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问答题简答题什么是革兰氏染色法？它的主要步骤是什么？哪一步是关键？
革兰氏染色法是细菌细胞的复合染色法，由丹麦医生Hans Christian Gram于1884年创立。主要步骤：涂片固定、结晶紫初染、......
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指还残留部分细胞壁的原生质体。通常G-形成。
5.名词解释
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革兰氏染色法
录入时间: 11:01:14
来源：青岛海博
&&目的要求1&．学习并初步掌握革兰氏染色法。2&.了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性．二、基本原理革兰氏染色法是1884&年由丹麦病理学家Christain&Gram创立的，而后一些学者在此基础上作了某些改进，革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法，革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如番红）复染．经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝萦色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色）．该菌解于革兰氏阴性菌．革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的．实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染荆的蓝萦色．碘作为媒染剂，它能与结晶萦结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力甲当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的，革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肤聚籍形成的网状结构组成．壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使吠聚塘层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫一腆的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色．革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肤聚糖层较薄、类脂含t&高．所以当脱色处理时，类脂质被乙醇〔&或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，便结晶紫一碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的正确性，采用规范的染色方法是十分必要的．本实脸将介绍被普遥采用的H&成ker&氏改良的革兰氏染色法．三、器材1&．菌种大肠杆菌约24h&百养琼脂斜面培养物，金黄色葡萄球菌约24h&营养琼脂斜面培养物．蜡样芽孢杆菌12~20h&营养琼脂斜面培养物。2&．染色剂革兰氏染色液．3&．仪器或其他用具&四、操作步骤1&．制片取苗种培养物常规涂片、干燥、固定．要用活暇生长翔的幼培葬临作，兰氏染色；涂片不宜过厚．以免脱色不宪全造成假阳性；火焰固定不宜过热（以玻片不扭手为宜）.&2&．初染滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1~2min，水洗。3&．媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗．4&．脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下．用滴管流加95&％的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。5&．复染用番红掖复染约2min，水洗．6&．镜检干燥后，用油镜观察．菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌．7&．混合涂片染色按上述方法，在同一载玻片上．以大肠杆菌和蜡样芽袍杆菌或大肠杆菌和金黄色葡萄苗作混合涂片染色、镜检进行比较。五、实验报告1.结果列表简述3&株细菌的染色观察结果（说明各菌的形状颐色和革兰氏染色反应〕&，2&．思考题（1）你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？&（2）现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌，请你鉴定其革兰氏染色反应．你怎样运用大肠杆国和金黄色葡萄球菌为对照菌株进行涂片染色，以证明你的染色结果正确性．(&3&）你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。(&4&）进行革兰氏染色时，为什么特别强调菌龄不能太老，用老龄细菌染色会出现什么问题？(&5&）革兰氏染色时，初染前能加碘液吗？乙醇脱色后复染之前，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌应分别是什么颜色？（6）你认为革兰氏染色中，哪一个步脚可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？&&&&
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革兰氏染色法
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革兰氏染色
革兰氏染色是用来鉴别细菌的一种方法，上的主要成份不同，利用这种染色法，可将细菌分成两大类，即与。这种染色法是由一位丹麦医生汉斯&克里斯蒂安&革兰（Hans Christian Gram，1853年－1938年）于1884年所发明，最初用来鉴别与克雷白氏肺炎菌之间的关系。革兰氏染色的对象是细菌的细胞壁，染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
革兰氏染色
呈紫色，呈红色
汉斯·克里斯蒂安·革兰
是否有误差
是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法，这种染色法是由一位丹麦医生汉斯·克里斯蒂安·革兰（HansChristianGram，1853年－1938年）于1884年所发明，最初是用来鉴别肺炎球菌与克雷白氏肺炎菌之间的关系。未经染色之细菌，由于其与周围环境差别甚小，故在显微镜下极难观察。染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。原理通过初染和媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且差，在遇后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
一般包括初染、媒染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：1）涂片固定。2）结晶紫染1分钟。3）自来水冲洗。4）加碘液覆盖涂面染约1分钟。5）水洗，用吸去水分。6）加95%酒精数滴，并轻轻摇动进行脱色，20秒后水洗，吸去水分。7）蕃红染色液（稀）染1分钟后，自来水冲洗。干燥，镜检。
通过初染和媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，由于其细胞壁较厚、网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且差，在遇后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。染色的差异主要是由于阴性与阳性的差异所应起的。①的细胞壁G+细菌细胞壁具有较厚（20-80nm）而致密的肽聚糖层，多达20层，占细胞壁成分的60%～90%，它同细胞膜的外层紧密相连（图2-9）。有的G+细菌细胞壁中含有（teichoic-acid），也称（murein），它是甘油和核糖醇的聚合物，磷壁酸通常以糖或氨基酸的酯而存在。由于磷壁酸带，它在细胞调节阳离子浓度。磷壁酸与细胞生长有关，细胞生长中有自溶素（autolysins）酶类起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能，阻止胞壁过度降解和壁溶。如果细胞壁的肽聚糖层被消溶，G+细胞成为（protoplasts），细胞壁不复存在，而只存留细胞膜。除链球菌外，大多数G+细菌细胞壁中含极少蛋白质。②的细胞壁G—细菌细胞壁比G+细菌细胞壁薄（15～20nm）而结构较复杂，分外膜（outermembrane）和肽聚糖层（2～3nm）（图2-10）。在细胞壁和细胞质膜之间有一个明显的空间，称为壁膜间隙（periplasmicspace）。外膜G—细菌细胞壁外膜的基本成分是（lipopolysaccharide,LPS），它同细胞质膜相同之处也是双层类脂，但除磷脂外还含有多糖和蛋白质。LPS的多糖部分包括核心多糖和O-特异多糖。O-特异多糖由重复分支的分子组成，含有已糖（葡萄糖、和）和二脱氧已糖。由于糖的种类不同，使各种G—细胞具有不同特性的LPS。核心多糖（corepolysaccharide）的主要组分是酮脱氧辛酸（ketodeoxyoctonate,KDO）。外膜中还含有几种蛋白，如脂蛋白、通透蛋白。有些蛋白具有通孔作用（porin），调控外界分子进入细胞；有的蛋白分子可以作为噬菌体的受体；许多G—细菌对高等生物有致病性是由LPS的成分决定的，它的毒性组分常称为（endotoxins）。肽聚糖层G—细菌细胞壁的肽聚糖层很薄，在大肠杆菌和其它细菌中仅有单层。肽聚糖层和外膜的内层之间通过脂蛋白连接起来。壁膜间隙G—细菌细胞壁的外膜与细胞质膜之间存在明显的壁膜间隙，一层薄的肽聚糖处于其间，肽聚糖层和细胞质膜之间的间隙较宽，肽聚糖层至外膜之间的间隙较窄。大肠杆菌的壁膜间隙宽度为12～15nm，呈胶胨态。其间含有三类蛋白质：，催化食物的初步降解；，启动物质转运过程；化学受体（chemoreceptors），在趋化性中起作用的蛋白。
革兰氏阳性菌都呈紫色，革兰氏阴性菌都呈红色。
致病菌与选择革兰氏阳性菌：（主要是、等）、（、、肠球菌等）、、、、等，其中，金黄色葡萄球菌、肠球菌等为临床重要等病原菌。革兰氏阳性菌通常对、第一（或第二）代头孢菌素、、等高度敏感，但是因为抗生素的滥用，MRSA/MRSE、VRSA/VISA、PISP/PRSP、VRE等已经严重威胁着人类的生命，这些细菌感染时，可以考虑使用万古霉素、共杀素（奎奴普丁/达福普丁）、、、、（建议与耐酶的青霉素类或联用）等。另外，CNS（）等细菌也要引起足够等重视。革兰氏阴性菌：、菌属、（等）、菌属（等）、（、等）、（、等）、克雷伯菌属（主要是）、、（痢疾杆菌等）、黄杆菌属、、军团菌属、耶尔森菌属、（、等）、属、、等。革兰氏阴性菌在中的细菌感染中占了大约65%，且大多菌株容易对抗菌药物耐药，目前，产生“新德里金属酶”（NDM-1）的绝大多数细菌都是革兰氏阴性菌（主要是大肠杆菌、鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯杆菌）。革兰氏阴性菌对（、、头孢曲松等）、（、等）、抗假单胞菌属的青霉素类（、、等）、等高度敏感，对头霉素类和第二代头孢菌素也较敏感，但是，MDR-AB/PDR-AB、PDR-PA等多重耐药菌给临床用药带来过很大的困难。多粘菌素、（、等）、等可以用于多重耐药菌等治疗，但要慎用，否则很可能会到无药可医的地步（绿脓杆菌和鲍曼不动杆菌的一些菌株甚至已经对碳青霉烯类有）。值得注意的是，/、哌拉西林/、替卡西林/、氧头孢烯类（、等）对某些多重耐药菌也有特效，比如产ESBLs或AmpC酶的菌株，可以考虑与其他抗菌药物（等）联用，另外，和多粘菌素联用时，几乎对所有对细菌都有协同抗菌作用，也可考虑。根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。
其重要的临床意义在于：1.鉴别细菌2.选择药物3.与致病性有关：能产生，能产生；而内毒素主要是指革兰氏阴性菌胞壁成分中的，两者的致病作用不同。
染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。革兰氏染色属复染法，即将标本固定后，先用染色，加媒染后用酒精脱色，再用蕃红复染。染色后除可以看到细菌形态外，还可将细菌分为两大类，即不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G+）。被酒精脱色复染成红色者为革兰氏阴性菌（G-）。革兰氏染色原理尚不肯定，可能与细菌所带核糖核酸、细菌壁结构通透性、等因素有关。致病菌如金黄色葡萄球菌、绿色、、白喉杆菌、杆菌等属革兰氏染色阳性菌。、大肠杆菌、、痢疾杆菌、霍乱弧菌、流行性脑膜炎双球菌、等均属革兰氏阴性。所以根据细菌的革兰氏染色性质，可以缩小鉴定范围，有利于进一步分离鉴定，以对疾病做出诊断。又由于各种抗生素的抗菌谱不同，革兰氏染色尚可做为选用抗生素的参考。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且层较薄、低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色，呈现蓝紫色。
1、取用纱布擦干，载玻片的一面用marker笔画一个小圈（用来大致确定菌液滴的位置）。涂菌的部位在火焰上烤一下，除去油脂。2、涂片：液体培养基：左手持菌液试管，在火焰附近5cm左右打开管盖；右手持在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从试管中沾取菌液一环，在洁净无脂的载玻片上涂直径2mm左右的涂膜，最后将接种环在火焰上烧灼灭菌。：先在载玻片上滴一滴，再用接种环取少量菌体，涂在载玻片上，使其薄而均匀。3、晾干：让涂片在空气中。4、固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。5、染色：将固定过的涂片放报纸上，滴加结晶紫液，染1min。6、水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液，用吸干。简单染色结束可观察细胞形态。7、媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。8、脱色：吸去残留水，连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无紫色，立即水洗。9、复染：滴加蕃红复染3-5min，水洗。至此，革兰氏染色结束。
在实验中经常会出现和假阴性的结果，假阳性主要是由于脱色不完全，可能是由于涂片过厚，或者是结晶紫染色过度，导致脱色不完全。假阴性可能是因为细胞固定过度，造成细胞壁通透性的改变，而出现假；另外，细胞培养时间太长，可能已经有部分细胞发生死亡或者，也导致细胞壁通透性的改变而出现假阴性结果。
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