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基因与基因组分子生物学：是研究核酸、蛋白质等生物大分子的功能、形态结构特征及其重要性和规律性的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。（广义的分子生物学）染色质和染色体形态,结构和组成（同一物质，两种形态）染色质：形态：a常~松散解旋的纤维丝，可复制转录.b异~高度卷曲紧缩的框状结构，不可复制转录。染色体结构：一级：核小体；二，螺线体；三，超螺线体；四，染色体。染色体的功能元件：自主复制序列（DNA复制起点）、着丝粒序列（形成着丝粒，使细胞分裂中染色体能准确的分离）、端粒序列（维持染色体的完整性反映细胞的分裂能力）。核小体 nuclesome：构成染色质的基本结构和功能亚单位。200bp DNA + 组蛋白八聚体 + 组蛋白H1 端粒：天然的真核染色体末端结构与内部不同，有某种结构将染色体末端封住，使之不能与其他断裂片段相连接，这种结构称为端粒，含重复序列TTTGGG, 在端粒酶的作用下形成.端粒酶：在结构上是一种核糖核蛋白复合体，由RNA 和蛋白质组成一种自身携带模板的反转录酶，以含端粒DNA重复序列拷贝的RNA作模板，合成端粒DNA片段 。生物学意义：1.合成端粒，保证染色体复制的完整性2.保护DNA末段降解及相互融合染色体化学组成：DNA、组蛋白、非组蛋白、少量RNA。组蛋白修饰的影响：1、影响螺线体的形成。2、为修饰染色质的酶提供结合位点基因：编码蛋白质或RNA等具有特定功能产物的遗传信息的基本单位，是染色体或基因组的一段DNA序列(或RNA序列)。包括编码序列(外显子)、编码区前后对于基因表达具有调控功能的序列和单个编码序列间的间隔序列(内含子)。编码蛋白质的基因：结构基因、调节基因编码RNA的基因:mRNA、tRNA、rRNA.遗传元件：启动子、增强子等.重叠基因（everlapping gene）：指两个或两个以上的结构基因共同一段DNA顺序的现象。重叠方式：同相位、异相位、反向基因重叠。顺反子：在反式结构中不能互补的各个突变位点在染色体上所占的一个区域就叫一个~。等位基因：染色体同一基因座上同一基因的不同突变型。复等位基因：某个基因座上不同等位基因的总数超过一对，被称为~如人血型基因。野生型基因：在自然群体中往往有一种占多数的（被视为正常）等位基因称为~。断裂基因：基因的编码序序列由若干非编码区域（间隔序列）隔开，使阅读框不连续，这种基因称为断裂基因。外显子:基因的编码序列，即DNA分子中编码mRNA某一部分序列的区域。 内含子:位于编码序列之间，能被转录成前体转录物却不能成为mRNA组成成分的序列，即被切除的部分。 基因家族：真核细胞的基因组中有许多来源相同、结构相似、功能相关的基因，这样一组基因为~。 超基因家族：有些特殊的基因家族，各成员之间没有相同的功能，核苷酸序列的同源性程度也不高，但他们编码的蛋白质亚结构域却是彼此相关的，称为~如免疫球蛋白超基因家族。假基因：基因家族中不能产生有功能基因产物的基因。重复序列：真核生物除了一些基因家族中的重复基因（能称为基因）外，还有大量的重复序列或重复DNA，按照在基因组中出现的频率，可分为：低度重复序列、中度重复序列、高度重复序列。基因组（genome）：细胞或生物体中，一套完整的单倍体遗传物质的总和称为基因组。大部分原核生物的染色体即构成该生物的基因组。人类基因组包含：核基因组+线粒体基因组人类基因组计划研究内容测定的是人体23对染色体中的所有DNA的序列，它由31.647亿个碱基对组成，共有3万至3.5万个基因。1.构建基因组的遗传图谱②构建基因组的物理图谱③测定基因组DNA的全部序列④绘制基因组的转录本图谱⑤分析基因组的功能分子标记：RFLP限制性片段长度多态性：限制性内切酶能识别和切割特异核苷酸序列,由于DNA某一位点上的变异有可能引起该位点特异性的酶切位点的改变，当用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA时，致使酶切片段长度发生变化，个体间出现限制性片段长度的差异。MS（微卫星）：重复单位6-9bp常见为（AC）n和（TG）n。重复次数10-60词，总长度小于150bp，有高度多态性的DNA。高度多态性、DNA指纹鉴定。大卫星DNA：25~48bp。小卫星DNA：15~70bp短散在核元件：SINs，150~300bp，拷贝数105以上，Alu、KpnI等基因家族长散在核元件：LINs，bp，拷贝数104左右，含有编码rRNA、tRNA、组蛋白及免疫球蛋白基因。SNP（单核苷酸多态性）：同一物种不同个体基因组DNA的等位序列上单个核苷酸存在差异的现象。比较的是DNA相同序列长度里的单个碱基的差别。亨廷顿舞蹈症( HD)是一种继发性神经系统紊乱疾病。这种病在发病初期是一些无意识的手脚不灵活和轻微的抽搐。随着时间的迁移，这些症状加剧并伴随情绪上的不稳定。核酸的变性：指核酸双螺旋氢键的断裂，变成单键并不涉及共价键的断裂。Tm：将DNA双螺旋失去一半时的温度称为该DNA的~。核酸的复性：变性DNA在适当的条件下又可使两条彼此分开的链自发重新缔合成为双螺旋结构的过程称为核酸的复性。核酸的杂交：序列互补的单链RNA和DNA/DNADNA/RNARNA根据碱基互补借助氢键相连而形成双链杂交分子的过程。 杂交分子：两条链来源不同的已复性的DNA分子。反义核酸：根据碱基互补的原理,利用人工合成或细胞中天然存在的DNA或RNA片段(或其化学修饰的衍生物)与目的靶序列核酸结合，通过空间位阻作用或诱导RNAase活性的降解作用，在复制、转录、剪接、mRNA转运及翻译等水平上，抑制或封闭目的靶基因的表达。RNA干扰：正义链和反义链RNA组成的长约21C25bp的双链RNA可有效抑制靶基因的表达的现象。小干扰RNA：一条短小的单链RNA与一条mRNA的互补区发生碱基配对作用，从而阻遏这条mRNA的表达，具有这种作用的短小单链RNA称为小干扰RNA。MicroRNA：是一种大小约21―25个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。核酸的分子杂交的原理：核酸的变性与复性。小RNA的在药物研究中的应用 靶实验→siRNA→RNAi药物ep.老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症。 原核、真核基因组特点原核：基因组较小；几乎无蛋白质与核酸结合；有操纵子结构；有单、多拷贝两种形式；有重叠基因；多顺反子。真核：基因组较大；和蛋白质结合形成染色体且是多条；有重复序列；以单、多拷贝两种形式存在；基因不连续；基因家族化-最显著特征之一；DNA片段可以重排；单顺反子。DNA的结构与功能：一级结构：DNA的基本组成单位，物种差异根本原因；二：双螺旋模型，两条脱氧核苷酸链以反向平行，碱基堆积力氢键离子键，活性B&A&&Z；三：超螺旋、三链DNA①第三股碱基可与Watson-Crick碱基对中的嘌呤碱形成Hoogsteen配对②和寡嘌呤核苷酸间同向平行③可来自分子内或分子间、拓扑异构酶Ⅰ一条链产生切口使松弛无需ATP/Ⅱ两条链使超螺旋化需ATP。功能：生物遗传信息的携带者，遗传变异的物质基础，与生物信息传递及蛋白质的生物合成密切相关。 RNA的结构与功能：一级：AUGC；二：茎-环结构；三：单链、环状结构、双螺旋相互作用。功能：遗传物质；转录；转运；识别；催化。①mRNA转录Pr翻译的模板②tRNA转运Aa识别③rRNA构成核糖体Pr合成场所（5、16、23s/5、5.8、18、28s）④sRNA（snRNA参与hnRNA剪切、转运；U-snRNA；gRNA对mRNA前体分子的编辑起指导作用）⑤对基因表达和细胞功能有调节作用miRNA、siRNA⑥催化活性-酶⑦携带遗传信息-RNAV。
DNA复制、损伤、修复一、DNA复制的一般特征：1）半保留复制：DNA的复制是将两条亲本链分开,每一条作为合成新链的模板,按碱基配对的规则合成新链,子代DNA的双链中一条是原来的链,另一条是新合成的链。按半保留复制的方式，子代保留了亲代DNA 的全部遗传信息。2）双向复制：分为对称（大部分原核与真核）与不对称（枯草杆菌）单向复制：质粒3）半不连续复制：在DNA的复制过程中，顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为先导链。另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。复制中的不连续片段称为槠(okazaki fragment)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。
复制起始点（ori或O）：DNA复制要从DNA分子的特定区域开始，这个特殊区域是基因组的一段特殊的碱基序列，称复制起始点。原核：一个起始点，约245bp,特殊的重复序列。真核：多个起始点。复制子是DNA分子复制时，在复制的局部DNA双链间的氢键被解开，形成复制单位。对于细菌和病毒这些小的染色体，一个DNA分子就是一个复制子，真核生物有多个复制子。包括：一个复制起始点和两个起始点之间的DNA片段，某些生物还存在复制终止点。复制叉:DNA复制从起始区起动的时候，起始区的DNA双链因发生解链而形成叉状结构或称Y型结构，这种结构称为：移动方向3’到5’方向。二、原核生物DNA的复制（一）
复制的起始 ：当DnaA结合到其中一个DnaA盒后，促使DnaA-ATP复合物结合到6bp的核苷酸序列上，使该区域的双螺旋解旋，DnaA-ATP能稳定单链DNA。随后，约30个DnaA蛋白形成复合物并结合到9bp的重复序列上，该复合物解开原点中含13bp重复序列的区域形成一个45bp的开放复合物。DnaB和DnaC复合物结合到该区域形成引发前复合物，在SSB和Dna螺旋酶存在下，DnaB螺旋酶进一步使DNA解旋，形成复制叉。由于引物酶与DnaB螺旋酶紧密结合在一起，所以引物酶被定位到解开的单链DNA上，合成引物。（二）
复制的延伸 ：复制叉移动方向3’到5’方向，DNA聚合酶合成方向5’到3’’,先导链：首先由引物酶在复制原点合成一段RNA(引物)，10~60个核苷酸，由DNA聚合酶Ⅲ在引物的3’端加上脱氧核苷酸.后随链:形成多个引物,合成冈崎片段,冈崎片段合成完毕,RNA 引物被除去,由DNA聚合酶Ⅰ延伸填补去除引物的空缺,由DNA连接酶封闭缺口,完成DNA子链的复制..（三）
复制的终止:1.制叉移动到复制终点,复制终止.原核生物DNA为环状，双向复制的汇合点就是复制终止点.是一段20bp的核苷酸序列，该序列结合Tus蛋白，形成Tus-Ter复合物阻止复制叉前进。2.先导链上的RNA引物被RNA酶水解后，由DNA pol I 催化，由新合成链提供-OH补齐真核：以3‘端DNA为引物，端粒酶自带RNA模板，进行结合、聚合、延伸、移位。端粒5’-TTGGGG?/3’-AACCCC?完成染色体末端复制。真核细胞DNA复制不同：1.含有多个复制原点，复制叉，该区域称为自主复制序列(ARS)。该区域含有兼并11bp序列，称为原点复制原件（ORE）。2.DNA-pol δ，DNA-pol （α作用下）3.真核染色体为线性，其末端具有端粒结构。4.染色体复制涉及核小体结构，DNA复制后需要和组蛋白组合成染色体。 线粒体DNA (mitochondrial DNA，mtDNA)的复制形式――D环复制。线粒体DNA( mtDNA)的特点：一条链含有mtDNA中大部分鸟嘌`(G)为重链。一条链含有mtDNA中大部分的胞嘧啶称为轻链。单链环状DNA的复制：第一阶段：形成闭合的环状复制型I(RFI).第二阶段:通过滚环复制产生子代复制型DNA(RF-DNA)逆转录：RNA指导下的DNA合成作用，以RNA为模板在逆转录酶催化下，由dNTP聚合成DNA的作用，新生DNA分子存有RNA基因组的信息.逆转录酶:又称为反转录酶，为依赖RNA的DNA聚合酶.逆转录酶是多功能酶，有三种酶活性1. 逆转录活性：即以RNA为模板合成DNA2. RNase活性：水解RNA:DNA中的RNA. 3. DNA pol活性：以DNA为模板合成DNA特点：无外切酶活性，转录错误率高2×10-4.解旋酶(helicase)作用：断裂互补碱基间的氢键，使DNA成单链单链DNA结合蛋白(SSB):作用:选择性的结合并覆盖在单链DNA上，防止单链DNA重新形成双链,防止单链DNA被核酸酶水解。每个可覆盖32nt。原核生物有协同作用，真核没有。DNA聚合酶:即依赖于DNA的DNA聚合酶（DDDP）。原核生物有3种： DNA-polⅠ、 Ⅱ（复制中不起作用）、Ⅲ。DNA-polⅠ一条单一肽链至少具有三种不同的酶活性:5′?3′聚合作用5′?3′外切酶3′?5′外切酶活性.它含有大小两个片段，Klenow含有两个结构域，其中小结构域具有3′→5′外切酶活性，能辨认错配的碱基对，并将其水解，校正新合成的DNA链，保证复制的正确性。大结构域具有5′→3′聚合酶活性，小片段只有5′→3′外切酶活性，能切除突变的 DNA片段，DNA链缺口平移或链置换。主要在DNA修复中起作用。DNA聚合酶III：原核生物DNA链复制延长中真正起催化作用的寡聚酶。由10种亚基组成的不对称异源二聚体。α亚基有DNA酶聚合活性，ε3-5外切酶活性。θ、α、ε三合一活性最大。真核生物有多种： DNA-pol ?、?、?、?、??.已至少发现5种：DNA-pol α,β,γ,δ,εDNA-pol α：起始引发，有引物酶活性，合成后随链。DNA-pol β：参与低保真度的复制，DNA修复。 DNA-pol γ：在线粒体DNA复制中起催化作用。DNA-pol δ：主要的催化酶，合成先导链。DNA-pol ε：校读、修复和填补缺口作用。Topo酶：切割DNA链，使打结、缠绕、正超螺旋的DNA松驰，然后再连接。拓扑异构酶（topoisomerase I、II）：DNA解旋酶，一次作用产生两个负超螺旋。负超螺旋有利于形成复制叉。引物酶(Primase)它是一种特殊的RNA聚合酶，复制起始时，结合到3’-5’模板链的复制起始点，催化合成与3’端互补的一段RNA引物，DNA合成需在RNA引物的基础上进行。DNA连接酶(DNA ligase)：催化DNA双链的3’羟基和相邻的5’磷酸基团形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。基因突变：突变（mutation）是指DNA发生可遗传的永久性的改变。自发突变：自然发生的突变。诱发突变：理化因素引起的突变。突变发生在染色体水平或基因水平。突变类型：1. 碱基置换突变：（一）点突变： (point mutation)
DNA分子上的碱基替代称点突变。转换：同型突变。颠换：异型突变。（二）移码突变。碱基缺失或碱基插入。2. 根据对遗传信息的改变情况分类1. 同义突变：指没有改变产物氨基酸序列的密码子变化。
AAA，AAG-----赖氨酸2. 错义突变：指碱基序列的改变引起了表达产物氨基酸序列的改变。3. 无义突变：指某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子变成终止密码子。3.根据突变表现型对环境的敏感性分类：非条件性突变，条件性突变：根据研究目的选择一定的突变，但是能正常生长或近乎生长。最常用的条件是温度。4.突变效应背离或回到野生型：正向、回复5 .影响基因调控序列.启动子上升突变或下降突变。突变原因：自发突变（1） DNA复制错误:复制过程中，A与C配对，这样在复制后该位点产生A-T和G-C两种配对模式，产生突变。聚合酶漏校的结果，出现的频率较低。碱基配对的错误频率约为10-4-10-5；（2） 碱基互变异构体（3） 自发的化学变化：脱嘌呤；脱氨基（4） 氧化作用损伤碱基:细胞呼吸的副产物O2、H2O2等会造成DNA损伤，能产生胸腺嘧啶乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物，引起DNA单链断裂等损伤.诱发突变1.物理因素：紫外线(常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。)、各种辐射（电离辐射引起的DNA损伤，直接效应是DNA直接吸收射线能量而遭损伤，间接效应是指DNA周围其他分子(主要是水分子)吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而损伤DNA。电离辐射可导致DNA分子的多种变化a.碱基变化，主要是由OH-自由基引起，包括DNA链上的碱基氧化修饰、过氧化物的形成、碱基环的破坏和脱落等。b.脱氧核糖变化，脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH-反应，导致脱氧核糖分解，引起DNA链断裂。 c.DNA链断裂，射线的直接和间接作用都可能使脱氧核糖破坏或磷酸二酯键断开。）
1复制修复：校正DNA复制过程中产生的碱基错误连接：尿嘧啶糖基酶系统（尿嘧啶的来源：dUTP的渗入和胞嘧啶的自发脱氨氧化）、错配修复、无嘌呤修复。2损伤修复：光复活、甲基转移酶、切除修复。3复制后修复―保留损伤：大肠杆菌的重组修复系统（先复制再修复同源重组不影响DNA复制）、SOS修复（RecA基因为重组Pr基因应急是启动Pr水解酶活性水解阻遏Pr-lexA，使din基因高效表达从而启动~）。 错配修复（校正活性所漏校的碱基使复制的保真性提高102～103倍。识别新生链中非 m6A 的GATC序列，扫描新生链中错配碱基，酶切含错配碱基的新生DNA区段，错配修复系统受甲基化的引导光复活（在可见光存在的条件下，在光复活酶作用下，将UV引起嘧啶二聚体分解为单体的过程。条件：可见光(300~600nm) 蓝光、光复活酶。光复活是原核生物中的一种主要修复形式）切除修复 概念: 先在损伤的任何一端打开磷酸二酯键，然后外切掉一段寡核苷酸；留下的缺口由修复性合成来填补，再由连接酶将其连接起来。2. 特点：消除由UV引起的损伤，也能消除由电离辐射和化学诱变剂引起的其他损伤。切除的片段可由几十到上万bp，分别称短补丁修复、长补丁修复。是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。重组修复：概念: 通过对DNA的复制和同源链的重组，来完成对损伤部位的修复，又称复制后修复。2.特点: ① 修复过程伴随DNA的复制和重组；② 仅修复新合成的不完整的单链，原先的损伤单链仍然保留；③部分重组蛋白的精确性差，修复的出错率较高。3.重组修复过程：(1)复制：以损伤单链为模板复制时，越过损伤部位，对应位点留下缺口；未损伤单链复制成完整双链。(2)重组：缺口单链与完整同源单链重组，缺口转移到完整链，使损伤单链的互补链完整，损伤单链仍然保留。(3)再合成：转移后的缺口以新互补链为模板聚合补齐。SOS修复：概念：是在DNA分子受损伤的范围较大而且复制受到抑制时出现的一种应急修复作用。2. 过程①当DNA损伤较大时(如产生很多的T=T)，正常的DNA多聚酶复制到损伤位点时，其活性受到抑制； ②短暂抑制后产生一种新的DNA多聚酶，催化损伤部位DNA的复制，由于新的DNA多聚酶的修复校正功能较低，新合成的碱基错配频率较高，易引起突变。SOS系统的启动： 通过操纵子(结构基因、启动子、操纵基因、调节基因)来实现：A.SOS基因：recA基因、UvrA、UvrB、UmuC等，也称din基因 (damage inducible gene)，为操纵子的结构基因； B.lex基因：阻遏蛋白基因，正常情况下结合在操纵基因上；C.recA基因：重组蛋白基因，应急状态下启动蛋白质水解酶活性，水解阻遏蛋白，使din基因高效表达，从而启动SOS修复系统。是一种错误倾向性极强的修复机制，是进化中形成的“ 竭尽全力，治病救人” 的措施。正常状态下，SOS是关闭的。 DNA损伤修复的重要性：人类遗传性疾病已经发现4000多种，其中不少与DNA修复缺陷有关，这些DNA修复缺陷细胞表现为对辐射和致癌剂的敏感性增加。遗传性非息肉结肠癌（HNPCC）：家族成员是癌症高发群，许多成员患结肠癌、胃癌或子宫癌。着色性干皮病（xeroderma pigmentosum）：第一个被发现的DNA修复缺陷遗传病，患者皮肤和眼睛对阳光特别是UV十分敏感，暴光部位皮肤干燥脱屑、色素沉着、容易溃疡、皮肤癌发病率高，常伴有神经系统障碍，智力低下等。病人的细胞对嘧啶二聚体和烷基化的清除能力降低。碱基切除修复有关的酶：DNA糖基化酶（DNA
glycosylase):识别DNA中损伤的或错误的碱基；水解N-糖苷键去除碱基。 AP内切酶（Endonucleases） ：有3’?5’外切酶活性，切除AP位点5’端的数个核苷酸；DNA糖基化酶去除碱基后，产生一个AP位点， AP内切酶识别此位点并在AP位点的5’端产生一个切口。脱氧核糖磷酸二酯酶（dRpase）：切除AP位点的脱氧核糖磷酸，产生一个核苷酸的缺口。核苷酸切除修复：在原核生物中，与DNA切除修复有关的蛋白质包括UvrA、UvrB、UvrC，以及DNA pol Ⅰ和DNA连接酶。UvrA和UvrB主要起辨认和结合受损部位的作用；而UvrC则主要与受损片段的切除有关。 限制-修饰作用：菌体限制修饰系统中的限制性内切酶能将外来DNA切断，菌体本身的DNA可受甲基化酶的保护两者称为：。细菌借助于限制-修饰系统来区别自己DNA和外源DNA遗传重组：广义的遗传重组指任何产生新的基因组合，从而造成基因型变化的过程。包括独立分配或交换。狭义的遗传重组仅指涉及DNA分子内的断裂并重新连接而造成基因重新组合的过程，即基因交换 时间：减数分裂期。地点：细胞核，线粒体、叶绿体。条件：不同基因型遗传物质彼此能够转移。作用：保证生物遗传的多样性。遗传重组的分类：根据重组过程中涉及DNA序列和Pr因子的要求不同分为：同源重组（大片段交换，需要RecA蛋白的介入）、位点特异性重组（发生在特异位点，需蛋白的催化，涉及交错切割）、转座作用（依赖DNA交错剪切和复制，需要转座酶，解离酶）、异常重组（重组对中很少或没有序列同源性）。 同源重组：指发生在两条双链DNA的同源序列之间，涉及的是大片段同源DNA序列的交换。特征――进行同源重组的基本条件：1） 在交换区具有相同或相似的序列：涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大；2）单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号。3） 双链DNA分子之间互补碱基进行配对。4） 需要重组酶5） 异源双链区的形成:涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程；存在重组热点。双链断裂DSB：①受体双链DNA断裂：同源重组由能切开两条双链DNA的其中一条受体双链DNA的核酸内切酶启动。这个切口在核酸外切酶的作用下被扩大成间隙②单链入侵形成D环：扩大成间隙产生3F单链端，这个3F游离端攻击另一条供体双链DNA的单链同源区域，这称为单链入侵。异源双链DNA形成时产生一个D环，即供体双链中的一条链被置换，D环随着DNA修复合成而延伸，以3F端为引物产生双链DNA。最终，D环大到足以对应于受体染色单体上的整个缺口长度。当突出的单链接触到缺口的远端，互补的单链序列复性，于是缺口的两端都有异源双链DNA，而缺口本身则被单链D环补上③缺口区域修复：缺口区域双链的完整性可以被以左边的3F端作为引物的修复合成系统所修复④分支迁移：分支迁移把这种结构变为一个有着两个重组位点的分子。
同源重组的分子机制和酶学Holliday结构：同源重组中连接两个DNA双链的交换中间物含有4股DNA链，在连接处为了转换配对所形成交叉链的连接点Holliday模型①切断：两条配对DNA双链间的同源链在相应位点断裂，切开后形成的切口是游离末端可移动②交叉：两条有切口的单链分别离开原互补链并与另一双链中的互补链配对，DNA连接酶封闭切口形成新的分子间的磷酸二酯键。这样所得的一对双链分子称为联合分子，一条DNA链从自身双链交叉到两翼双链分子的位点称重组位点③分支迁移：重组位点可沿双链向DNA分子任意方向迁移，原来的碱基对被解开在形成新的碱基对，迁移即两条DNA间交叉的同源单链互置并扩展异源双链区④Holliday交叉的上/下半部经180°旋转成一去交叉结构的~中间体⑤拆分：从中间体中间切断（a切口在~中间体形成过程中一直保持完整的一对同源染色单链-互交重组b曾被切开过）再重新连接将~交叉拆成两独立DNA双链。? 同源非姐妹染色单体DNA中两个方向相同的单链，在DNA内切酶的作用下，在相同位置同时切开； ? 切开的单链交换重接，形成交联桥结构? 交联桥沿配对DNA分子“移动”。两个亲本DNA分子间造成一大段异源双链DNA（ Holliday结构） ? 交联桥旋转180度，形成Holliday异构体；? 通过两种方式之一切断DNA单链，若左右切，则形成非重组体，若上下切则形成重组体。同源重组酶：起始：RecBCD①核酸酶②解旋酶③ATP酶活性；重组蛋白：RecA①NTP酶②结合单链/双链DNA活性③促同源联会④链入侵；RuvAB具解旋酶作用,推动Holliday中间体分支迁移；RuvC 具有内切酶活性,拆分Holliday中间体。转座子：原核生物和真核生物基因组中可从一个部位转移到另一个部位的DNA序列。复合转座子：由中心区域及其两侧的IS原件构成的“臂”所组成的较大的转座子。同源重组：指发生在两条DNA的同源序列之间,涉及的是大片段同源DNA序列的交换。只要两条DNA序列相同或相近就可以在序列任一点发生同源重组。位点特异性重组：指不依赖于DNA序列的同源性,而依赖于能与某些酶相结合的特异DNA序列的重组。VDJ重排：H链可变区的D基因的任一段与J基因拼成DJ基因后再与V基因任一段相结合形成新基因的过程。双引物法PCR定点突变？将某基因克隆到载体上→人工合成一对互补的含有突变碱基的引物→在基因的上游和下游各设计一个引物，分别与突变位置处的一个引物进行PCR扩增→两个PCR产物混合→延伸后就可获得有特定位点突变的基因。原核生物转座子的分类和转座特征插入IS序列:末端含反向重复序列,识别的靶点大多5-9bp，含编码转座酶基因；复合转座子:中间为标记基因，两侧臂是两个同向重复或反向重复的IS序列；转座子A家族：长约5kb,两端长约38bp的反向重复，携带抗性基因和转座酶基因，携带编码转座酶和解离酶基因；转座噬菌体：包括Mu和D108两种噬菌体，侵入的Mu可在溶源化过程插入寄主DNA任意部位（盲目转录），造成靶点倍生，原噬菌体两侧各有一个5bp的靶点重复序列。转座子的共同特点：a都有一个保守结构b有一个或多个开放阅读框c两端有反向末端重复序列d转座后靶位点重复是正向重复e编码与转座有关的蛋白f可以在基因组中移动。VDJ重排简单机制-12/23规则RAG-1和RAG-2基因编码的产物Rag-1和Rag-2在12bp或23bp信号序列（RSSs）附近DNA处引入一单链缺口，新形成的3’-OH与互补链形成磷酸二酯键→去除两个编码序列间的间隔序列→在编码链的两个末端形成发夹结构→Artemis与DNA-PKcs结合获得切割发夹结构的核酸内切酶活性，打开发夹结构→加入或删去碱基使DNA链末端变成平端→两个编码区以精确的机制连接
转录及调控中心法则(central dogma)是指遗传信息的流向所遵循的法则。Crick提出，在DNA分子可以自我复制（replication）传给子代的基础上，遗传信息可以从DNA传递给RNA（称为转录transcription）再从RNA传递给蛋白质（称为翻译translation），这是遗产信息流所遵循的中心法则。RNA也可以是遗传信息的携带者，即DNA以RNA为模板反向转录合成，再推动RNA的合成及蛋白质的合成。模板链(template strand)及反意义链(antisense strand):指导RNA合成的DNA链为模板链，又称。编码链(coding strand)及有意义链(sense strand)：不作为转录的另一条DNA链为编码链，又称。 转录：以DNA为模板，按碱基配对原则，在RNA聚合酶催化下经起始、延长、终止等步骤沿5’-3’方向合成互补的单链RNA分子的过程。启动子：指RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一段具有高度保守性的DNA序列。终止子：转录过程中能够终止RNA聚合酶转录的DNA序列，这种终止转录信号的序列~。复制和转录的相同点：均以DNA为模板、均需要聚合酶、均以含三个磷酸的核苷酸为原料、均是核苷酸聚合过程，多核苷酸为产物、均遵从碱基配对规律。均为5’-3’方向延长⑤反应体系需Mg参与⑦聚合过程都是核苷酸之间生成磷酸二酯键复制和转录的不同点：复制:两条链均复制。原料为dNTP,酶：DNA聚合酶 产物：子代双联DNA，配对：A-T G-C转录:模板链转录。
mRNA tRNA rRNA
A-U T-A G-CDNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因(structural gene)。转录特点：DNA片段转录时，双链DNA中只有一条链作为转录的模板,转录的这种选择性称为不对称转录(asymmetric transcription)，它有两方面含义：在DNA分子双链上，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；其二是模板链并非总是在同一单链上。转录的酶：依赖DNA的RNA聚合酶，RNA聚合酶能直接启动转录：不需要引物。RNA聚合酶和DNA的特殊序列――启动子(promoter)结合后，就能启动RNA合成。ρ因子：控制转录终止原核生物转录过程: 起始
终止原核生物转录起始过程：1. RNA聚合酶全酶(?2????)与模板结合，形成闭合转录复合体(closed transcription complex)
2. DNA双链局部解开，形成开放转录复合体(open transcription complex)3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成转录起始复合物转录起始复合物：RNApol (?2????) - DNA - pppGpN- OH 3?原核生物转录延长：1. ?亚基脱落，RNACpol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移
2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。(NMP) n
(NMP) n+1 +
PPi RNA链的延长过程：1、RNA聚合酶将双链DNA解开一段，形成转录泡。在聚合酶的作用下以NTP为底物，与模板链的碱基互补开始合成RNA。2、 复制泡扩大，RNA聚合酶继续合成RNA。3、 随着RNA链的延长，RNA聚合酶沿着模板链不断滑动，下游不断解链，上游不断恢复双链，转录泡不断向下游移动，保持约17bp大小，直到遇到终止信号合成则停止。DNA双螺旋重新形成。原核生物转录终止：转录终止指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。 依据是否需要蛋白质因子的参与，原核生物转录终止分为：1、依赖ρ 因子的转录终止。2、不依赖ρ因子的转录终止。依赖ρ因子转录终止 ：ρ因子由6个亚基组成的蛋白质，具有ATP酶和解旋酶的活性，能将RNA-DNA杂交双链解开，使RNA脱离模板，从而终止RNA转录。作用原理：Rho因子是rho基因的产物，广泛存在于原核和真核细胞中，由6个亚基组成，分子量300KD。Rho因子结合在新生的RNA链上，由5’端向3’端的方向移动。Rho因子有ATP酶的活性和解螺旋酶的活性非依赖 Rho因子的转录终止：DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录① RNA产物3’端往往形成特殊的茎环结构，该结构阻碍RNA聚合酶前移。② 转录产物中有密集的G-C配对，形成茎环结构，其后有一串寡聚U。rU:dA最不稳定。③ 寡聚U有利于RNA不再依附DNA模板链而脱落。转录泡：由核心酶-DNA-RNA形成的转录复合物羽毛状现象说明：在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行；转录尚未完成，翻译已在进行。启动子的分离――RNA聚合酶保护法启动子结构的描述方法：1.DNA上开始转录的第一个碱基定为+1，原核生物常为A或G，且位置固定。2.沿转录方向顺流而下的核苷酸序列均用正值表示；3.逆流而上的核苷酸序列均用负值表示。原核生物RNA聚合酶：α亚基：决定哪些基因被转录。β：催化功能；β’结合DNA模板; δ：辨认起始点。全酶：转录起始阶段，核酶：转录延长阶段。结构特点：1）.转录起始点：多数情况下（&90%）为嘌呤，常见序列为 MCAT MM，A为起始2).-10区
又称为Pribnow盒：在转录起始位点上游-10左右位置，有一六核苷酸保守序列-TATAAT是RNA聚合酶结合位点，这一段保守序列~。保守序列：TATAAT
A.T较丰富，易于解链。功能：(1) RNA pol 结合位点 ；(2) 形成二元开链启动复合体； (3) 使RNA pol定向转录。3).-35区
又称为Sextama box：RNA聚合酶节后覆盖的启动子区域有一六核苷酸保守序列-TTGACA，在转录起始位点上游-35左右位置称为~，又因其是RNA聚合酶初始结合位点，RNA聚合酶靠其ζ因子识别该位点，可称为RNA聚合酶识别位点。其保守序列 TTGACA
(1) 为RNA pol的识别位点。ζ亚基识别-35序列，为转录选择模板链。RNA Pol 核心酶和模板结合，进行聚合；(2) 很大程度上决定了启动子的强度。4）.-10和-35之间距离：17bp的间距转录效率最高。间距上的突变种类： 间距趋向17bp → 上升突变
间距远离17bp → 下降突变原因：该距离大致是双螺旋绕两圈的长度。这两个结合区是在DNA分子的同一侧面，此酶结合在双螺旋的一面。标准启动子（-10和-35）与转录效率关系：a.序列同源性越高 →启动强度越大
b. 与标准启动子同源性越低 →启动强度越小c. 与标准启动子差异很大时 →由另一种ζ因子启动5）.CAP位点：环腺苷酸受体蛋白亦称为分解代谢物激活蛋白（CAP）结合位点。位点I：-70~-50
位点II ：-50~-40葡萄糖效应：ATP在腺苷酸环化酶的作用下生成cAMP ，cAMP与环腺苷酸受体蛋白（CAP）结合，形成复合物。CAP复合物与启动子上的CAP位点结合，使 CAP 位点II附件的富含GC区双螺旋结构稳定性降低，使－10区熔解温度降低CAP复合物促进乳糖操纵子基因转录的进行。真核生物RNA聚合酶种类
III 型分子量
6×105分布
核质转录产物
tRNA前体18S、
5S rRNA28S
snRNA鹅膏蕈碱敏感性
敏感真核生物启动子:3种。（一）RNA聚合酶I的启动子：rRNA 基因转录调控区。人类rRNA基因启动子属第一类启动子，由两个元件组成，一个是核心元件，此元件包括转录起始点，存在富含AT的保守序列，为转录所必须；另一个为上游启动子元件，从－107开始，约50bp长，此元件的作用是增强转录效率RNA聚合酶II的启动子：通用型启动子（无组织特异性）结构最复杂，位于转录起始点的上游，有多个短序列元件组成(1) 起始子（initiator，Inr）：位于起始点 -3～+5 ，由Py2CAPy5构成，当有的基因缺少TATA框时，可能由Inr来替代它的作用，无论TATA是否存在，Inr对于启动子的强度和起始位点的选择都是十分重要的 。(2)TATA框：位于－30处 ，T82A97T93A85A63（T37）A83A50（T37）功能：定位转录起始点 ，也称为选择子 ；
TATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的(3)CAAT框：位于－75bp处
一致序列为GGC/TCAATCT
功能：前两个 G 的作用十分重要(转录效率)；
增强启动子效率、频率，不影响启动子特异性
（4）增强子(enhancer)：不是启动子的一部分，但能增强或促进转录的效率。增强效应十分明显， 其位置和取向无关，核心序列TGGAAA，有严密的组织性和细胞特异性，没有基因专一性，受外部金属离子等调控。（二） RNApolⅡ的启动子结构特点：起始点上游多数有共同的TATA序列，称为Hognest盒或TATA盒(TATA box)。通常认为这就是启动子的核心序列。（三）RNA聚合酶III的启动子：5S rRNA 和 tRNA 基因的启动子位于被转录的序列之中，称内启动子。所有的tRNA基因都有两个内启动子元件。5S rRNA合成的启动子与tRNA的相似，两个TF与RNA聚合酶Ⅲ的结合顺序也相同。tRNA 基因的内启动子及 RNA聚合酶III与 其转录因子的结合转录因子IIIC（TF III C）首先与启动子的A 和B框结合，然后TFIII C与TFIII B结合，最后RNA聚合酶III与TFIII因子结合，并启动转录。真核生物转录相关因子：真核细胞中，能够协助RNA聚合酶转录RNA的蛋白质统称为转录因子（TF)
顺式作用元件 / 反式作用因子
DNA直接结合型 / DNA间接结合型
基本转录因子 / 特异转录因子 顺式作用元件：包括启动子、启动子上游元件等近端调控元件和增强子等远隔序列。真核生物转录过程：转录起始
转录终止转录起始：真核生物RNA-pol不与DNA分子直接结合，而需依靠众多的转录因子，形成转录起始复合物(pre-initiation complex, PIC)转录延伸：真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。
RNA-pol前移处处都遇上核小体。
转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。转录终止：基因的3’端有终止信号；有涉及poly A加尾信号（AATAAA）；真核生物RNA的成熟：加工主要在细胞核中进行。真核生物mRNA的成熟：1，mRNA的剪接 2，大多数真核mRNA的5’-末端有7-甲基鸟嘌呤的帽结构。
3，这个真核mRNA加工过程的起始步骤由两种酶，加帽酶(capping enzyme)和甲基转移酶(methyltransferase)催化完成。1、mRNA的剪接：除去hnRNA中的内含子，将外显子连接。外显子：在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。内含子：隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。断裂基因(splite gene)：真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而
a. 有6个茎环二级结构，
b. 分支点序列： 内含子的3’端，即第6 区有 6-12nt保守序列，哺乳动物中为PyPuPyPyT A Py。含有不配对A残基，其2-OH进行转酯反应。剪接方式：一：自我剪接（内含子Ⅰ 、Ⅱ ），形成特定的二级结构，RNA具有催化剪接的能力；二：由剪接装置完成（核mRNA内含子
III），可供识别的特异序列，剪接装置由多种蛋白质和核蛋白组成；三：需要蛋白质酶参与的剪接（酵母tRNA
IV），前两种剪接都属于转酯反应。剪接机制：1）自我剪接2）反应需要：一价和二价离子，不需能量的供给 。 3）具体的剪接过程
第一步：分枝点A发生转酯反应 A的2’-OH对5’剪接点发动进攻，产生套索结构；第二步：切下外显子1，其3’-OH进攻内含子3’端的边界序列，然后释放出套索状的内含子。3、核mRNA内含子的剪接。特点：a. 剪切过程和Ⅱ类内含子十分相似，b. 本身不能形成二级结构，依赖于剪接装置进行剪接 剪接装置：1）核蛋白：snRNPs （U1，U2，U5、U4、U6）；由snRNA和蛋白质组成scRNA： scRNPs 2）剪接因子：大量的蛋白，如U2AF。作用：直接参与剪接，提供特定的结构； mRNA5‘端加帽子和3’加尾巴可以使mRNA免遭核酸酶的攻击；也能与帽结合蛋白质复合体(cap-binding complex of
protein)结合，并参与mRNA和核糖体的结合，启动蛋白质的生物合成。
3’端加多聚腺苷酸尾 poly A的有无与长短，是维持mRNA作为翻译模板的活性，以及增加mRNA本身稳定性的因素。一般真核生物在胞浆内出现的mRNA，其poly A长度为100至200个核苷酸之间，也有少数例外。真核生物tRNA的成熟：切除5‘端一段16个核苷酸的前导序列，切除反密码子的一段插入序列； tRNA核苷酸基转移酶催化3′-端CCA-OH的生成；某些碱基的化学修饰，甲基化 还原反应（DHU） 脱氨反应真核生物rRNA的成熟:在哺乳动物细胞的核仁内，三种rRNA的合成过程均先形成45S的共同前体。然后，该前体再断裂成相应的rRNA 。rRNA前体的加工是由多亚基的核蛋白复合物来完成的。真核细胞的5S RNA基因与其它rRNA基因相分开。转录后经过适当的加工，28S、5.8S与相关的蛋白质一起组成核糖体的大亚基。18S则是小亚基的成分。rRNA的成熟过程中也包括碱基的甲基化修饰和部分核糖的2’-OH甲基化反应。甲基的供体是S-腺苷蛋氨酸。RNA的编辑：包括U的插入和删除，C、A和G的插入，C被U取代或U被C取代，A转变为I等。 RNA编辑作用说明，基因的编码序列经过转录后加工，是可有多用途分化的，因此也称为分化加工(differential RNA processing)。RNA的编辑的生物学意义：1. 消除移码突变等过程带来的危害，甚至某些基因在突变过程中丢失达一半以上的遗传信息都可籍gRNA（guide RNA）加以补足；2. RNA编辑能增加基因产物的多样性，由同一基因转录物经编辑可表达出多种同源体蛋白质；3. RNA编辑与生物细胞的发育和分化有关，是基因调控的一种重要形式；4. RNA编辑使基因产物获得新的结构和功能，有利于生物进化。一、原核生物转录调控（一）原核生物基因转录调控的特点:ζ 因子特异性识别,操纵子学说的普遍性,负性调节占主导操纵子：是基因表达的协调单位，由启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。操纵基因受调节基因产物的控制。负转录调控：调节基因的产物是阻遏蛋白(占主导).正转录调控：调节基因的产物是激活蛋白.操纵子学说：多个功能相关的原核基因总是串联在一起，依赖同一转录调控区对基因转录进行调节，构成一个转录单位，以确保功能相关基因之间表达的协调性
2-4：调控区，5-7：结构基因。乳糖操纵子调控机构：1.阻遏蛋白负性调节：A. 葡萄糖存在，乳糖不存在时，阻遏蛋白封闭转录，CAP不能发挥作用，不转录。（乳糖经通透酶进入细胞，经细胞中少量β-半乳糖苷酶催化转变为别乳糖，作为诱导剂与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白与O序列解离，RNA聚合酶与P序列结合，Z、Y、A相继表达，使β-半乳糖苷酶量增加1000倍）B. 乳糖存在，阻遏蛋白诱导变构，不能发挥作用，转录去阻遏；葡萄糖存在，CAP不能发挥作用，不转录。C. 葡萄糖不存在，乳糖存在，阻遏蛋白诱导变构，不能发挥作用，转录去阻遏，CAP发挥作用，转录增强。2.CAP正性调节：CAP为一种同二聚体，具有DNA和cAMP结合的区域，CAP先与cAMP结合后才能与DNA结合。无葡萄糖，cAMP浓度高，CAP与cAMP结合辨认结合在lac操纵子系统的CAP位点，增强聚合酶活性，使转录效率提高50倍。有葡萄糖，cAMP浓度低，结合受阻，转录效率下降。
（二）原核生物转录终止的调控
色氨酸操纵子的弱化机制：(1)阻遏蛋白调控作用:色氨酸：作为阻遏物而不是诱导物参与调控结构基因的转录。大量色氨酸时：色氨酸与与阻遏蛋白结合，引起阻遏蛋白构想变化，阻遏蛋白被产物激活，与操纵子序列O结合，5种酶的转录同时受到抑制，结构基因不表达，阻遏转录。色氨酸不足时：色氨酸不能与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白不能与操作子O序列结合，所以结构基因表达，５种酶的基因开始转转录。特点: (1) trpR和trpABCDE不连锁；(2) 操纵基因在启动子内；3) 有衰减子(attenuator)/弱化子；(4) 启动子和结构基因不直接相连，二者被前导序列(Leader)所隔开 。（2）衰减调节：前导基因长162bp,其中第27-79碱基可翻译出一段14个氨基酸的前导肽，在该短肽的第10、11位置上是两个色氨酸密码子；两个密码子之后是一段mRNA序列，该序列可分为四个区段，前导肽第1区段，区段3与区段2、4间可互补配对，形成不同的二级结构。3与4配对形成茎-环结构，才能终止转录。原核生物为边转录边翻译，前导序列中核糖体位置决定形成哪种二级结构,从而决定弱化子是否可形成终止信号。二、真核生物转录调控真核生物基因表达调控与原核的不同点：1、真核基因表达调控的环节更多2、真核生物活性染色质结构的变化对基因表达具有调控作用：DNA拓扑结构变化、DNA碱基修饰变化 、组蛋白变化；3、正性调节占主导，且一个真核基因通常有多个调控序列，需要有多个激活物。顺式作用元件：真核生物转录起始点上游与转录有关的序列，包括启动子、增强子；负性调控作用的元件沉寂子启动子中的元件可以分为两种：① 核心启动子元件(core promoter element ,CPE)? 指RNA聚合酶起始转录所必需的最小的DNA序列，包括转录起始点及其上游－25处的TATA盒。②上游启动子元件(upstream promoter element ,UPE)或称上游激活序列（upstream activating sequence,UAS):包括通常位于－70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。 增强子:又称远上游序列，指能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。在SV40的转录单元上发现它的转录起始位点上游约200bp处有两段72bp长的重复序列，它们不是启动子的一部分，但能增强或促进转录的起始，除去这两段序列会大大降低这些基因的转录水平。性质:增强效应十分明显:10~200倍,甚至上千倍。增强效应与其位置和取向无关多为重复序列，跨度100~200bp。其增强效应有严密的组织性和细胞特异性,只有特定的转录因子参与才能发挥其功能。没有基因专一性,与不同的基因组合均表现增强效应。活性与其在DNA双螺旋结构中的空间方向性有关。受外部信号调控，又称反应元件沉默子 silencer：负性调控元件，它与转录抑制因子结合抑制转录。作用特点：不受序列方向的影响，能远距离发挥作用。反式作用因子：识别或结合顺式作用元件中的靶序列启动转录。反式因子有两个必需的结构域：DNA 结合结构域：与顺式元件识别结合。转录激活结构域：与其他蛋白质结合。DNA结合域结构模式：螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）这类结构至少有两个α螺旋其间由短肽段形成的转角连接，两个这样的motif结构以二聚体形式相连，距离正好相当于DNA一个螺距（3.4nm）,两个α螺旋刚好嵌入DNA的深沟。转录激活域：是与其它转录因子相互作用的结构成分，可控制转录起始复合物的组装和转录起始，具有转录调控功能。谷氨酰胺激活域，结合GC框的Sp1。脯氨酸激活域，识别CAAT框的转录因子CTF。带负电荷的α螺旋激活域；含双性α螺旋和酸性氨基酸的激活域
第四章多顺反子：在原核生物中，数个功能相关的结构基因常串联在一起，构成一个转录单位，转录生成的一段mRNA往往编码几种功能相关的蛋白质，称为多顺反子。SD序列：原核生物mRNA的起始密码子AUG上游4――7个核苷酸以外有一段5‘-UAAGGAGG-3’的保守核苷酸序列，称为SD序列，是mRNA与核糖体识别，结合的位点。单顺反子：真核细胞剪接后的每一种mRNA仅能翻译出一种蛋白质，真核生物的mRNA称为单顺反子。 终止密码子：不编码任何氨基酸，只作为肽链合成终止的信号。（UAA,UAG,UGA）AUG既编码甲硫氨酸，又是起始密码子遗传密码的特点：1，方向性：从5‘端到3‘端
2，连续性：密码间无标点符号，没有间隔
3，兼并性：61个密码子编码20种氨基酸
4，摆动性：密码子与反密码子配对时，有时会出现不严格遵从常见碱基配对规律的情况，称为摆动配对。 5，通用性：所以生物公用一套遗传密码。⑦不同生物使用密码子有偏好性。起始密码子一般为ATG（甲硫氨酸）密码子第三位碱基是摆动的（使tRNA可与一个以上的密码子碱基配对）②一般无重叠多聚核糖体(polysome)可提高翻译效率tRNA中的反密码子与mRNA密码子的配对方式是反平行方式。细胞中rRNA的种类：原核 5S
5.8S原核生物的16S rRNA可与SD序列结合，使mRNA能在核糖体上正确定位。氨酰-tRNA合成酶：氨基酸活化 反应分2步: 1 氨基酸与ATP反应, 形成 氨酰-AMP 2
氨酰-AMP的氨酰基转移到tRNA的3?端的CCA, 形成 氨酰-tRNA总反应为：氨基酸 +ATP+tRNA
―――― 氨酰-tRNA +AMP +PPi每活化一个氨基酸, 消耗掉2个高能键氨酰-tRNA合成酶的特点：1
对氨基酸有非常高的特异性
对相应 tRNA的特异性稍低,
3 只能激活 L-氨基酸。第二遗传密码：在蛋白质合成过程中没有校对步骤，这里的氨酰-tRNA合成酶对氨基酸和tRNA之间的严格配对，是保证蛋白质正确合成的关键。有人将这种氨酰tRNA合成酶与tRNA之间的这种相互作用关系，称为蛋白质合成过程中的“第二遗传密码”。蛋白质的合成可分为几个阶段（原核）：（1）氨基酸的活化
由氨酰-tRNA合成酶催化完成，反应在细胞质中进行（2）起始
IF1 和 IF3 与 30S 亚基 结合
2 30S 亚基与mRNA结合(16S RNA 可以识别起始密码子前的SD序列 )
IF2 与 GTP 结合，再与 30S亚基结合，形成一个复合物。
携带起始氨基酸的 tRNA 与上述复合物结合，同时将 IF3 释放，由此形成30S起始复合物。
50S 亚基与 30S 起始复合物结合形成 70S 起始复合物。释放IF1 and IF2 ，水解GTP 。（3）延伸
氨酰tRNA的结合
肽键的形成
c 移位（需要转位因子EF-G和GTP.）（4）肽链的终止和释放
水解多肽链末段的肽-tRNA之间的键, 将最后的tRNA和多肽链释放, 将70S复合物解离成30S和50S亚基准备新一轮的合成.RF1识别UAG 和UAA
RF2识别UGA和UAA（5）新生肽的折叠和加工
刚从核糖体上释放出来的多肽链是没有生物活性的，要经过“成熟加工”的过程才能具备有生物活性。原核细胞和真核细胞蛋白质合成的区别：①70s核糖体50s+30s②起始Aa是fMet③许多mRNAs是多顺反子④AUG前有SD序列⑤起始密码子在SD后⑥起始因子IF-123⑦延伸因子EF-Tu，EF-Ts，EF-G⑧延伸因子RF123；①80s核糖体60s+40s②Met③单顺反子④无SD有Kozak序列⑤起始密码子通过扫描寻找⑥起始因子更多⑦eEF-1α，1βγ，2⑧一个终止因子eRF⑨两套遗传系统⑩有PK参与调解Pr的合成白喉毒素(Diphtheria toxin，Mr 58330)是一种修饰酶，可以使真核细胞的延伸因子2(eEF2)发生ADP-核糖基化，从而使之失活，而抑制蛋白质的合成。干扰素(interferon, IF)是真核细胞在病毒感扰后分泌出的具有抑制蛋白质合成的因子，有不同的亚型。干扰素通过两种不同的方式干扰eIF2的活性。有病毒存在时，干扰素可诱导产生一种蛋白激酶，使eIF2磷酸化失活，使携带氨基酸的tRNA无法进入核糖体，导致蛋白质的翻译终止。
干扰素还可以诱导细胞产生一种少见的以2?-5?磷酸二酯键连接而成的寡聚2’-5’腺苷酸，从而活化细胞内的核酸内切酶RNAase L，降解病毒的RNA。来自蓖麻种子中的一种蛋白质Ricin (Mr 29,895)，特异性的将23S rRNA中的腺嘌呤核苷去嘌呤，结果使核糖体的60S大亚基失活，抑制蛋白质的合成。
蛋白质合成的调控：原核中
mRNA的二级结构可以掩盖核糖体的结合位点，减少基因翻译的机会。2)
mRNA具有的茎环结构可以抑制核酸外切酶的作用，延长mRNA 的寿命，增加基因翻译的机会。
大肠杆菌中一些编码核糖体蛋白质的mRNA，某个区域具有三级结构，而这种结构与此mRNA编码的核糖体蛋白质的结合位点的结构类似。如果没有足够的rRNA与蛋白质结构形成核糖体，则翻译出来的蛋白质就会与自己的mRNA结合，使翻译停止。这种调控方式叫“翻译的自体调控”
有一些短的反义RNA，靠近某些mRNA 的核糖体结合位点，可以抑制翻译。
有多拷贝的5?-AUUUA-3?位于3?端非编码区，指示RNA降解，从而控制蛋白质的合成。
蛋白质直接与mRNA结合阻止翻译，一定条件下蛋白质解离，mRNA又可以作为模板翻译。分子伴侣：细胞中的一类保守蛋白质，可识别肽链的非天然构象，促进各种功能域和整体蛋白质的正确折叠。分子伴侣的成员很多，可以分为2大类
第1类与核糖体结合，如触发因子、新生链结合复合物等。第2类不与核糖体结合，如热激蛋白hsp40、hsp70、hsp60以及二硫键异构酶、脯氨酰-顺反异构酶等。蛋白质的翻译后加工：从核糖体中释放出来的多肽链不一定具有生物学活性，只有经过细胞内各种修饰处理后，才能成为有活性的成熟蛋白质，这个过程称为“蛋白质的翻译后加工”。
（1）从结构方面来看，蛋白质的加工修饰可以分为3种：a: 氨基酸侧链的小改变
包括二硫键的形成 ；氨基酸的甲基化、磷酸化、乙酰化等；b:特定氨基酸残基上连接上体积较大的基团c: 肽链的剪切（2）从结果来看，蛋白质的修饰可以是可逆的(如磷酸化)，也可以是永久不可逆的(如二硫键的形成)等。细胞内质网中有二硫键异构酶，可以促使正确的二硫键的形成。
大肠杆菌细胞质中的蛋白质没有二硫键。一级结构的修饰：肽链N端Met或fMet的切除
特定氨基酸的共价修饰
二硫键的形成
多蛋白的加工
前体蛋白的加工空间结构的修饰：亚基聚合
辅基连接信号肽：分泌蛋白与细胞质的胞浆蛋白主要区别是在多肽链的N端，分泌蛋白含有一段13－35氨基酸长度的信号肽或称为信号序列。信号肽假说的基本内容：蛋白质开始是在细胞质中的游离核糖体上进行合成的, 首先合成出来的是N端的信号肽。信号肽出来之后就被细胞质中的信号识别体(signal recognition particle, SRP)识别并结合,使蛋白的合成暂时中止, 形成一个核糖体-SRP-mRNA的复合物。复合物中的SRP和核糖体分别与内质网表面的SRP受体和核糖体受体结合, 并同时与内质网上的一个蛋白质转位复合物结合。经过一系列的反应之后，核糖体与ER结合在一起, SRP从信号肽上被释放出去，循环利用。蛋白的合成在内质网的表面重新开始。ER膜上由蛋白质转位复合物形成一个孔，新生的肽链就由此进入核糖体的内腔, 通过孔时,信号肽被ER腔内表面的信号肽酶切除。余下合成的肽链合成后就直接释放在ER内腔中。导肽位于多肽链的N端，含有20－80个氨基酸；带正电荷的氨基酸比较多，分散在不带电荷的氨基酸中间；不含有带负电荷的酸性氨基酸；羟基氨基酸含量较高；有形成两亲α螺旋的能力。蛋白质的跨膜运输：1 分泌蛋白质的运输
细胞质膜上蛋白的运输
内质网膜中蛋白的运输
溶酶体中的蛋白的运输
叶绿体和线粒体中蛋白的运输
细胞核内的蛋白运输滞留信号Lys-Asp-Glu-Leu, (KDEL)6-磷酸甘露糖是蛋白前往溶酶体的信号。翻译后运输：在细胞质中游离的核糖体上进行合成的，合成完后才运输到各自器官中核定位信号：特征为:
4-8 aa,富含正电荷的氨基酸, Lys, Arg, 常常还有Pro细胞中有2种蛋白质降解系统：（1）选择性降解，消耗ATP
（2）在溶酶体中降解，无选择性，将膜蛋白、外来蛋白等蛋白降解之后，重新利用。细菌中大多利用蛋白酶Lon降解蛋白质，需消耗ATP。真核细胞利用泛素降解体系降解蛋白质线粒体蛋白的转运―导肽假说，翻译后运输：合成后再分选和运输。导肽位于蛋白质前体N端，富含SerTher和带正电荷Aa，其引导的前体Pr通过膜时被1~2种多肽酶水解后转化成成熟型Pr。hsp70与导肽结合使导肽以非折叠的形式释放到胞浆中→hsp70帮助这些Pr到线粒体外膜并与其上的内运受体结合→沿线粒体外膜滑动到内外膜的接触位点→形成蛋白转运通道→hsp70-线粒体蛋白复合体进入基质→hsp70释放，导肽序列水解→线粒体自身hsp70与线粒体蛋白结合→hsp60把线粒体hsp70替换→帮助线粒体蛋白正确折叠成有活性的国能构象。基因工程：在体外将核酸分子插入载体（病毒质粒等）结构成遗传物质的新组合，并使之参与到原来没有这类分子的寄主细胞内并使之稳定繁殖。两大特征:a 跨越物种障碍，创造出大自然中不存在的生物类型.b DNA片段在寄主体内能够稳定遗传并大量扩增.最为关键的技术是核酸限制性内切酶和DNA连接酶的发现，它们被称为“分子剪刀”和“分子胶水”。基因工程的操作步骤：（1）目的基因的获得（基因分离或合成）（2）重组分子的形成：将目的基因与能够自我复制并具有选择性标记的载体分子相连接而成。（3）把重组DNA分子引入到合适的受体（寄主）细胞中进行扩增（转化）（4）从繁殖的大量细胞群体中筛选鉴定出含有重组DNA分子的受体细胞的克隆。（重组DNA筛选鉴定）（5）从筛选的受体细胞克隆中提取出已扩增的目的基因后，或再克隆到表达载体上导入新的寄主细胞，以便产生人们所需要的物质；或者将已扩增的基因做进一步的分析研究之用。目的基因的获得：构建基因文库、基因组文库、cDNA文库；PCR；人工化学合成；其他限制性内切酶：识别和切割某种特定核苷酸序列（~4-8bp回文结构）并能产生具有二重对称特异序列结构的水解酶（末端特点1平~2粘性~5’突出BamHⅠ3’PstⅠ）。①同裂酶：异源同工酶，来源不同但是别和切割同样的核苷酸序列形成同样的末端的限制性酶，但它们之间可能在对甲基化碱基敏感度有差异。②同尾酶：来源及识别顺序均不同，切割方式也不同，所生成的限制性片段却是相同粘性末端。内切酶的命名：内切酶的名字由3个字母组成，物种属名的第一个大写字母加上种名的前2个小写字母；还可以加上菌株的第一个字母和大写的罗马字母等以示区别。如从流感嗜血杆菌d株中分离得到3个不同的限制酶，分别命名为Hind I,Hind II和Hind III等。DNA连接酶：连接机制：催化相邻的3’-OH与5’-P之间形成磷酸二酯键。载体：来源于大肠杆菌后噬菌体等的DNA，可供外源DNA插入并将外源DNA导入宿主细胞的片段。功能：单独的外源DNA片段不能在细胞内长期存在，载体使目的DNA可长期存在于细胞中。原因：载体是独立于染色体外的，可自主复制并遗传。条件：a有自主复制能力，外源基因插入不影响其自主复制能力，但仍保持独立。b有合适的可供外源基因插入的克隆位点。单或多个。c具备选择标记，如抗性、产生色素、某种Aa合成等。d.载体本身比较小可携带一定长度的外源DNA片段，有较高拷贝数。e.使用安全。可隆载体只能生长在有限的宿主细胞内，在体内不能进行重组，细胞间不能发生转移，不产生有害性状，不能离开工程宿主自由扩散。F.特殊要求。根据DNA分子克隆的目的分为：克隆载体：是指以繁殖DNA片段为目的的载体用于外源基因的重组、克隆、复制和保存。一般分子量较小，在宿主细胞中拷贝数较高，所以外源DNA 片段可以通过克隆技术大量获得。穿梭载体：是指那些即可以在原核细胞中又可以在真核细胞中繁殖的载体，因为这类载体含有两种复制起点。表达载体：可以使克隆的外源基因在宿主细胞内表达的载体。表达载体必须具备的条件：(1) 有强的启动子,可以为宿主的RNA聚合酶识别.(2) 有强的终止作用;(3) 受控的启动子(可诱导型等).(4) 起始密码子ATG与SD序列的距离要适当,便于翻译.(5) 具有复制起点;(6) 具有多克隆位点, 便于外源基因插入, 具有选择性标记等。质粒:一种亚细胞的有机体, 结构比病毒还简单, 没有蛋白质外壳, 没有细胞外的生命周期, 只能在寄主细胞内独立的增殖,并随着寄主细胞的分裂而被遗传下去。绝大部分的质粒由DNA 组成，是共价闭合的环状双链分子，质粒大小从1kb到200kb不等。质粒存在于细胞质内，独立于染色体外并能自主复制（含有复制起始区），可以稳定地游离于染色体之外，一定时候又可逆地整合到染色体上，或消失；质粒可以通过转化从细菌外部进入细菌内部或在细菌之间迅速传递。环形双链 DNA 质粒分子有 3 种构型:a.共价闭合环形(cccDNA)：两条DNA保持完整。一般成超螺旋状态，称为SC（supercoiled）构型。b 开环DNA(ocDNA)：两条链中一条完整，另一条有一个或几个缺口，称为OC构型。c 线形分子(lDNA)：两条链均断裂，分子呈线形，称为L型。结合型质粒与非结合型质粒：革兰氏阴性细菌中的质粒可以分为结合型质粒与非结合型质粒。其中，结合型质粒携带除了自主复制所必需的遗传信息外还带有控制细菌结合和质粒转移的基因，所以又叫做“自主转移质粒，可以在细菌之间转移，还可以带动宿主染色体的转移。非结合型质粒则与之相反。基因工程中采用的质粒是属于非结合型质粒才能保证基因工程的安全。质粒的不亲和性(incompatibility)：也叫做质粒的不相容性，指没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的质粒不能在同一个寄主细胞内稳定共存，其中有一个将被逐渐排斥(稀释)掉，这样的质粒叫做不亲和质粒。由于质粒具有不亲和性，所以我们才能在只带有一种质粒的细菌中分离得到成分单一的质粒DNA。反转录酶是一类独特的DNA聚合酶，以RNA为模板，指导DNA的合成。又称为“依赖RNA的DNA聚合酶”。1970年由Temin等首先在鸟类致病的RNA病毒中发现。由一条多肽链组成，但有多种酶的活性。反转录酶催化从RNA合成 cDNA.质粒的拷贝数：标准生长条件下每条细菌染色体平均具有的质粒DNA数目叫质粒的拷贝数。严谨型复制控制的质粒在每个寄主细胞中只有1-3个拷贝，属于低拷贝质粒；松弛型复制控制的质粒在每个寄主细胞内有10-60或几百个拷贝的质粒，属于高拷贝数的质粒。质粒的严谨型和松弛型不是固定的，寄主的种类会改变质粒的类型。高拷贝数的质粒载体
便于获得大量的克隆的基因产物,例如从ColE1和pMB1衍生而来的载体.低拷贝数的质粒载体
在一些情况下,当想将外源基因产物的量控制在一定水平而避免对寄主细胞造成伤害.pBR322 特点:复制起点:保证细胞中质粒的拷贝数维持在10-20个拷贝/细胞.抗性基因2个:抗四环素基因和抗氨苄青霉素基因.克隆位点:单一的酶切位点,供外源基因插入.分子较小: 有利于质粒进入细胞中和方便DNA操作。λ噬菌体载体:λ噬菌体是一种目前研究最为透彻的大肠杆菌的双链DNA噬菌体，大小为50kb左右，实验发现其中有1/3左右的DNA序列不是病毒繁殖所必须的, 这一段DNA序列可以用其他DNA序列取代，经过点突变、基因组置换等改造，而发展成λ噬菌体载体。特点：(1)可以容纳比质粒更大的外源DNA，理论上可以克隆的外源基因大小为23kb（实际只有15kb左右）；(2)噬菌体转染宿主细胞的效率比质粒转化细菌高2-3个数量级。单链DNA噬菌体载体:将M13 噬菌体的双链的复制型DNA （RF DNA）改造，可以形成单链 DNA 噬菌体载体。可以容纳外源基因大小在1500bp左右。由于这种M13噬菌体可以生产单链DNA，所以M13载体在基因工程中用于单链探针的制备、DNA的单链测序和定位诱变等。近年来发展起来的噬菌体表面展示技术主要使用的就是M13噬菌体载体噬菌粒载体:由单链噬菌体载体和质粒载体结合而成的新型载体,叫做噬菌粒(phagemid or phasmid)。可以产生单链DNA也可以产生双链DNA，载体分子量小，克隆能力大，使用非常广泛。如pUC118和pUC119噬菌粒载体(pUC+M13).酵母附加型质粒载体（YEP）：来源于野生质粒，大小6300 bp，长度约为2μm，又叫做2μm质粒。是双链环状DNA，有一段长度为599 bp的反向重复序列而分为两个部分，各有基因的启动子和控制元件。YEP是在2μm质粒基础上加上酵母核DNA和细菌质粒pMB9部分序列改造而成的。酵母复制质粒（YRP）：由大肠杆菌质粒pBR322加上酵母染色体的自主复制序列而成，高拷贝，不稳定，转化效率高，但是多代培养后，拷贝数减少。酵母着丝粒质粒（YCP）：为了克服酵母复制质粒YRP传代不稳定的缺点而构建了YCP质粒。但是这种质粒对宿主有毒性，只能以低拷贝数存在.整合载体（intergrating vector, YIP）是指不含有酵母的自主复制序列，不能在酵母中独立复制，必须在载体整合到酵母染色体上之后才能使其中的基因得到表达.人工构建的哺乳动物细胞载体应该具备的条件是：（1）含有大肠杆菌复制子和抗性标记；同时含有真核细胞选择标记；（2）含有哺乳动物细胞启动子和增强子元件，可以使外源基因有效转录；（3）RNA聚合酶II 所需要的转录终止含有终止信号和polyA 结构；（4）含有可选择的剪切信号；（5）含有一个以上的多克隆位点。人们将染色体的重要区段分离出来并与普通的质粒相衔接，构成能够容纳特别巨大的DNA片段的载体，即人工染色体。YAC（yeast artificial chromosome）酵母人工染色体,具有着丝粒、端粒、自主复制序列还有正常质粒的元件，包括选择标记、多克隆位点、原核复制起点序列等YAC由2个臂组成, 每一个臂都以TEL结尾,各有一个CEN, ARS和选择标记。克隆基因时首先酶切把2个臂回收，再与外源基因连接，形成“染色体”。可以在酵母和大肠杆菌中稳定遗传（属于穿梭载体）。PAC（P1 artificial chromosome）噬菌体P1人工染色体BAC（bacterial artificial chromosome）细菌人工染色体：选择性标记是氯霉素，每个细胞中含有1个拷贝。DNA的化学合成的方法：磷酸二酯法，磷酸三酯法，亚磷酸三酯法（目前）氨基保护：腺嘌呤、胞嘧啶碱基上的氨基用苯甲酰基（bz）保护，鸟嘌呤碱基上的氨基用异丁酰基（Ib）保护，5‘-OH用二甲氧三苯甲基（DMT）保护。
合成的每个循环周期分为4个步骤：第一步：脱去保护基: 用酸处理，使核苷酸5‘-OH上面的保护基DMT脱落。第二步：偶联反应：使用二异丙基氨基亚磷酰氯甲酯作为活化剂和缩合剂，在弱碱化合物四唑催化下，了、偶联形成亚磷酸三酯。第三步：封端反应：加入乙酸酐使没有参与偶联反应的5’-OH被乙酰化，以免参与反应，出现错误序列。 第四步：氧化作用：合成亚磷酸三酯后用碘氧化，形成较为稳定的磷酸三酯。人工合成基因的基本程序：a.利用化学方法合成基因DNA不同部位的两条链的寡聚核苷酸的短片段，再退火成为两端活性末端的DNA双链片段；b将上述的DNA片段按照正确顺序进行退火，连接形成较长的DNA片段，再用连接酶连接，形成具有完整编码序列的DNA；c将完整编码的DNA与载体连接，导入合适的宿主细胞中，实现分子克隆。(化学（连接）酶促相结合的方法合成寡聚核苷酸，可以提高反应的专一性，减少副反应，提高产率等。)化学合成寡核苷酸的应用:（1）合成分子杂交的探针；（2）合成PCR引物和DNA测序使用的引物；（3）合成短小的或来之不易的基因，或改造天然基因；（4）合成DNA末端改造中的接头；（5）制备cDNA，筛选文库，克隆基因；用于基因定位和基因的专一性改变等。人工合成基因的缺点:合成的基因容易出现重复结构、发卡结构或回文结构，从而造成拼接效率下降或拼接错误；基因组文库（genomic library）：指整套由基因组DNA插入克隆载体所获得的分子克隆的总和，其中应该包含有生物的全部遗传信息。cDNA文库（cDNA library）: 指细胞全部mRNA反转录成cDNA并被克隆的总和。由于原核生物基因组中不含有内含子，所以可以认为原核生物的基因组文库与cDNA文库相同，但是真核生物就完全不同.基因文库的构建方法：染色体DNA的提取―DNA部分酶切―合适大小DNA片段的回收―（体外连接
――转化或感染进
成重组分子）
入宿主细胞 ――收集含有重组子的菌落，组成基因组文库―文库的鉴定和扩增―文库保护。构建cDNA文库的基本步骤：组织或细胞培养―提取总mRNA―反转录为cDNA（下同基因文库构建）特点:优点：（1）文库筛选比较容易；（2）得到基因的cDNA 序列中无内含子，可以用来研究基因的结构和功能，可以进行表达获得蛋白质产物；（3）利用cDNA做探针，可以认识了解染色体结构变化对基因表达的调节作用等。局限:1）cDNA不含基因的内含子序列和基因的调控序列等。（2）低丰度基因有时难以在文库中得到体现，难以分离。PCR 是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）的简称，是DNA的体外酶促扩增，又称为“无细胞分子克隆法”。基本原理：PCR方法模仿体内DNA复制的过程，首先是使DNA变性，两条链分开，然后使用引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以四种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的新的DNA链，重复此过程，DNA 以指数方式扩增。PCR扩增时需要两种引物，5’端引物和3‘端引物。 5’端引物又叫正向引物、上游引物， 3’端引物又叫反向引物、下游引物。PCR的基本过程分为三步：（1）模板变性：一般在94-95C进行变性3-5分钟（2）退火：在合适的温度下，引物和模板结合（3）引物延伸：在72C条件下，DNA聚合酶合成出新DNA链PCR 反应条件控制要点：（1）引物的设计：引物的质量与PCR的成败有最直接的关系（2）引物与模板的退火温度：（3）反应缓冲液中的Mg2+浓度；（4）模板：太多会影响反应，最少可到皮克级。（5）DNA聚合酶：目前均使用耐热的DNA聚合酶（6）四种dNTP 浓度要一致。“DNA分子的体外重组”：经过内切酶作用的目的基因和载体DNA，在连接酶的催化下，两个双链的DNA片段相邻的5‘端磷酸与3’端的羟基之间形成磷酸二酯键的过程，叫做连接（ligation）,连接的结果是外源基因与载体分子连接成为一个新的杂交分子，叫做“重组子”。定向克隆法：两个末端为不同的内切酶所切割形成：这时载体自身无法连接，转化后形成的重组子中载体自连极少，并且外源基因插入载体的方向可以确定，又叫平端DNA 分子之间的连接：可以直接使用噬菌体的T4连接酶进行连接，但是效率比较低将平端改造为粘性末端进行连接，常用的方法有: 同聚物加尾法 衔接物连接法 接头连接法平端――粘端片段之间的连接, 可以直接连接，或者将平端改造为粘端再连接受体细胞：为了便于重组子的筛选，受体细胞往往是某一种基因功能缺陷型的。为了基因工程的安全，宿主细胞不能具有感染性。同时宿主细胞应该易于生长，便于筛选。对于有害基因的克隆，宿主细胞有更高的要求。外源DNA导入宿主细胞，改变细胞遗传性状的叫转化（transformation）;将病毒DNA或病毒重组DNA直接导入宿主细胞叫“转染（transfection）,”重组分子导入宿主细胞的方法：（1）氯化钙转化法，电穿孔法（电击法），（3）磷酸钙共沉淀法4）脂质体5）显微注射法6）高速微弹发射装置法（俗称基因枪法）7）DEAE-葡聚糖转染8）细胞融合10）病毒感染。重组细胞的筛选：载体特征筛选;载体都有可筛选的遗传标记，最常用的是抗药性筛选标记、营养标记和显色标记，对于噬菌体来说，噬菌斑的形成是自我选择的结果。目的基因特征筛选：细菌菌落或噬菌斑的原位杂交。关键是获得特异的探针。一般探针的来源有（1）从已有的克隆中获得；（2）设计引物从基因组序列中扩增得到；（3）化学方法合成；（4）使用异源探针；（5）根据蛋白质序列合成简并探针 基因产物特征筛选:外源基因插入的载体是表达载体,主要方法有 （1）免疫学方法：利用放射性、显色酶或发光底物标记抗体，可以非常灵敏地检测到克隆的表达产物 （2）检查产物的功能活性。（3）检测产物的蛋白质结构和性质.报告基因筛选转化细胞:将目的基因与易于检测的一些报告基因，如GFP等连接，共同转化，形成转基因细胞后，不检测目标基因是否转化，而是检测这些报告基因是否转入。DNA序列的测定:有两种基本的方法：化学裂解法和双脱氧终止法.双脱氧终止法易实现测序的自动化， 双脱氧终止法测序原理DNA聚合酶1利用单链DNA做模板合成互补链。2利用2’3’ddNTP做底物使其掺入到寡核苷酸链3’末端终止DNA链延伸。3.4中dNTP+少量2’3’ddNTP，在少量DNA聚合酶作用下均掺入增长的DNA链中，ddNTP脱氧核糖的3’少一羟基，不能同dNTP形成磷酸二酯键导致链延伸反应终止。分离得到目的基因后，首先要证实，避免假阳性.1）根据基因的结构的序列特征：制作基因的限制性内切酶图谱、做分子杂交、序列测定等；（2）根据表型特征：如抗性、报告基因的性状等；（3）根据基因的表达产物性质：如与抗体反应、肽谱、蛋白质活性等。其中蛋白质的活性是最具有说服力的证据。 基因表达控制元件 ：启动子：指RNA聚合酶识别、结合并起始转录的一段具有高度保守性的DNA序列。 增强子：又称远上游序列，指能使和它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。终止子：转录过程中能够终止RNA聚合酶转录的DNA序列，这种终止转录信号的序列~启动子：选用强的启动子可以使基因处于高水平表达。原核细胞中表达外源基因常用的强启动子有（1）lacUV5，即乳糖操纵子的启动子，但是经过了改造，活性无须cAMP活化，被阻遏蛋白laci关闭，可以被IPTG诱导。 （2）tac启动子，由trp启动子的-35区和lac启动子的-10区融合而成，可被IPTG诱导。（3）λPL或PR启动子受λ阻遏蛋白调节，温度敏感型突变体（λCIts857）在30℃时启动子处于阻遏状态，在超过40℃时阻遏蛋白失活，基因得到表达。（4）ompF是低渗透压外膜蛋白基因的启动子，其温度敏感突变体在低温时无活性，温度升高有活性；（5）噬菌体T7的启动子，可以被T7RNA聚合酶高效特异识别并、高效转录，常用于构建高效表达系统或体外转录系统。核糖体结合位点：一段长3-9个核苷酸，富含嘌呤的序列，位于起始密码子上游3-11个核苷酸处称为SD序列。终止子：终止信号，在UAA UAG UGA 三个终止信号中，UAA的终止信号作用最强。非融合蛋白质:外源基因直接在宿主细胞中表达，产物就是。融合蛋白质:外源基因不能直接在宿主细胞中表达，需要在外源基因的5’端（或3‘端）接上一段宿主细胞或其他来源的基因片段才能在细胞中表达 (由两个部分组成，N端的序列是目的基因之外的其他基因的产物，目的基因的表达产物位于C端。) 外源基因不能直接在宿主细胞内表达的情况：（1）外源基因的活性形式中第一个氨基酸可能不是蛋氨酸，基因表达时需要在基因前面加入起始密码子，但是这种融合蛋白质可能会影响到其活性。（2）外源基因在宿主细胞中的表达量较低，融合蛋白质可以增加外源基因产物的表达量。（3）外源基因表达的蛋白质在宿主细胞内不稳定，易于被宿主的蛋白酶降解，融合的蛋白可以增加其稳定性。（4）融合蛋白质不影响某些抗体表位，可以容易进行抗体工程。（5）与某些特异的多肽或蛋白质融合，易于在分离后迅速纯化和检测。包涵体:由于基因表达部位低电何以及外源蛋白分子特殊结构，无糖基化等,使得外源蛋白与周围的杂蛋白或核酸等形成不溶解的聚合物，叫做。包涵体中的蛋白是没有生物活性的，在一定条件下，有些包涵体中的蛋白可以被“复性”，重新具有正常的蛋白活性。
基因工程中外源基因的高效表达:1)表达载体的优化:启动子的有效性与高效性，终止密码子的有效性，SD序列与起始密码子之间的距离等，另外使用高拷贝质粒有利于外源基因的高表达。（2）影响基因的转录的因素 a .启动子的强弱是控制外源基因表达效率的关键因素之一 b. 基因的阻遏子 载体中的阻遏基因应该是能够调控的，这样可以选择基因表达的最佳时机 c .原核增强子样序列 可以增强启动子的基因转录效率 d .转录终止子 3）影响翻译水平的因素 a 基因与核糖体的结合部位的调控――基因的SD序列、SD序列与起始密码子之间的距离以及密码子的偏爱性.b 基因翻译起始区二级结构对翻译起始的影响――提高翻译的起始效率和mRNA的稳定性.4.影响蛋白质水平的因素:防止蛋白质翻译出来之后被降解以及将蛋白质分泌到细胞外等（5）其他因素,如菌种、培养基条件、细菌的生长条件等。外源基因在真核细胞中的表达:属于穿梭质粒（1）在酵母细胞中的表达:优点 a 是单细胞生物，操作简单，易于生长。 b 具有真核细胞对蛋白质的加工翻译体系，表达产物与天然蛋白类似.基因克隆载体有五类：整合质粒（YIP），附加体质粒（YEP），复制质粒（YRP），有着丝粒的质粒（YCP），酵母人工染色体（YAC）2）外源基因在植物细胞中的表达:根癌土壤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）可以诱发裸子植物和双叶植物产生根瘤的细菌。将外源基因插入到质粒的特定的区域，再转化植物即可将外源基因转化到植物的染色体上，从而获得转基因植物3）外源基因在哺乳动物细胞中的表达:在哺乳动物中使用的表达载体一般都是由动物病毒载体改造而成，如SV40、逆转录病毒、腺病毒等。载体中的元件包括：原核生物的复制起点和选择标记、真核生物的表达控制元件、真核细胞中的复制和选择的遗传因子等。 基因治疗（gene therapy）就是向受体细胞内引入具有正常功能的基因，以纠正或补偿基因的缺陷，也可以利用引入的基因杀死体内病原菌或恶性细胞。真核在原核细胞中表达特点①原核细胞RNA转录酶不能识别真核细胞启动子→使用原核启动子②真核细胞基因前无SD序列→真核基因必须于原核载体SD序列之下③真核基因有内含子原核没有→真核基因在原核细胞中表达应使用cDNA④原核细胞无真核细胞的蛋白翻译后修饰体系→选用真核系统表达真核基因⑤真核蛋白会被原核细胞作为外源物降解→将目的基因与细菌结构基因相连构建成融合基因/选用缺陷相应蛋白酶的菌株做表达宿主⑥真核蛋白前有信号肽，原核细胞内不能正确切除导致不能形成正确的蛋白结构，形成没有生物活性的蛋白包涵体→用于在原核细胞中表达的真核基团必须删除自身信号肽的编码序列。
真核细胞在大肠杆菌中的表达1融合蛋白，条件①真核基因转录时OPR与原核基因的一定酶切位点相符合/原核启动子→SD序列→起始密码ATG→基因片段→真核结构基因=目的基因序列→原核终止密码子②真核基因OPR与原核的相符合匹配；特点①分子量较小的Pr以融合形式表达mRNA&表达产物稳定性↑②通过SD-AUG已固定，转录和翻译起始从大肠杆菌基因序列开始，可产生高水平融合蛋白③表达融合蛋白经化学处理或特异蛋白酶水解可切除氨基端原始多肽，得到有活性的真核天然蛋白分子，避免了在N末端带有起始密码子ATG编码的蛋氨酸。N端目的蛋白+6*His与镍柱中Ni成螯合物，亲和层稀2非~3分泌型，当Pr分泌到质周腔时可引导Pr穿过细胞膜，自身被信号肽酶水解释放出功能蛋白。外源蛋白稳定性↑分泌到质周腔或培养基中Pr免受宿主细胞PrE分解且有利于目的蛋白的纯化。蛋白质生物合成的机制Aa活化→起始→延伸→肽链终止和释放→新生肽的折叠和加工成熟。Aa活化即氨基酰-tRNA的合成：氨基酸+ATP-酶→氨基酰-AMP-E+Ppi（每活化一个Aa耗2ATP），氨基酰-AMP-E+tRNA→氨基酰-tRNA+AMP+E。其化学本质是在氨基酰转运合成酶催化下胞浆中的游离氨基酸与tRNA分子3’端-CCA-OH基团以酯键的形式共价结合形成氨基酰-tRNA。意义①每个Aa必接在tRNA上才可用于Pr合成②Aa与Pr间高能键用于Aa加入到新生肽链末端。起始①70s复合体分离成30s和50s②IF-1和IF-3与30s亚基结合③30s亚基与mRNA结合（16SRNA识别起始密码子前S-D序列）④IF-2与GTP结合再与30s亚基结合成一复合物⑤携起始Aa的tRNA与上述复合物结合，同时释放IF-3，由此形成30s起始复合物（含30s、mRNA、IF-1、IF-2、GTP、fMet-tRNAiMet）⑥50s亚基与30s起始复合物形成70s起始复合物，释放IF-1和IF-2，水解GTP。（起始tRNA位于P位，A位空等待下一个密码子）延伸①进位，氨酰-tRNA的结合：除起始Aa处所有携Aa的tRNA须与EF-Tu结合才能进入A位点。Tu与GTP结合成复合物，氨酰-tRNA与此复合物结合进入A位，GTP水解，EF-Tu-GDP离开70s核糖体，Tu-GDP经Ts和GTP结合而恢复成Tu-GTP准备结合下一氨酰tRNA②转肽，肽键的形成：AP位Aa之间形成肽键，P位上tRNA卸载，A位上tRNA携一2肽，23srRNA催化③移位：GTP水解，核糖体构象改变，EF-G使核糖体向3’方向移动一个密码子距离，原来P位上空载的tRNA移至E位离开核糖体，原A上携2肽移至P，A空终止&释放，3个终止因子/释放因子水解多肽酶末段肽-tRNA间键，将最后的tRNA和多肽链释放，70s复合物解离成30s和50s亚基准备新一轮合成。RF1识别UAG&UAA，RF2识别UGA&UAA。
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