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Q:1. 适配子DNA环状dna是单链还是双链鈳以用带有互补链的磁珠进行pull down吗?如果可以效率怎么样?一般需要怎么优化条件
A:理论上说,若DNA环状dna是单链还是双链能够与磁珠上的互補链杂交成功,是可以进行pull down实验的; 效率如何不好确定,这个取决于两条DNA环状dna是单链还是双链是否能杂交成功、蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。
A:针对目标区域设计特异性DNA探针并进行生物素标记生物素探针可与偶联在磁珠上的链霉亲和素结合;细胞蛋白提取物与磁珠-DNA探针孵育,从而钓取与DNA探针有特异性结合的互作蛋白质
Q3: 你们对外服务的检测项目有哪些?
A:细胞、动物/植物组织、菌体都可以做DNA pull down, 我们还可以做嘚检测实验具体如下:
(6) 转录组及蛋白质组:真核有参转录组、无参转录组、真核lncRNA、small RNA等
A:效率主要取决于蛋白-DNA结合的强弱、蛋白的丰度等。
Q5:老师对照组的DNA序列是怎么选择的?
A:一般对照组是没有探针的,对照组是磁珠beads+蛋白
A:DNA pull down-MS是体外研究蛋白-DNA是否有直接互作的经典技术,是將探针结合在凝胶/磁珠上钓取与DNA探针有互作的蛋白;就技术而言,没有明显的缺陷;后续质谱能鉴定到多少蛋白取决于蛋白-DNA结合的强弱、蛋皛的丰度等。
A:常规的是用DNA双链作为探针
Q8: 可以简单讲一下生物素标记引物的原理吗?
A:主要利用生物素(biotin)和亲和素(avidin)这两种分子嘚独特性质; 亲和素的每个亚基都能结合一个生物素分子,两者的结合是通过生物素的脲基环部分完成的;因此可将其戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连构成生物素标记的核酸探针。
Q9: 如果做转录因子转录因子和DNA结合发起转录,不应是和打开的环状dna是单链还是双链结合吗?
A:啟动子是位于转录起始位点(结构基因)5'端上游的DNA序列就像"开关",决定基因的活动本身并不控制基因活动,而是通过与特定蛋白质(轉录因子)结合而控制基因的活动转录因子就像一面"旗子",指挥着酶(enzymes)(RNA聚合酶polymerases) 的活动这种酶制造着基因的RNA复制本。转录因子是与启动子DNA雙链结合的
Q10:做100bp突变对照组应该怎么突变碱基?
A:可以通过查找相关资料确定启动子发挥功能的核心区域,将核心区域进行突变;一般是A/G互換,C/T互换突变
Q11: DNA互补链可以相互钓取吗?
Q12:请问DNA为什么会与蛋白质互作呢它们有什么功能的联系吗?
A:DNA pulldown 是研究蛋白-DNA的互作, 主要应用于寻找已知的启动子序列所结合的未知蛋白(转录因子);启动子是位于转录起始位点(结构基因)5'端上游的DNA序列就像"开关",决定基因的活動本身并不控制基因活动,而是通过与特定蛋白质(转录因子)结合而控制基因的活动
Q13: 如果做小肽对细菌的作用是否也可以DNA pull down?
Q14:未加探针的对照组鉴定出蛋白是什么原因呢
A:对照组是磁珠beads+蛋白,虽然没有探针但少量蛋白可以与磁珠相结合,对照组鉴定到的蛋白是非特异性的背景蛋白