方法其他方法有很多，例如传统的方法，那种利用5'帽子结构筛选完整mRNA然后去帽子加接头的方法肯定是最好的。因为严格的说只有这种方法做出来的才真正称得上是准确的RACE。但是，同学，这方法麻烦，而且，价格不菲。这个贵是很有道理的，里面那么多种酶呀…………5.实验要求RNA的质量一定要好，越少的末端降解你得到的5'RACE结果就是越准确的。6.中间已知序列特异性引物的设计，这个很容易，用primer 5 在已知序列里面随便挑一个分数高点的一般就行，实在不放心的话可以和接头引物配下对，看看有无引物二聚体，根据经验，一般没有。这位战友讲的太好了，受益匪浅
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daipeng217 5'race 现在的通用方法是根据CLONTECH SMART RACE kit 改进而来的方法那个试剂盒很坑爹的，价格高的离谱。其实在实验过程中完全没有必要买试剂盒，下面我来告诉你怎么玩。原理：5'race的关键目的就是要克隆出已知片段上游的未知片段。方法就是在反转录的过程中人为的在5'端加上接头，然后利用接头上面的特异序列作为引物和你已知序列上面的一段引物扩增cDNA片段，就能得到5'未知序列片段。方法：在反转录的过程中加入5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG–3'这个接头引物。在反转录之后这段序列就会位于整个mRNA反转录出来的cDNA的最前端。为什么？？MMLV反转录酶有一种特性就是在反转录到序列末端的时候加上三个C来终止这个反转录过程，利用这添加上去的CCC和上面给你的那个接头引物的GGG碱基配对，MMLV就会以上面那个引物为模版将反转录出来的第一链继续延伸出接头引物的互补链，从而形成一个带接头的cDNA 5'-末端。这个就是RACE的核心原理。具体不明白的看看这篇说明书就好，GOOGLE一搜，结果满天飞的，我就不给你传文件了。SMART? RACE cDNA Amplification Kit User Manual你肯定有一下问题1.上面给你的那个接头引物能不能换掉。上面那个引物看起来好像很普通，其实里面大有玄机，如果你用DNAMAN软件预测一下引物的二级结构就可以发现，这个引物自身能形成一个类似老虎钳子的形状，而且仅仅只有GGG三个核苷酸暴露在外面用来和MMLV添加出来CCC配对。所以这个引物的设计是非常巧妙的。不建议你更换，而且你换掉以后自己要在你实验动物的基因组中验证是否存在相同或互补序列，这也是另一个问题。2.是不是用普通的方法合成该接头引物即可。答曰，可以。clontech公司提供的试剂盒里面的这段引物其实并非全是单链DNA，用于配对的那关键的GGG用的是RNA单链，为什么？原因是DNA-RNA的结合能力强于DNA-DNA。明白了把，所以那个用来坑中国人钱的试剂盒提供的引物是很容易降解的，一旦那三个G降解掉了，好了，这8K+盒子就报销了。值得庆幸的是用全DNA引物是完全能满足RACE需求的。所以，随便找个单位合成一下这引物就可以了。3.是不是所有的反转录酶都可以答曰，不是。RACE的核心技术就是MMLV延伸的CCC。别的酶不具有这种特性。4.其他方法其他方法有很多，例如传统的方法，那种利用5'帽子结构筛选完整mRNA然后去帽子加接头的方法肯定是最好的。因为严格的说只有这种方法做出来的才真正称得上是准确的RACE。但是，同学，这方法麻烦，而且，价格不菲。这个贵是很有道理的，里面那么多种酶呀…………5.实验要求RNA的质量一定要好，越少的末端降解你得到的5'RACE结果就是越准确的。6.中间已知序列特异性引物的设计，这个很容易，用primer 5 在已知序列里面随便挑一个分数高点的一般就行，实在不放心的话可以和接头引物配下对，看看有无引物二聚体，根据经验，一般没有。学习了，之前看说明书还有一些不明白的地方现在都清楚了
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学习了：）
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引物合成常见问题解析，与大家分享
Q1.引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
(1)& & 去保护：加入Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT，获得游离的5'- OH；
(2)& & 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5'-OH仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的5'-OH发生耦合反应；
(3)& & 封闭：耦合反应中极少数5'- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应；
(4)& & 氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。
Q2.引物合成后如何处理？
切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。
纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。
定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。
储存：分装抽干。
Q3.需要什么级别的引物？
根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用& & & & 引物长度要求& & & & 纯度级别要求
一般PCR扩增& & & & < 60base& & & & HEPD
& & & & >60 base& & & & PAGE
诊断PCR扩增& & & & < 40base& & & & HEPD, PAGE
DNA测序& & & & 20base左右& & & & HEPD
亚克隆，点突变等& & & & 根据实验要求定& & & & HEPD, PAGE，HPLC
基因构建（全基因合成）& & & & 根据实验要求定& & & & HEPDPAGE
反义核酸& & & & 根据实验要求定& & & & HEPDPAGE
修饰引物& & & & 根据实验要求定& & & & PAGE, HPLC
Q4.引物的质量是不是跟序列有关？
四种碱基的性质和各自保护基的性质都有差别。所以合成难度是不一样的。难度最大的当属GC重复多的和序列中还有多个连续的G的引物。尤其对于后者，国内公司一般都做不了20个G以上的引物。实验证明，如果引物中有超过三个连续G的结构，传统方法得到的产物质量就会开始下降。而且目前通用的脱盐、OPC和PAGE方法都无效。
鼎国昌盛生物公司拥有的HEPD专利技术能够克服高GC或者高G含量引物的合成和纯化障碍，对普通引物、高GC引物和无论长短的oligo d（G）都能得到同样的非常好的结果。
Q5.需要合成多少OD数？
根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做500-1000次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。
Q6.如何计算引物的浓度？
引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul，称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算：
V (微升)= OD数x 33 x 10000 /引物的分子量
引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意：1 OD260= 33 ug/ml。
Q7.如何计算引物的Tm值？
引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。
长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10 + 0.41 (GC%) – 600/size＊
＊公式中，Size =引物长度。
Q8.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？
非修饰的引物的分子量（MW）在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x碱基的平均分子量，或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod)＋(Nx * Wx)+( NI* WI) +16* Ns–62.
NA, NG, NC, NT, NI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WG ,WC, WT, WI分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod分别为修饰基团的数目和分子量。对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。
常规碱基分子量
Base& & & & Molecular Weight
A& & & & 313.21
C& & & & 289.18
G& & & & 329.21
T& & & & 304.19
I& & & & 314.2
U& & & & 290.17
常规修饰基团分子量
5’-Biotin& & & & 405.45& & & & 3’-TAMARA& & & & 623.60
5’-(6 FAM)& & & & 537.46& & & & 3’-Dabsyl& & & & 498.49
5’-HEX& & & & 744.13& & & & 3’-(6 FAM)& & & & 569.46
5’-TET& & & & 675.24& & & & 3’-Amino Modifier C3& & & & 153.07
5’-Cy5& & & & 533.63& & & & 3’-Amino Modifier C7& & & & 209.18
5’-Cy3& & & & 507.59& & & & 3’-Thiol Modifier C3& & & & 154.12
Q9.如何溶解引物？
干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好瞬时离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或TE(pH8.0)缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。
Q10.如何保存引物？
引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。
干&&粉：运输时常温运输，-20℃可以保存一年。
储存液：配好后分装成几管，避免反复冻融，-20℃可以保存半年。
工作液：常规使用，4℃保存，也可-20℃保存，但应避免反复冻融。
修饰荧光引物：需要避光保存，尽快使用为宜。
Q11.最长可以合成多长的引物？
我们合成过100base的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80base。引物越长，出现问题的概率就越大，按照目前的引物合成效率，大于80base的粗产品，全长引物的百分比不高，后续处理还有丢失很多，最后的产量很低。
Q12.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高?
主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格也高。
Q13.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？
连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
Q14.为什么引物的OD260/OD280小于1.5？
需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T的含量比较高所致。下表是一个20base同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。
A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions
Base Composition& & & & A260/280
5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3& & & & 2.50
5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3& & & & 1.85
5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3& & & & 1.15
5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3& & & & 1.14
5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3& & & & 1.66
Q15.同样的OD用PAGE检测，EB染色为什么深浅不一？
通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。
Q16.如何检测引物的纯度？
实验室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用银染方式染色。
Q17.已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？
如果您溶解引物的水pH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。
谢谢分享！学习了 受教了。。。 :hand::hand::hand::hand::hand::hand::hand::hand: 学习了，呵呵
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