提质粒跑电泳条带上方区域都亮,质粒酶切后的电泳条带却条带清晰是怎么回事？质粒没提好吗？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2015-04-23 16:27 标签： 质粒双酶切电泳图
质粒PCR后电泳出现 很多条带 怎么回事啊?
1.过火温度过低,可以提高退火温度2.检查PCR体系各浓度 引物浓度不要太高 一般10UM 质粒模板量一般1-10ng 过高和过低都可能导致非特异性3.TAq酶不能加太多 一般1.25U/50ul ,特别是高活性酶,高浓度会导致大量非特异性扩增.4.引物本身设计具有较大缺陷
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标题: 双酶切后看不到目的插入片断(双酶切,条带,跑电泳,酶切)
摘要: [双酶切后看不到目的插入片断(双酶切,条带,跑电泳,酶切)] 我构建重组质粒，插入片断约130bp，做酶切验证时，从大肠杆菌(Escherichia coli)中提取的重组质粒跑电泳和单酶切后跑电泳都有条带，但双酶切后只看到切割后的质粒的条带，不见目的条带，上样量40多微升都看不到，改用在第一酶切旧书后的提示中补加缓冲液成分和第二个内切酶，结果仍然如此！请问问题出在哪里？谢谢！ 关键词:[双酶切 跑电泳 酶切 条带 重组质粒 大肠杆菌 目的条带]……
我构建重组质粒，插入片断约130bp，做酶切验证时，从大肠杆菌(Escherichia coli)中提取的重组质粒跑电泳和单酶切后跑电泳都有条带，但双酶切后只看到切割后的质粒的条带，不见目的条带，上样量40多微升都看不到，改用在第一酶切旧书后的提示中补加成分和第二个内切酶，结果仍然如此！请问问题出在哪里？谢谢！
回复我用的是Xba 1先切，再用EcoR 1切！回复其实做重组是存在目的片断没有连上去而空载体重连或者原空载体有一部分根本没切开而转化到细菌中形成克隆，等原因导致连接失败，因此建议你多挑几个克隆，可以先用菌液直接pcr的方法粗略鉴定目的片断是否存在，然后在酶切鉴定。如果超过10个克隆都是假阳性，那么就要建议你重新做连接了，重新做连接时一要保证各酶切位点要切开，二可以多加一点插入片断（空载体：插入片断＝1：3～1：5）这样可以降低假阳性的比例。如果酶是正常的，一般都可以切下来，建议用一些已知的质粒鉴定一下酶是否失效，如果不能切开已知质粒那就买新的酶吧。菌液直接pcr也就是直接用菌液当模板25微L体系加2微L提质粒浓度的菌液就可以了。回复我构建重组质粒，插入片断约130bp，做酶切验证时，从大肠杆菌(Escherichia coli)中提取的重组质粒跑电泳和单酶切后跑电泳都有条带，但双酶切后只看到切割后的质粒的条带，不见目的条带，上样量40多微升都看不到，改用在第一酶切旧书后的提示中补加成分和第二个内切酶，结果仍然如此！请问问题出在哪里？谢谢！ 觉得你的插入片段相对于载体显得太小，因此你的单酶切条带与空质粒单酶切后的大小不易区分（特别是载体长度很大时）。 建议看看你的外源片段上是否有载体上没有的酶切位点，用该酶切后就可初步判定是否成功连入，再以该重组质粒为模板，PCR鉴定进一步确认结果。回复个人感觉是否会因为片段小，跑的快，从而比较淡，导致看不到啊．我做菌液ＰＣＲ时，２０ul体系加入２ul菌液，但菌液比较淡，没有扩出目的片段．但是抽质粒，酶切却切出目的片段．是否是因为加入培养液太多抑制了ＰＣＲ反应或者菌淡模板不够呢．但个人感觉模板应该不是问题吧．同时，我阳性对照扩出目的片段．说明ＰＣＲ体系是没有问题的．回复个人感觉是否会因为片段小，跑的快，从而比较淡，导致看不到啊．我做菌液ＰＣＲ时，２０ul体系加入２ul菌液，但菌液比较淡，没有扩出目的片段．但是抽质粒，酶切却切出目的片段．是否是因为加入培养液太多抑制了ＰＣＲ反应或者菌淡模板不够呢．但个人感觉模板应该不是问题吧．同时，我阳性对照扩出目的片段．说明ＰＣＲ体系是没有问题的．不知道你的菌液PCR是怎么做的？我是用大约50ul提取质粒浓度的菌液4000rpm离心5min，再在100摄氏度煮5－10min，然后冰浴2min，再12000rpm离心5min，以3ul上清为模板。
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电话：021-问：染体与质粒问题，等待染体只存在于真核生物细胞中吗？质粒只存在于原核生物细胞中吗？答：染体只存在于真核细胞，原核细胞的染质是无法形成染体的。质粒存在于 多细胞和酵母菌等生物中，而酵母菌 核生物，细菌是原核生物，所以质粒不仅存在于...
问：大肠转化后提的质粒，跑电泳出现条带，求高人解释每条带分别...答：质粒DNA 具有三种构型：共价闭合环DNA（cccDNA,SC构型）、开环DNA（OC构型）和线性 （L构型）。在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。在琼脂糖凝胶...
问：震荡能使质粒破坏吗震荡能使质粒破坏吗答：一般机械振动是很难破坏质粒的。在离心机中一万两千转的速度都不能破坏质粒。一般的超声波清洗机也做不到。要用专门的超声波细胞破碎仪才可以将DNA打碎。如果你...
问：质粒DNA经电泳后图上为什么只有两条带答：如果是刚抽出来的质粒，好的只有一条带：超螺旋条带如果提取裂解步骤过于剧烈，则会出现两条带：超螺旋和开环质粒有时候会出现三条带：超螺旋、开环质粒和...
问：关于质粒的几个问题()细胞器是细胞质中具有一构和功能的微结构,而质粒是环状DNA ,毫无疑问...答：质粒不算是细胞器,却可以看作游离的库,它不算是细胞器,是因为它的程度还远不及病 或活性DNA片段,它没有自己的酶系统,而且也没有更 的蛋白质保护结构...
问：T载体质粒电泳条带 pMD-T载体和目标cDNA片段链接后应该是形成的环状质粒，对其电泳的话条带应...答：差不多，但你最好做一个原始环状质粒（bp那个）的对照确认一下吧。
问：将目的基因与载体结合,最常用的载体是动物病 .为什么不是质粒...将目的基因与载体结合,最常用的载体是动物病 。为什么不是质粒？答：这要看是动物基因工程还是植物基因工程。动物将目的基因与载体结合,最常用的载体是动物病 。而植物则是质粒。
问：质粒电泳问题我双酶切，一条得带，一条的带，但是中间多出一条的，一开始这个的...答：原始质粒没有bp条带，建议下质粒酶切位点，看是否误切；酶切的过程也要注意，时间不能太长，度也要适宜（酶的说明书），否则会产生非特异性酶切；...
问：什么是质粒？什么是质粒？跟细胞质有什么？答：质粒是存在于某些单细胞生物细胞中的一种环状DNA ，常用作基因工程中的运载体，可以将目的基因整合到质粒上然后导入受体细胞，经常可以从细菌细胞中提取，也...
问：大肠杆菌的质粒电泳图有那几条带？答：大肠杆菌的质粒电泳图有那几条带？一种质粒的话，提的好的只有一条超螺旋带，从电泳图上看比质粒大小要小。
问：提取质粒后pcr验证浓度很大，双酶切验证时却总也没有结果。是...基因连接了表达载体后，提质粒pcr验证结果很好，但双酶切验证却总是没有结果。这...答：你一下你的两个酶是不是同尾酶，如果是的话，可以从中间选择一个酶切位点检验！
问：质粒电泳大小。我的一个质粒bp，跑出来也是条带，但是最前面的最亮的显示是-bp，...答：最好还是做个酶切看看，你这个很可能是超螺旋，胶的浓度，电压，跑的时间不同结果都会不一样的，毕竟超螺旋和Marker里的线性条带性质不同
问：请问：质粒与DNA是同一种物质吗(既人们所说的遗传基因) ...请问：请问：质粒与DNA是同一种物质吗(既人们所说的遗传基因) ...质粒与DNA是同一种物质吗（既人们所说的遗传基因）？质粒可以相互移植吗...答：质粒（英语：Plasmid）是细胞染体或核 DNA外能够自主的很小的环状DNA ，它存在于 多细菌以及酵母菌等生物中，有些质粒含有某种抗基因（如大肠杆菌...
问：求教高手！质粒DNA的提取：电泳图。帮我分析一下。我组是最亮...答：应该正常质粒提取会出现-条带，都是质粒的，只是构象不同：超螺旋、线性、开环只是你这个marker看不清，不知道大小是否正确。线性的（中间条带）跟marker...
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【求助】为什么转化酶切后出现四条带啊？
-------------------------------------------------------------------------------- 最近我把我的目的基因转入大肠杆菌中提取质粒后用Hind111和ECOR1双酶切后发现竟然出现了四条带的。做了几次都一样，我切一个小时也会出现这样的结果的。我用软件比对过，我的目的基因中绝对不可能含有该酶的酶切位点的。载体是PET32-A-C。我用这质粒做pcr都可以扩出我的目的条带的。我准备拿去测序核对的。但是各位前辈，像我这样一般是什么原因的啊？星号活性？换别的公司得酶试试有没有注意到这四条带分别有多大，有两条带肯定是你的载体和目的片断，其余两条是什么就不清楚。也有可能是污染，或者是质粒提取出现问题，你的质粒有没有问题，纯度如何？切的其它两条带都要比目的条带要大的，纯度还可以啊，难道不纯就会这样的吗？跑电泳没看到有多的带的啊我的意思是，提取过程中有没有基因组DNA的污染。如果像你说的都比目的基因大，那么可能是基因组DNA的断裂现象或者是被酶切后产生的小片断。出现以上 的情况 .有以下的原因:1.混有其他的质粒或DNA的污染,建议你注意无菌操作2.内切酶有 问题,换一换3.你的胶,是否是新的.我觉得你很有必要在跑电泳时，加上质粒对照，很有可能是酶切不完全造成的，看一下其他两条带是不是和质粒对照一样大。造成酶切不完全的原因很多：1 质粒提取过程中混进了氯仿，影响了酶切效果
2 酶切的缓冲体系是否正确
还有以上战友所说的各种原因。
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