生物通报道& 疾病往往是由于对生理和病理应激作出的异常或不适当的反应所致。在过去的10年里，大量的研究揭示了哪些microRNAs (miRNAs)参与调控了这些情况下的细胞行为。在3月16日的《细胞》（Cell）杂志上，来自德克萨斯大学西南医学中心的Joshua T. Mendell和 Eric N. Olson发表了题为“MicroRNAs in Stress Signaling and Human Disease”的文章，综述了miRNA调控应激信号的新兴原理，并运用这些概念理解了miRNA在疾病中的作用。
miRNA的生物合成与功能
编码大部分哺乳动物miRNA的基因都是通过RNA聚合酶II转录，这些基因长度有可能达数万个碱基，被多次剪接。大约有三分之一的已知miRNAs嵌入在蛋白编码基因的内含子中，与宿主基因共转录，从而协同调控miRNA和蛋白的表达。在某些情况下，内含子miRNAs与基因编码蛋白一起参与调控生物过程。例如miR-33家族成员可与其嵌入的固醇调节元件结合蛋白（SREBP）基因协同作用减少胆固醇流出，促进胆固醇合成。
miRNA初级转录物首先释放出6080个核苷酸的发夹结构，随后借助RNase III家族内切核糖核酸酶Drosha和Dicer的进一步加工生成长度为2122个核苷酸的成熟miRNAs。完全加工的miRNAs与RNA诱导沉默复合物（RISC）中的Argonaute (Ago)家族蛋白偶联，成为它们的特异性决定子。miRNAs引导Ago蛋白借助互补位点靶向mRNAs。miRNAs 5’端的短种子序列（28个核苷酸）起着非常关键的作用，在某些情况丰富的种子序列成为优选靶区。当借助于相互作用靶向mRNAs时，Ago蛋白发挥活性导致mRNA翻转（turnover），抑制靶向转录物的翻译。
当前有大量不同的运算方法用于生物信息学预测miRNA的靶点，通常每种miRNA都预测有数以百计的靶点。这些高度复杂的靶向网络对解析miRNA介导的表型机制提出了重大的挑战。当前普遍的模型均假定miRNAs的功能是微调其大量靶基因的表达。尽管每个靶基因仅受到微妙调控（通常由于miRNA功能获得或缺失导致的单个靶蛋白的丰度改变不会超过2倍），然而大量转录物的协同调控所产生的叠加作用却能够导致强大的表型效应。不幸的是，这种假设几乎还不可能直接检测，因为同时将大量靶mRNA恢复到体内miRNA功能获得或丧失背景下的自然水平从逻辑上讲是难于实现的。因此，所有来自这些类型靶mRNA的分析结果都将是相互关联的。
另一方面，一些miRNA介导的功能也有可能受到了一种或一些靶mRNA的强有力调控作用的驱动。例如线虫中的miRNA lin-4下调蛋白编码基因lin-14表达，只发生于幼虫发育的适当时间。然而，这种线性miRNA 调控信号通路在哺乳动物中却极少得到证实。
证实单个靶mRNA或多个靶mRNA的单倍型剂量不足（haploinsufficiency）可逆转miRNA缺失表型，提供了最强有力的证据表明了体内特异性miRNA与靶mRNA相互作用的重要性。例如miR-146a靶目标Stat1的单倍型剂量不足可以逆转miR-146a敲除小鼠的自身免疫症状。然而目前这类的论文结果还是比较稀缺。将特异的靶mRNA与miRNA介导的表型连接起来仍是一个相当大的挑战，还需要开辟出新方法来揭示体内miRNA介导的功能机制。
（生物通：何嫱）
生物通推荐原文摘要：
MicroRNAs in Stress Signaling and Human Disease
Disease is often the result of an aberrant or inadequate response to physiologic and pathophysiologic stress. Studies over the last 10 years have uncovered a recurring paradigm in which microRNAs (miRNAs) regulate cellular behavior under these conditions, suggesting an especially significant role for these small RNAs in pathologic settings. Here, we review emerging principles of miRNA regulation of stress signaling pathways and apply these concepts to our understanding of the roles of miRNAs in disease. These discussions further highlight the unique challenges and opportunities associated with the mechanistic dissection of miRNA functions and the development of miRNA-based therapeutics.
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a、实验概述：
构建包含miRNA靶位点的luciferase报告基因，与miRNA mimics共转到细胞当中，通过荧光素酶活性检测，即可分析出miRNA对潜在靶基因的调控作用，可用于miRNA调控潜在靶基因的验证。既可以小规模实验，也可高通量筛选。原理图：图 1-1
b、步骤流程：
1.预测miRNA的靶基因及靶位点
协助客户利用Targetscan，Pictar，miRNA.org，RNA22等常用软件预测miRNA的binding位点。
2.miRNA靶点鉴定
i、目的片段获得：目的片段长度
费用（RMB）
小于500bp（含）PCR法1-2周400大于500bp全基因合成2-3周2.2/bp
ii、Luciferase报告基因构建：
将目的片段组装到报告基因载体，1周，800/个。
iii、miRNA表达载体构建：
2周，可以扩增用于其他实验，800/个。
推荐：miRNA mimics合成：1-2周，2 OD，赠送阴性对照，400/个。（二选一）
iv、Luciferase实验：
每个靶点都要做一个对照；每个样品包含内参和三组重复，根据样品数而定周期，400*2/个靶点。成功实例：图 1-2二、Luciferase突变实验鉴定miRNA靶点
a、实验概述：
对于前面有效果的miRNA靶基因，将miRNA的binding位点，尤其是seed区突变掉，造成miRNA无法结合，检测luciferase信号是否恢复。原理图：（如图1-1）
b、步骤及流程
1.Luciferase报告基因构建：PCR法，每段突变20个碱基之内，1-2周
2.Luciferase实验：每个样品包含内参和三组重复，根据样品数而定周期。成功实例：图 1-3三、mRNA水平鉴定miRNA靶点
a、实验目的：由于miRNA作用机制有两个方面，降低mRNA的表达水平和抑制mRNA的翻译水平，所以检测靶点基因的mRNA水平变化将作为一个参考数据，用于分析miRNA作用靶点基因的机制。
b、实验概述：对于前面有效果的miRNA靶基因，检测mRNA水平是否被miRNA下调。
c、具体内容：将miRNA mimics和阴性参照转染到细胞中，48-72小时候，提取RNA，荧光定量PCR检测靶点基因的mRNA水平。900/个靶点+900/对照，2个靶点起订。四、Western Blot实验鉴定miRNA靶点
a、实验目的：由于miRNA作用机制有两个方面，降低mRNA的表达水平和抑制mRNA的翻译水平，所以检测靶点基因的蛋白水平变化将作为一个参考数据，能全面反映靶点基因的蛋白表达水平的变化，结合mRNA表达水平变化，有助于分析miRNA作用靶点基因的机制。
b、实验概述：对于前面有效果的miRNA靶基因，检测蛋白水平是否被miRNA下调。Western Blot实验：每个样品包含内参，客户提供一抗。
c、具体内容： 将miRNA mimics和阴性参照转染到细胞中，48-72小时后，裂解细胞进行Western Blot检测靶点蛋白的水平变化。800/个靶点+800/对照，2个靶点起订。成功实例：图 1-4 五、使用靶基因的siRNA验证靶点实验概述：
miRNA过表达会引起细胞表型的变化，例如迁移、增殖、凋亡，以及靶基因下游基因表达量变化等等。为了证明miRNA是通过负调控靶基因而引起的这些变化，可以使用靶基因的siRNA，检测是否会引起同样的变化。详见基因沉默服务内容。六、使用miRNA的抑制剂（Antagomir）验证靶点
原理：miRNA antagomir是经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂，通过与体内的成熟miRNA强竞争性结合，阻止miRNA与其靶基因mRNA的互补配对，抑制miRNA发挥作用。
优势：与普通抑制剂相比，miRNA antagomir在动物体内外具有更高的稳定性和抑制效果，且能克服体内细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞。（Antagomir的合成：单链的特殊修饰的RNA，2 OD）
实验概述：对于内源有表达的miRNA，可以使用Antagomir，检测靶蛋白表达量是否恢复，检测是否会引起过表达miRNA相反的变化。对于内源没有表达的miRNA，可以先构建miRNA稳定表达细胞系，再进行上述实验。细胞系构建详参慢病毒稳转表达细胞系构建。七、通过rescue靶蛋白检测功能来验证靶点
实验概述：对于内源有表达的miRNA，可以构建cDNA表达质粒，过表达靶蛋白，检测是否会有rescue miRNA的抑制效果。对于内源没有表达的miRNA，可以构建miRNA稳定表达细胞系，再进行上述实验。细胞系构建详参慢病毒稳转表达细胞系构建。八、miRNA靶基因信号通路总结概述：利用prePPI,KEGG等生物信息学软件，总结性分析miRNA调控靶基因及下游信号通路。成功实例：图 1-5情景二：已知现象，未知miRNA，发现您感兴趣的miRNA内容：利用高通量筛选手段，针对您感兴趣的现象或者细胞行为，筛选出与此相关的miRNA。详情见高通量筛选服务内容。情景三：已知基因，鉴定调控它的miRNA内容：构建包含目的基因3’UTR的luciferase报告基因，与候选miRNA mimics共转到细胞当中，通过荧光素酶活性检测，即可分析出miRNA对目的基因的调控作用，既可以小规模实验，也可高通量筛选。
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地址：北京市海淀区上地开拓路5号中关村生物医药园B302&& 电话：010--& &邮箱：Order@&&miRNA-126~*靶基因预测及其相关信号通路的生物信息学分析--《中国当代儿科杂志》2013年03期
miRNA-126~*靶基因预测及其相关信号通路的生物信息学分析
【摘要】：目的通过对miRNA-126*进行靶基因预测及信号通路生物信息学分析,以期为miRNA-126*靶基因相关实验及其调控肺发育机制的深入研究奠定基础。方法首先利用microRNA(miRNA)芯片技术分别检测胎龄16 d、19 d和21 d胎鼠肺组织中miRNA-126*的表达水平,进而应用miRGen2.0数据库通过生物信息学方法预测其可能的靶基因,然后对其靶基因集合应用Cytoscape及其插件BiNGO进行功能富集分析(GO-analysis),最后应用DAVID数据库进行靶基因信号转导通路富集分析(KEGG Pathway analysis)。结果 miRNA-126*表达量在胎龄16 d、19 d和21 d 3组胎肺组织间逐渐上升。miRNA-126*预测靶基因共有422个,其靶基因集合功能富集于葡萄糖醛酸转移酶、糖代谢等分子功能,多细胞器官发育、发育进程等生物学过程及细胞分隔、细胞器界膜等细胞组分上。信号转导通路则显著富集于RNA降解信号通路,以及朊蛋白疾病信号通路中。结论本研究结果提示miRNA-126*参与了大鼠胎肺发育过程,为今后研究肺发育提供理论基础。
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R346【正文快照】：
miRNA是近年来发现的一类重要的调控分子,引起了广泛关注。miRNA可与特定的靶向mRNA结合,形成紧密或不甚紧密的互补结构,导致mRNA的降解以及蛋白翻译表达的阻滞[1],在转录后水平发挥着举足轻重的调控作用。研究表明miRNA广泛参与包括细胞增殖、分化、凋亡等在内的多种生理过程
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