革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种，1884年由丹麦医师Gram创立。未经染色之，由于其与周围环境折光率差别甚小，故在下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属。
革兰氏染色 -
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法，即将固定后，先用染色，加媒染后用脱色，再用复染。染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为（G+）。被酒精脱色复染成红色者为（G-）。革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等电点等因素有关。致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色溶血性链球菌、肺炎球菌、白喉杆菌、杆菌等属革兰氏染色阳性菌。百日咳杆菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌、流行性脑膜炎双球菌、淋病双球菌等均属革兰氏阴性。所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。
革兰氏染色 -
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用或脱色时溶解了，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。
革兰氏染色 -
1、&取载玻片用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。2、&涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在酒精灯火焰附近5cm左右打开管盖；右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。固体培养基：先在载玻片上滴一滴无菌水，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。3、&晾干：让涂片在空气中自然干燥。4、&固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。5、&染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。6、&水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸水纸吸干。简单染色结束可观察细胞形态。7、&媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。8、&脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。9、&复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束。
革兰氏染色 -
在实验中经常会出现和的结果，假阳性主要是由于脱色不完全，可能是由于涂片过厚，或者是结晶紫染色过度，导致脱色不完全。假阴性可能是因为细胞固定过度，造成细胞壁通透性的改变，而出现假阴性结果；另外，细胞培养时间太长，可能已经有部分细胞发生死亡或者，也导致细胞壁通透性的改变而出现假阴性结果。
革兰氏染色 -
枯草芽孢杆菌G+
大肠杆菌G-
革兰氏染色 -
[1]. 《微生物学教程》 周德庆 编著 高等教育出版社
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保存二维码可印刷到宣传品实验二十二 简单染色法和革兰氏染色法
实验二十二
简单染色法和革兰氏染色法
细菌的简单染色法
一、目的与要求：
1&学习微生物涂片、染色的基本技术。
&&& 2&掌握细菌的简单染色法。
&&& 3&初步认识细菌的形态特征，巩固学习油镜的使用方法和无菌操作技术。
二、原理：
细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。
常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料染色。
染色前必须固定细菌。其目的有二：一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增加其对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。
&&& 1&&菌种
枯草芽孢杆菌12～18h营养琼脂斜面培养物，藤黄微球菌(Micrococcus&luteus)约24h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌（Escherichia&coli）24h营养琼脂斜面培养物。
&&& 2&&染色剂
吕氏碱性美蓝染液(或草酸铵结晶紫染液)，石炭酸复红染液。
&&& 3&&仪器或其他用具
显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，玻片搁架、双层瓶(内装香柏油和二甲苯)，擦镜纸，生理盐水或蒸馏水等。
涂片→干燥→固定→染色→水洗→干燥→镜检。
&&& 1&&涂片
取两块洁净无油的载玻片，在无菌的条件下各滴一小滴生理盐水(或蒸溜水)于玻片中央，用接种环以无菌操作（图2-1），分别从枯草芽孢杆菌、藤黄微球菌和大肠杆菌斜面上挑取少许菌苔于水滴中，混匀并涂成薄膜。若用菌悬液(或液体培养物)涂片，可用接种环挑取2～3环直接涂于载玻片上。注意滴生理盐水（蒸馏水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀，不宜过厚。
&&& 2&&干燥
室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干燥。但切勿离火焰太近，因温度太高会破坏菌体形态。
&&& 3&&固定
如用加热干燥，固定与干燥合为一步，方法同干燥。&图&2-1&涂片、干燥和热固定&
&&& 4&&染色
将玻片平放于玻片搁架上，滴加染液1～2滴于涂片上(染液刚好覆盖涂片薄膜为宜)。吕氏碱性美蓝染色1～2min，石炭酸复红(或草酸铵结晶紫)染色约1min&。
&&& 5&&水洗
倾去染液，用自来水从载玻片一端轻轻冲洗，直至从涂片上流下的水无色为止。水洗时，不要水流直接冲洗涂面。水流不宜过急、过大，以免涂片薄膜脱落。
&&& 6&&干燥
甩去玻片上的水珠自然干燥、电吹风吹干或用吸水纸吸干均可以（注意勿擦去菌体）。
&&& 7&&镜检
涂片干后镜检。涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。
绘制单染色后观察到的大肠杆菌和藤黄微球菌的形态图。
&革兰氏染色法
一、目的与要求：
1&了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性.
2&学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法。
二、原理：
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家Christain&Gram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。
革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌。
革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
&&& 1&&菌种
大肠杆菌（Escherichia&&coli）约24h营养琼脂斜面菌种一支，枯草芽孢杆菌（Bacillus&subtilis）约16h牛肉膏琼脂斜面菌种一支。
&&& 2&&染色剂
结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。
&&& 3&&仪器或其他用具
显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。
涂片→干燥→固定→染色（初染→媒染→脱色→复染）→镜检。
A&&常规涂片法
取一洁净的载玻片，用特种笔在载玻片的左右两侧标上菌号，并在两端各滴一小滴蒸馏水，以无菌接种环分别挑取少量菌体涂片，干燥、固定。玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
&&& B&&“三区”涂片法
在玻片的左、右端各加一滴蒸馏水，用无菌接种环挑取少量枯草芽孢杆菌与左边水滴充分混合成仅有枯草芽孢杆菌的区域，并将少量菌液延伸至玻片的中央。再用无菌的接种环调取少量大肠杆菌与右边的水滴充分混合成仅有大肠杆菌的区域，并将少量的大肠杆菌液延伸到玻片中央，与枯草芽孢杆菌相混合含有两种菌的混合区，干燥、固定。
要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。
&&& 2&&初染
滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于两个玻片的涂面上，染色1～2min&，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。
&&& 3&&媒染
用卢戈氏碘液媒染约l&min&，水洗。
&&& 4&&脱色
用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。脱色时间一般约20～30s。
&&& 5&&复染
在涂片上滴加番红液复染约2～3min&，水洗，然后用吸水纸吸干。在染色的过程中，不可使染液干涸。
&&& 6&&镜检
干燥后，用油镜观察。判断两种菌体染色反应性。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌（G+），被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。
&&& 7&&实验结束后处理
清洁显微镜。先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少许二甲苯擦去镜头上的残留油迹，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯。染色玻片用洗衣粉水煮沸、清洗，凉干后备用。
&&& 1&根据观察结果，绘出两种细菌的形态图。
&&& 2列表简述两株细菌的染色结果(说明各菌的形状、颜色和革兰氏染色反应)。
&&& 1&哪些环节会影响革兰色染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？
&&& 2&进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题?
&&& 3&革兰氏染色时，初染前能加碘液吗?乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色?
&&& 4&不经过复染这一步，能否区别革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌？
&&& 5&你认为制备细菌染色标本时，应该注意哪些环节?
&&& 6&为什么要求制片完全干燥后才能用油镜观察?
&&& 7&如果涂片未经热固定，将会出现什么问题?加热温度过高、时间太长，又会怎样呢?您所在位置： &
&nbsp&&nbsp&nbsp&&nbsp
实验二+细菌的简单染色与革兰氏染色.ppt20页
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实验二 细菌的简单染色与革兰氏染色 一、目的要求 1、巩固显微镜的使用方法； 2、掌握细菌的简单染色和革兰氏染色的原
理和方法。 二、基本原理 革 兰 氏 染 色
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。 ? 碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美兰、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。 ? 酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。 ? 中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美兰、伊红天青等。 简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 革兰氏阳性和阴性菌细胞壁成分比较 成分
占细胞壁干重的%
革兰氏阳性菌
革兰氏阴性菌 肽聚糖
含量很高（50-90）
含量很低（~10） 磷壁酸
含量较高（ 50）
含量较高（~20） 蛋白质
含量较高 G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易
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