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微生物实验技术复习题
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内容提示：1.用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油?起什么作用？。答：（1）应该先用擦镜纸将镜头擦干净,以防上次实验的污染（.2）操作时,先低倍再高倍.用完要擦掉油.（3）将聚光器升至最高位置并开足光圈。加香柏油,作用是（1）增加了显微镜的分辨率（2）增加照明亮度。。 。2.什么是物镜的同焦现象？它在显微镜观察中有什么意义？ 答：在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物像将保持基本准焦的状态，这种现象称为物镜的同焦。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。。 。3.影响显微镜分辨率的因素有哪些？。答：物镜的NA值（物镜的数值孔径）与照明光源的波长。。4.根据你的实验体会,谈谈应如何根据所观察微生物的大小,选择不同的物镜进行有效地观察。。答：放线菌、酵母菌、霉菌相对较大，要观察形态用中倍镜就可以观察了，若要观察微生物的结构的话，还是要选择高倍镜或者。
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实验动物的微生物学分类和无菌动物培育方法
17:02:12 来源：汕头大学医学院实验动物中心网站 浏览：2545次
（一）微生物学分类
动物体内外存在着许多细菌、病毒、寄生虫等生物体，其中一部分是动物生存所必须的，一部分对动物体是有害的，而实验动物所带的一些病原体不但影响动物本身，更重要的是影响了试验的准确性。为了保证实验的准确性、可重复性，必须对实验动物所携带的其他生物体加以控制，特殊情况下，使之成为无菌动物。根据对实验动物所带生物体控制范围的不同，我国将实验动物群体分为普通动物、清洁动物、SPF 动物和无菌动物及悉生动物。
1．普通动物　普通动物（conventional animals ，C V）又称一级动物，是微生物控制要求中最低的一个级别的动物，要求不带有动物烈性传染病和人兽共患病病原。普通动物对实验的反应性较差，实验结果不可靠，仅可供教学示范及作为预备试验之用。
&&& 普通动物饲养于普通环境中，饲喂全价饲料，饮水应符合城市饮水卫生标准，饲料、垫料要消毒，饲养室温度、湿度能人工控制，能防止蚊蝇等昆虫及野鼠进入。舍内外环境应定期打扫、消毒。必须对外来动物进行严格的检疫，淘汰、病死的动物要焚毁。普通动物最好是来源于清洁动物或SPF 动物，但一般是在常规饲养条件下的群体中通过不断淘汰发病动物，加强防疫措施，必要时注射疫苗（针对某些烈性传染病）等手段建立起来的，饲养成本低，供应量大。
2．清洁动物　清洁动物（clean animals ，CL）又称二级动物，除不带有普通动物应排除的病原体外，还不应携带对动物危害大和对科学实验干扰大的病原体。清洁动物外观健康无病，主要器官组织在病理组织学上不得有病变发生。清洁级动物是我国自行设立的一种等级动物，这类动物适宜于作短期和部分科研实验，其敏感性和重复性较好，目前我国已逐步广泛应用。
&&& 清洁动物必须饲养于半屏障环境中或屏障环境中。饲料、饮水、垫料、笼具等均需消毒。工作人员需更换灭菌工作服、鞋帽、口罩等后才可进入动物饲养室进行操作。舍内必须能控制温度、湿度、光照强度和光照时间。清洁动物必须来源于SPF 动物或无菌动物。
3．SPF 动物　SPF 动物（specific pathogen free animals ，SPF）又称三级动物，除不带有普通动物、清洁动物应排除的病原外，还应排除有潜在感染或条件性致病的病原，以及对科学实验干扰大的病原。如SPF 小鼠应排除金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、小鼠肺炎病毒、小鼠腺病毒、小鼠微小病毒、毛滴虫、鞭毛虫等。这类动物是目前国际公认的标准级别的实验动物，适合于作所有科研实验。
SPF 动物必须饲养于屏障环境中，饲料、饮水、垫料、笼具等必须灭菌，操作人员必须严格执行操作规程。SPF 动物保种最好饲养于隔离器中。SPF 动物必须来源于无菌动物或悉生动物。
4．无菌动物和悉生动物　无菌动物（germfree animals ，GF）和悉生动物（gnotobioticanimals，G N）属四级动物。无菌动物是指采用当前的手段无法检出一切其他生命体。悉生动物又称已知菌动物，是将已知菌植入无菌动物体内，因植入的菌类数量不同可分为单菌动物、双菌动物和多菌动物。这类动物必须饲养于隔离环境内，饲料、饮水、笼具必须严格灭菌，确保无菌。饲料中的营养成分必须齐全，满足无菌动物的需要，特别是维生素类营养物质。无菌动物一定来源于剖腹产或无菌卵的孵化。无菌动物和悉生动物适合于作一些特殊的研究试验，如病原研究、微生物之间关系研究、宿主与微生物之间关系研究、营养与代谢、抗肿瘤研究等。
（二）无菌豚鼠的培育方法
（1）器材：手术用聚氯乙烯膜薄隔离器一台，内置烧杯、镊子、眼科剪、纱布、毛巾、脱脂棉、水。饲育用聚氯乙烯薄膜隔离器一台，内置电源插座（连接照明电）、可折叠笼具、电热温控保温箱、纱布、毛巾、脱脂棉、镊子、天平、眼科剪、温度计、试管、培养皿（或不锈钢菜碟）、水、牛奶、蛋黄、饲料、复合维生素液等。手术台、手术刀、手术剪、止血钳、术巾、碘酊、药液渡槽、传递袋等。
（2）灭菌和消毒：隔离器安装完毕并检查密封后，用2 ％过氧乙酸喷雾灭菌，2 小时后通风，24 小时后检查无菌，合格后备用。饲料辐照灭菌，水、牛奶、蛋黄121 ℃20 分钟高压蒸汽灭菌。纱布、毛巾、脱脂棉121 ℃60 分钟高压蒸汽灭菌，其他耐热物品121 ℃30 钟高压蒸汽灭菌。隔离器内用物品灭菌后传入。隔离器使用及物品传入方法见第四章第一节。
（3）手术前准备：将手术用和饲育用隔离器用连接口连接起来，把药液渡槽装在手术隔离器上，放入足够量的2 ％过氧乙酸溶液，将隔离器内外隔绝开来。把传袋放入药液渡槽中，一头拉带伸向隔离器内，另一头在隔离器外。
（4）怀孕豚鼠的选择：在健康豚鼠群中选取成年雌雄豚鼠同居，60 余天后选择耻骨联合开张能容纳人食指的怀孕豚鼠作为手术对象，通过腹壁用手摸胎动，检查胎儿个数、大小，淘汰胎儿较小的孕鼠。挤压乳头，观察是否泌乳。综合上述条件判断是否符合手术指征。
2．剖腹摘取子宫术　参加手术的人员应戴口罩，双手戴乳胶手套，传递子宫者要戴长臂胶皮手套。用气体二氧化碳将豚鼠轻度处理，背位固定，用5 ％ 碘酊浸湿豚鼠腹部、外阴和肛门。切开腹部暴露子宫，用止血钳夹住输卵管及子宫颈，在两止血钳外侧切断输卵管和子宫颈，将子宫连同止血钳一起放人传递袋中，通过药液渡槽，迅速传入隔离器内，敏捷地用温水将子宫冲洗一下。再用两把带钩镊子撕开子宫，取出胎儿，交由他人擦去口鼻粘液，促其自主呼吸，再传入饲育隔离器内，放入保暖箱中。全过程越快越好。从切除子宫到胎儿呼吸应在2 分钟内完成。
3．饲养管理
（1）温度调控：无菌豚鼠培育的重点在温度调控上。胎儿出生时适宜温度36 ℃左右，
体毛干后6 小时，温度降至31 ℃，1 ～5 日龄应维持31 ℃±5 ℃，此后隔天下降0．5 ℃，10 日龄后维持在25 ℃，以保证豚鼠自主摄食，发育良好。
（2）饲料与喂养：无菌豚鼠所用饲料主要是灭菌牛奶、蛋黄、颗粒料、1 ％ 复合维生素液。将饲料等放人器皿中由仔鼠自由采食，少量多次投喂，避免粪尿污染。3 日龄内最好辅助饲喂，用注射器吸少量牛奶滴入豚鼠口中，每日5 ～6 次，每次1 ～3 ml 。辅助饲喂有助于减小初生几天体重下降的幅度。7 ～10 日龄添加颗粒饲料。蛋黄喂至40 日龄，牛奶喂至60 日龄，此后仅以无菌饲料及复合维生素水喂养。10 日龄后可将仔鼠从保温箱中取出，直接放在笼子里饲养。日常注意清洁卫生，保持室内温度稳定。
4．无菌检查　在仔鼠7 、15 、25 日龄采集新鲜粪便、饮水、垫料适量，放入无菌试管中，按操作程序带出隔离器。将粪便、垫料用适量无菌生理盐水混匀，连同水按表1 －2 中所列项目分别接种、培养。在三种温度下培养至14 天，观察有无细菌和真菌生长。在第7 、14 天，从两个37 ℃下培养的液体培养基中转种至血平板，置37 ℃培养4 天，观察有无细菌生长。经四种培养基、三个温度、18 天的培养，未发现有菌生长则判为无菌生长，确认取样时动物处于无菌状态。
注：①必要时对粪便样品作37 ℃厌氧培养。②“√”表示应接种。
5．繁育　无菌豚鼠可饲养很长一段时间，但到目前为止，无论用何种饲料和饲养方法都无法使无菌豚鼠进行繁殖。
（三）无菌兔的培育
（1）器材：中型塑料薄膜隔离器一台，内置不锈钢兔笼一台，喂乳用量筒、玻璃组织捣碎器、乳胶管、人工乳头、注射器、针头、垫布、纱布、鼠盒等。其他用品的准备参考无菌豚鼠的培育。
（2）孕兔的选择：在健康兔群中，选取配种怀孕30 天经产母兔进行摸胎，胎数6 个左右、胎儿体型较大的为好。发现拉毛，应立即进行手术。当日未拉毛也应在下午进行手术，以免过夜后自动分娩。
2．人工乳配制　无菌兔的人工乳配制中含兔乳量越多越好。但从实践看，以含40 ％兔乳的人工乳饲喂效果最好。人工乳主要成分：兔乳40 ％、山羊乳59 ％、维生素混合液1 ％。将兔乳、山羊乳混合后加1 ％鱼肝油，121 ℃30 分钟高压蒸汽灭菌。喂乳前用组织捣碎器使之乳化，再加1 ％ 的复合维生素液。如无山羊乳，也可用鲜牛奶加10 ％ 淡奶粉代替。兔乳、羊乳、牛乳可冷冻干燥后进行辐照灭菌，用时只需配以适量无菌水。这样，乳的营养成分破坏少，保持乳的营养价值，饲喂效果更好。复合维生素液，除V A 、V D 通过在乳中加入鱼肝油外，以人用维生素针剂适当配合即可。复合维生素液的配合量见表1 －3 。
3．剖腹取胎　与无菌豚鼠剖腹手术过程不同的是，药液渡槽的通道要相应扩大，而整个手术时间可以较宽裕一些。从子宫中取出胎儿后应即擦去口鼻上的羊膜，轻按胸部，促其自主呼吸，很快可见身体由灰暗转为红润，放人鼠盒中保温。仔兔取完后立即把废弃物及手术器械等退出隔离器。
4．人工哺乳　人工哺乳的方法有自由哺乳和强制哺乳两种。
（1）自由哺乳：将盛乳容器量筒置于较高处，用注射器吸取少许人工乳注满乳胶管，将乳胶管放入量筒中，把乳头接上乳胶管，在乳头上开一丁字形小口，排尽空气，让乳充满乳头，将乳头低于量筒，以乳头能有乳滴出为度，不能流速过快。左手食指、拇指捏住仔兔的两侧颞部，悬空提起，右手持乳头从一侧口旁插入口中0．5 ～1．0cm 深度，并固定乳头与兔嘴之间的关系，两手指轻捏乳头，挤出少许乳至兔口中，仔兔自主吞咽，吮吸乳头。给初生仔兔喂乳，可在乳中加10 ％的无菌水，以便于仔兔吮吸。每次喂乳应密切观察喂乳量及仔兔的反应。喂量应定量，多吸有时会造成呛奶，经常呛奶会导致发育不良或窒息死亡。喂乳量应随着日龄的增长及补充喂料等情况适当调整。表1 －4 是常用的给乳量。前期喂量逐渐加大，中期稳定，后期减少，促其采食饲料。喂乳次数，一般每天3 ～4 次，也可每天2 次。
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（2）强制哺乳：用注射器吸乳并注满胃管，左手持仔兔，右手持注射器，滴一滴乳于兔唇上，待兔舔乳时，将胃管插人口中，由兔自主吞咽，操作者随吞咽动作缓缓跟进胃管。确认胃管已在胃中时，将定量的乳推人胃中，迅速退出胃管。初生仔兔可在腹部看出胃内是否有乳汁。
5．日常管理
（1）温度：初生仔兔对温度要求较高，环境温度应在31 ℃左右，在此温度下，仔兔在喂奶后会钻进垫布中去，过一段时间又会从垫布中钻出来，睡在盖布的上面，仔兔表现出皮肤红润，健康活泼，胃中食物消化较快。10 日龄后，仔兔的毛逐渐变长，温度可逐步下调，每天下调1 ℃，稳定在25 ℃，断奶后稳定在22 ～25 ℃。
（2）清洁卫生：初生兔易发生尿潴留，一周龄前应每天人工诱尿一次，用手指轻轻点按仔兔外阴，刺激其排尿。排尿后用无菌水清洗外阴部，擦去粪便，洗净身体，并用无菌纱布将身体擦干，重新放入盒中。3 日龄后因喂量增加，尿液增多，应在每次喂奶后半个小时，更换一次尿垫，以免仔兔睡在潮湿的尿垫上。仔兔睁眼后，可放入笼中，笼底垫上纱布，25日龄后可不垫布，任其在笼中自由活动。
（3）饲喂：除喂奶外，在仔兔15 日龄时，可放入少量已灭菌的颗粒料于平皿中，在颗粒料上拌点人工乳，任其自由采食。25 日龄后，采食量逐渐增大，应另加水，在水中添加复合维生素液。视仔兔发育情况，可在30 ～35 日龄断奶，仅喂颗粒料和饮水。
6．无菌检测同无菌豚鼠培育的检测。
（四）SPF 兔培育
1．种源　SPF 兔的种源必须来源于无菌兔或悉生兔。由于无菌兔不具备繁殖能力，除了进行特殊研究之外，培育无菌兔的目的是为了提供SPF 兔的种源，净化兔携带的生物体。将多种非致病菌如白色葡萄球菌、粪链球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌等接触无菌兔，使之成为悉生兔，再将其移入屏障环境中，成为SPF 兔。或者直接将无菌兔移入屏障环境中，成为SPF 兔。一般SPF 兔繁殖单位可以直接从SPF 兔种子供应基地引进种兔。
2．环境　SPF 兔必须饲养在屏障环境中，其对环境的要求见表1 －5 。除此之外，若采用水冲式清除粪便，下水道出口处必须设置返水弯，避免野生动物，污水、浊气返流进入屏障环境。
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&3．饲料、饮水准备
（1）饲料：SPF 兔饲料配方必须营养全面，主要指标如粗蛋白含量应大于18 ％，粗纤维含量10 ％以上，并给予充足的必需氨基酸、微量元素、多种维生素，及钙、磷、食盐等。以此为基础，选择优质原料，均匀混合，制成颗粒料，采用复合密封包装，进行辐照灭菌，照射剂量250 万rad 。辐照饲料检测合格后放置在4 ～8 ℃阴凉处保存，防止鼠害。也可将饲料用于真空高压蒸汽灭菌，预真空3 次，132 ℃5 分钟，或预真空3 次，126 ℃10 分钟。但蒸汽灭菌对饲料营养破坏较严重，特别是维生素和氨基酸，因此，必须在饮水中添加这两类营养物质。
（2）饮水：用符合国家卫生标准的自来水进行高压蒸汽灭菌，或先在水中加入盐酸制成pH2．5 ～3．0 的酸化水，再进行高压蒸汽灭菌。可用除菌滤器过滤自来水制取无菌水，有条件的单位使用无菌蒸馏水作为饮水。
4．SPF 环境的消毒
（1）消毒：SPF 环境（屏障环境）启用前必须进行严格的消毒。SPF 兔所用屏障环境内放置有兔笼架，难以轻易移动，只能放在屏障环境内一起消毒。首先，清洗整个饲养间，上至顶板，下至地面，以及笼架，直至每个角落。然后，用消毒液大量喷雾，直至每处都淋有消毒药液，特别是笼具的底面等不易喷雾到的地方。几类消毒药液交替使用，每次喷雾后数小时开启风机吹干，重新喷雾。最后用福尔马林熏蒸消毒。每m 3 空间用福尔马林20 ml ～25 ml 加等量高锰酸钾，每20 m 2 面积放置一个耐热容器，将福尔马林放人容器内，准备好等量高锰酸钾，离出口最远处先加高锰酸钾，依次迅速加药至其他容器，最后退出屏障环境，封好门，密闭24 小时后，开风机通风2 ～3 天，直至在排气口嗅不出福尔马林的气味为止。若室内较干燥可在福尔马林中加等量水，室内气温应在20 ℃ 以上，以提高消毒效果。
（2）检查落下菌数：检查人员必须先充分淋浴，更换灭菌工作服，风淋后进入屏障环境。从传递仓取出灭菌的血琼脂平板，每5 m 2 ～10 m 2 放置一个直径9cm 的培养皿，打开盖，暴露30 分钟，然后盖上盖带出，放入37 ℃温箱中培养48 小时。取出血琼脂平板计算菌落数，平均每个平皿不超过3 个菌落为合格。将可疑菌落作进一步检查，必须应排除金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌。若符合标准则消毒合格，可以运行。否则必须重新消毒。
5．笼器具等的消毒不锈钢可折叠兔笼、笼底板放入双门高压蒸汽灭菌器内消毒，
121 ℃20 分钟。打扫用具、灭菌工作服、口罩、鞋、内衣、裤等121 ℃30 分钟。各类物品进入屏障环境必须进行必要的消毒。
6．SPF 种兔的引入将放在双层包装内的SPF 种兔的外包装拆除，放入传递仓中，对传递仓进行全面喷雾消毒，注意包装箱底部的消毒，密闭2 小时后，由屏障内工作人员取至饲养室，放入笼中，包装物品及时退出。
7．日常管理要求
（1）人员出入屏障环境：进入时，先更衣，在淋浴间充分淋洗，从头到脚用肥皂擦洗，尤其指甲缝中应注意刷洗，并冲洗干净。进入二更衣室，用消毒毛巾擦干全身，换穿灭菌内衣、戴口罩，外穿无菌工作服（帽、衣、裤、袜一体），手用消毒液浸泡后戴上工作手套。进入风淋室吹淋1 分钟，进入清洁走廊。正常工作完毕，人员进入缓冲间，从污染走廊退出屏障环境。注意各室的鞋不要串用，离开每间房都得换鞋。
（2）饲喂：灭菌全价颗粒料充分供应，自由采食，根据采食量大小不同，适当增减，以减少浪费。灭菌水充足供应，自动饮水器任兔饮用，不加限量。（3）清洁卫生：清除笼底板上的粪便，粪便积聚较多的笼底板应更换放入袋中。清除承托盘上的粪尿，水冲式则冲水清粪，若干法饲养，则将粪尿收集放人袋中，重新铺上塑料布。收集的粪袋及笼底板放在污染走廊里。
（4）消毒：用消毒液抹洗笼具的各个面、墙壁、拖地板，清除各处的兔毛。打扫完毕后，用消毒药液喷雾各处，兔体、笼具、空间，以降低空气中的含尘、含菌量。各种类型消毒液要轮换使用。
（5）繁育：6 ～7 月龄后，将已发情的母兔放到种公兔笼中配种，并作记录，10 天后摸胎确定是否怀孕。在孕兔怀孕28 天左右放人产仔箱，产仔箱中放入消毒过的碎纸条作为垫料，供其做窝。产仔后选留6 ～7 只，其余淘汰。产后10 ～12 天配种或进行血配。仔兔28日龄或30 日龄断奶。平时应做好系谱和仔兔生长发育情况的登记。
（6）其他：药液渡槽的药液要按期更换，增加新药液，淋浴室内要经常保持清洁卫生，并要每周消毒2 ～3 次。新风口的初效过滤器每月清洗更换1 ～2 次，中效过滤器半年清洗更换1 次，高效过滤器出口风速过低或有破损时应及时更换。对于周围环境，要防烟尘过多，以延长高效过滤器的使用寿命。屏障环境周围要清扫干净，有昆虫活动季节要常喷杀虫剂，杀死飞虫、爬虫，以防钻入屏障内造成污染。