pcr循环中三段pcr退火温度与tm值各自的意义是什么?

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2014-10-30 02:40 标签： pcr循环数
PCR反应中酶的作用温度很高却不会失活.那么酶为什么保存在
taq聚合酶并不是说温度很高就不失活,而是能够在高温下维持一段时间活性.常规的taq聚合酶在PCR反应中大概能够维持2～3小时活性,实际上在2小时以后酶的活性就会显著降低了.为什么要将酶保存在低温呢,主要是保护酶,因为无处不在的蛋白酶的原因（比如空气中或者人的手上,头皮屑等）,你无法保证你在使用酶的时候不混入蛋白酶,一般低温的时候酶都是没有活性或者活性很低的,所以低温能够有效保护酶类.其实不止taq聚合酶,很多常温稳定的酶需要低温保存都是这个原因.
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PCRDNADNADNADNADNA
PCRDNA4dNTP3’DNADNADNAdNTPTaq DNAMg2+DNATaq DNAdNTP5’→3’DNAPCRDNADNA
DNA90~95℃DNADNAG-CG-CA-TG-CPCRDNADNAG-CG-CDNADMSOPCR97℃
37~65℃DNA-DNA12min
DNA-Taq DNAdNTPDNA--“”DNA72℃Taq DNA4060/“--”DNADNA24minPCR304023h“”DNA
PCRDNADNAY1XnYDNAXYn100%DNAPCRDNA“”PCRDNAPCR
PCR5'DNA3'5'3'“”“”5'3'“”“”“”PCRDNA
(1)PCRDNADNA
①ADNA
②▲DNA
①1▲②2▲
PCRDNADNA▲
(4)EcoRVMbolDNA(1 kb
1000)EcoRVMbol
……2011PCRPCR
①IIA3/47/8DNAIIIIA15/16
②ABDNA
&(2)PCRPCR DNADNA
15-30bp20bp
200-500bp10kb
3G+C40-60%G+CG+CATGC5
①IⅡ
②I’
(4)EcoRVMbol
(1)&#②(2)①IⅡ
②I’
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以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。PCR技术反应过程中控制不同温度的意义?
⑴PCR技术的基本原理：该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下,依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应.DNA聚合酶以单链DNA为模板,借助一小段双链DNA来启动合成,通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合,形成部分双链.在适宜的温度和环境下,DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3?-OH末端,并以此为起始点,沿模板5?→3?方向延伸,合成一条新的DNA互补链.PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液.类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物.PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板.每完成一个循环需2～4分钟,3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍.⑵PCR的反应动力学：PCR的三个反应步骤反复进行,使DNA扩增量呈指数上升.反应最终的DNA 扩增量可用Y＝(1＋X)n计算.Y代表DNA片段扩增后的拷贝数,X表示平(Y)均每次的扩增效率,n代表循环次数.平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值.反应初期,靶序列DNA片段的增加呈指数形式,随着PCR产物的逐渐积累,被扩增的DNA 片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应” ,这种效应称平台期数、PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素.大多数情况下,平台期的到来是不可避免的.⑶PCR扩增产物 ：可分为长产物片段和短产物片段两部分.短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5'端之间,是需要扩增的特定片段.短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的,以一个原始模板为例,在第一个反应周期中,以两条互补的DNA为模板,引物是从3'端开始延伸,其5'端是固定的,3' 端则没有固定的止点,长短不一,这就是“长产物片段”.进入第二周期后,引物除与原始模板结合外,还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合.引物在与新链结合时,由于新链模板的5'端序列是固定的,这就等于这次延伸的片段3'端被固定了止点,保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”.不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加,而“长产物片段”则以算术倍数增加,几乎可以忽略不计,这使得PCR的反应产物不需要再纯化,就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用.
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对温度的控制是为了实现体内DNA增值的过程.变性是为了让模板在高温（94°C）下解链为单链模板,退火（30-60）是为了让引物在低温下分别与变性的模板相结合,延伸（65-75）是由耐热DNA聚合酶的最适温度决定的,以引物为起点,沿着模板5‘-3’方向延伸.
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现在很多PCR都采用2部法，由于采用了不同的DNA聚合酶（最佳温度60度）。退火温度是引物与模板相结合的过程，一般不超过TM-5度，一般是50-55度，
扫描下载二维码PCR循环参数是如何确定的？
（1）变性时间是如何确定的？
在选择的变性温度下，DNA分子越长，两条链完全分开所需的时间也越长。如果变性温度过低或时间太短，模板DNA中往往只有富含AT的区域被变性。
在PCR的第一个循环中，有时常把变性时间设计为5
min，来增加大分子模板DNA彻底变性的概率，又称此为预变性。当模板DNA的G+C含量超过55%时，
需要更高的变性温度，来源于古细菌的DNA聚合酶比TaqDNA聚合酶更能耐受高温，因此更适合用来扩增富含GC的DNA模板。
（2）复性温度的确定有什么考虑？
复性过程（即退火）采用的温度至关重要。如果复性温度太高，寡核苷酸引物不能与模板很好地复性，扩增效率将会非常低。如果复性温度太低，引
物将产生非特异性复性，从而导致非特异性的DNA片段的扩增。
（3）延伸的时间是如何确定的？
Taq DNA聚合酶在最适反应温度（72～78 ℃）下聚合速率约为2 000
bp/min。根据多数研究者的经验，确定了一个规则，即：靶基因的每1 000 bp的
扩增产物的延伸时间被设计为1
min，以此类推。对于PCR的最后一个循环，许多研究者常把延伸时间增加为以前循环的延伸时间的3倍以上，以使所有
扩增产物完成延伸，这又称为后延伸。
（4）循环数目一般都为30，这个数值是怎么来的？
PCR扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的速率。一旦PCR反应进入几何级数增长期，反应会一直持续下去，
直至某一成分成为限制因素。从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增产物低到难以检测的程度。用
TaqDNA聚合酶在一个含有105个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的理想情况。
以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。

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