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肿瘤血管生成拟态研究新进展|研​究​进​展
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mTOR抑制剂Rapamycin联合RNAi沉默STAT3基因诱导BEL-7402肝癌细胞凋亡的实验研究
作&&&&者：
来&&&&源： 吉林大学
摘&&&&要： 肝细胞癌（Hepatocelluar Carcinoma，HCC）是一类严重威胁人类生命健康的疾病，每年死亡人数与新发病例数基本相当，并逐年增加。尽管目前针对肝细胞癌的主要治疗方法，如手术治疗、放疗、介入化疗和生物治疗等在不断地发展，但患者预后并没有取得较好效果。
肿瘤的发生、发展是一个多基因、多因素和多阶段参与的复杂病理过程，单一疗法通常不能取得满意效果，综合治疗是目前肿瘤治疗的主要研究方向。
在生物体内，细胞信号转导途径调控细胞增殖，分化，凋亡等生物学行为。PI3K/Akt/mTOR和JAK/STAT3信号转导通路对于调控细胞凋亡非常重要，在多种肿瘤细胞中处于活化状态。对HCC的信号转导通路的研究显示PI3K/Akt/mTOR和JAK/STAT3信转导通路的异常参与了HCC的发生与发展。
mTOR是PI3K/AKT/mTOR途径中重要的信号分子，通过其特异性抑制剂Rapamycin抑制mTOR磷酸化阻断PI3K/AKT/mTOR途径的信号转导。
RNAi是转录后水平的基因沉默，具有高特异性，仅降解与序列相对应的内源性基因的mRNA，而其他无关基因不受影响。RNAi有很高的效率，少量dsRNA就可以抑制相应的内源性基因表达。由于RNAi的特性，目前已经大量应用于生物学研究和基因治疗领域。通过构建STAT3-siRNA质粒，转染肝癌细胞，沉默STAT3基因，阻断PI3K/AKT/mTOR途径的信号转导。
PI3K/AKT/mTOR途径中的mTOR可以磷酸化STAT3Ser727位点，活化STAT3，促进JAK/STAT3信号转导途径对靶基因的转录，mTOR磷酸化STAT3将这两条信号转导途径有机的联系起来.
本实验构建pGC-STAT3-siRNA质粒，选取人肝癌细胞系BEL-7402为研究对象，使用Lipofectamine2000将其转染BEL-7402肝癌细胞，通过RNA干扰（RNAinterference，RNAi）沉默STAT3的表达，抑制JAK/STAT3信号传导途径。同时，应用Rapamycin抑制mTOR磷酸化，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路。研究针对这两条信号转导途径共同作用对肝癌细胞凋亡的影响，并探讨其机理，为靶向肿瘤基因治疗提供实验依据。
根据实验分为对照组、Rapa组、阴性质粒组、阴性质粒联+Rapa组、STAT3-siRNA组、STAT3-siRNA+Rapa组，分别通过MTT法检测BEL-7402细胞的增殖抑制作用，通过Annexin V/PI流式细胞术，Hoechst33258荧光染色检测细胞凋亡比率及形态学的变化，JC-1荧光染色观察线粒体膜电势ΔΨm变化，RT-PCR检测各组Bax、Bcl-2mRMA水平，并利用Western Blot方法检测cleaved-caspase3蛋白水平的变化。
首先通过RT-PCR及Western Blot方法确认了STAT3-siRNA质粒的针对STAT3基因沉默效应。并选取了对人肝癌细胞系BEL-7402有效的Rapa药物浓度。结果显示，STAT3-siRNA质粒转染及Rapamycin均可抑制肿瘤细胞的增值，显著高于对照组及阴性质粒组，具有统计学差异（P0.05）。而STAT3-siRNA+Rapa组的抑制率显著高于其他各组，具有统计学差异（P0.05）。沉默STAT3基因联合Rapamycin抑制mTOR功能较单纯沉默STAT3基因或抑制mTOR功能时进一步抑制BEL-7402细胞的增殖。
通过流式细胞术检测表明RNAi沉默BEL-7402肝癌细胞STAT3基因与Rapamycin联合应用明显促进凋亡，结果显示，对照组，Rapa组，阴性质粒组，阴性质粒+Rapa组，STAT3-siRNA质粒组及STAT3-siRNA质粒+Rapa组凋亡率分别为9.22±0.38%，16.47±1.04%，42.73±0.88%，43.03±0.64%，45.44±0.59%及60.22±0.87%。Rapa组，阴性质粒+Rapa组，STAT3-siRNA组，STAT3-siRNA+Rapa组明显高于对照组和阴性质粒组（P 0.05），STAT3-siRNA+Rapa组明显高于Rapa组，阴性质粒+Rapa组，STAT3-siRNA组（P 0.05），而Rapa组，阴性质粒+Rapa组，STAT3-siRNA组间的凋亡率无明显差别（P0.05）。Hoechst33258荧光染色检测同样表明联合治疗比单独治疗导致的细胞凋亡更加明显。
凋亡是细胞在多种因素作用、调节下的程序性死亡，细胞凋亡早期就出现线粒体膜电位下降，早于核酸酶的激活及磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。为了进一步证实针对PI3K/AKT/mTOR与JAK/STAT3信号转导途径联合作用增强肝癌细胞凋亡主要通过线粒体依赖途径，本实验检测各组细胞线粒体膜电位ΔΨm的变化情况。实验结果表明，结果显示，对照组及阴性质粒组细胞红色荧光较强，绿色荧光相对较弱，线粒体膜电位ΔΨm较高（91.33±1.78%，89.90±1.92%，P0.05），Rapa组，阴性质粒+Rapa组，STAT3-siRNA组，STAT3-siRNA+Rapa组细胞绿色荧光增强，红色荧光减弱，线粒体膜电位ΔΨm降低57.25±1.93%,55.69±1.99%，59.06±1.89%，27.28±1.82%，P 0.05），STAT3-siRNA+Rapa组降低细胞线粒体膜电势效应最强（P 0.05）。靶向STAT3和/或mTOR降低BEL-7402细胞线粒体膜电位ΔΨm效应最强，导致线粒体膜去极化。
Caspase-3是执行细胞凋亡的关键酶，无论通过线粒体依赖途径还是是死亡受体介导途径，都需要将caspase-3原酶降解为小分子量的活性片断，引起细胞凋亡。
结果显示，Rapa组、阴性质粒+Rapa组、STAT3-siRNA组、STAT3-siRNA+Rapa组的Bcl-2基因表达程度明显低于对照组、阴性质粒组，其中STAT3-siRNA+Rapa组的表达程度最低，与STAT3-siRNA组、阴性质粒+Rapa组、Rapa组相比较具有统计学差异（P 0.05）；显著低于对照组、阴性质粒组（P 0.01）。Bax基因表达在Rapa组、阴性质粒+Rapa组、STAT3-siRNA组、STAT3-siRNA+Rapa组的程度明显高于对照组、阴性质粒组，其中STAT3-siRNA+Rapa组的表达程度最高，与STAT3-siRNA组、阴性质粒+Rapa组、Rapa组相比较具有统计学差异（P0.05）；显著低于对照组、阴性质粒组（P0.01）。
Western Blot结果显示cleaved-caspase3蛋白在STAT3-siRNA+Rapa组表达明显高与其他组（0.83±0.11，P0.05），提示联合治疗可明显降低细胞线粒体膜电势效应，激活caspase-3增强，使细胞线粒体不同程度损伤，促进肝癌细胞凋亡、坏死。
本实验通过RNAi沉默BEL-7402肝癌细胞STAT3基因，从翻译水平阻抑STAT3基因表达，来抑制JAK/STAT3信号转导途径，联合应用mTOR特异性抑制剂Rapamycin抑制mTOR磷酸化，抑制PI3K/AKT/mTOR途径，诱导细胞凋亡，并同时通过mTOR抑制了STAT3Ser727的磷酸化，增强抑制JAK/STAT3信号转导途径，阻断Bcl-2基因转录，Bcl-2表达水平下降，Bcl-xl与Bax在线粒体膜上结合成复合物数量减少，Bax在线粒体膜上寡聚化，形成跨膜通道，导致线粒体膜电势能下降，促进细胞色素c释放，激活Caspase，增加细胞凋亡。
总之，针对PI3K/AKT/mTOR/和JAK/STAT3两条信号转导途径联合抑制，增加了肝癌细胞的凋亡率，表现出更强大而且稳定的促凋亡作用，为肝癌细胞的信号转导途径联合治疗和靶向治疗的优化提供了体外实验数据。
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前言4-5? 中文摘要5-9? Abstract9-16? 英文缩略词16-17? 第1章 绪论17-34?
1.1 PI3K/AKT/mTOR 和 JAK/STAT3 信号转导途径与肝细胞癌17-28?
1.1.1 PI3K/AKT/mTOR 信号转导途径17-21?
1.1.2 JAK/ STAT3 信号转导途径21-23?
1.1.3 PI3K/AKT/mTOR 与 JAK/ STAT3 信号转导途径在肿瘤中的作用23-25?
1.1.4 mTOR 抑制剂及阻断 STAT325-26?
1.1.5 PI3K/Akt/mTOR 及 JAK-STAT3 信号通路与肝细胞癌26-28?
1.2 RNAi 与肝细胞癌28-34?
1.2.1 RNAi 的发现历程28-29?
1.2.2 RNAi 的作用机制29-31?
1.2.3 RNAi 与肝细胞癌31-34? 第2章 Rapamycin 抑制 BEL-7402 肝癌细胞生长增殖实验34-48?
2.1 材料与方法34-44?
2.1.1 实验材料34-38?
2.1.2 实验方法38-44?
2.2 实验结果44-45?
2.2.1 不同浓度 Rapamycin 对 BEL-7402 肝癌细胞的增殖抑制率44?
2.2.2 Rapamycin 显著抑制 BEL-7402 肝癌细胞 mTOR 磷酸化44-45?
2.3 讨论45-48? 第3章 靶向 STAT3 的 RNA 干扰载体的构建及其基因沉默效应实验48-66?
3.1 材料与方法48-60?
3.1.1 实验材料48-50?
3.1.2 实验方法50-60?
3.2 实验结果60-64?
3.2.1 重组质粒 pGCsi.U6/neoRFP STAT3-siRNA 和 pGCsi.U6/ neoRFP scramble- siRNA 鉴定60-62?
3.2.2 载体转染荧光显微镜检测结果62?
3.2.3 RT-PCR 检测 STAT3 mRNA 表达情况62-63?
3.2.4 Western Blot 检测 STAT3 蛋白表达量63-64?
3.3 讨论64-66? 第4章 siRNA-STAT3 与 Rapamycin 联合作用诱导 BEL-7402 肝癌细胞凋亡的实验66-91?
4.1 材料与方法66-77?
4.1.1 实验材料66-70?
4.1.2 实验方法70-77?
4.2 实验结果77-87?
4.2.1 靶向 STAT3 和/或 mTOR 抑制 BEL-7402 细胞生长增殖77-78?
4.2.2 靶向 STAT3 和/或 mTOR 促进 BEL-7402 细胞凋亡78-82?
4.2.3 靶向 STAT3 和/或 mTOR 导致 BEL-7402 细胞线粒体膜去极化82-83?
4.2.4 凋亡相关基因 Bcl-2 和 Bax mRNA 的表达83-85?
4.2.5 靶向 STAT3 和/或 mTOR 提高 cleaved caspase 3 表达水平85-87?
4.3 讨论87-91? 第5章 结论91-92? 参考文献92-102? 攻读学位期间发表的学术论文及取得的科研成果102-103? 致谢103
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