反转录dntp用地浓度对实验会有影响吗_百度知道
反转录dntp用地浓度对实验会有影响吗
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2．10 增加RT-PCR特异性第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法,可以特异性地同RNA目的序列杂交,分离poly(A)+RNA会导致样品间mRNA丰度的波动变化,而从大鼠脾脏中提取的RNA：DNA复合物中的RNA链：破碎组织→分离RNA→沉淀RNA→洗涤RNA→融解RNA→保存RNA破碎组织和灭活RNA酶可以同步进行,会减少RNA制备物中沾染的基因组DNA.RT-PCR产物的大小受限于逆转录酶合成cDNA的能力,从而释放结合的可以降解RNA的RNase,各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类.它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性;端而不影响特异性,从事RNA探针工作的研究者经常使用RNase H.要表达真核生物的基因并表达出相应的蛋白,然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA.*配制溶液用的乙醇,可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环.不能高压灭菌的试剂.而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶,避免共用器具如滤纸.理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火,从而使信息的检出和定量产生偏差.因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％,可以将RNA&#47.1．5 RNA提取的一般步骤RNA提取的一般步骤是.5μg oligo(dT),据认为cDNA合成反应中的RNA会阻止扩增产物的结合,防止高温时所发生的依赖于镁离子的RNA水解.在两步法RT-PCR中.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意.为了增加贮存RNA样品的稳定性.对于某些模板.* 避免引物对3&#39,然后再根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环.外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗,为了成功进行RT-PCR,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果,将退火温度设定为比最低的Tm低5℃.引物的稳定性依赖于储存条件.对于部分扩增对象.如果两个引物Tm不同,RNaseH处理是必需的,长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感.从大鼠肝脏中提取的RNA.RNaseH-的逆转录酶可以显著提高长RT-PCR产物的产量.2．5 提高逆转录保温温度较高的保温温度有助于RNA二级结构的打开,会用到RNA提取和RT-PCR技术.对这种困难模板,当分析稀有mRNA时,因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖.在实验中;末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA,几乎能完全抑制RNA酶的活性.使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度转换、蛋白酶K等破碎组织.*操作过程中应始终戴一次性橡胶手套和口罩.退火温度一般设定比引物的Tm低5℃.可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性.多数厂家供应的无菌塑料制品很少有RNase污染,在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白、RNA提取之前需要注意和准备的工作*尽可能在实验室专门辟出RNA操作区;端和中间区为G或C的引物.这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性,以防止手.cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行.RNA存在于水样层中.来源于cDNA的PCR产物会比来源于沾染的基因组DNA的产物短、Tris等应采用未开封的新瓶装试剂,而且塑料手套的多出部分常常将器具有RNase处传递到RNase-free处.1pg总RNA.例如,加入β-ME可以抑制RNA酶活性；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶.然而某些模板仍然会存在二级结构、获取能够编码真核生物蛋白的基因.1．2 RNA提取的最大影响因素-RNA酶在所有RNA实验中.这有助于防止低温时分子间碱基配对.合理的退火温度从55℃到70℃,RNA酶催化的反应一般不需要辅助因子.乙醇沉淀能析出中间层的DNA.设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列,然后分再装到每一管）,洗涤之后可以晾干或者烤干乙醇,试图获取目的蛋白的思路是行不通的,以减少非特异性结合、唾液等；⑹70度10分钟结束反应（此处是灭活酶活性;ml,如煮沸.2）或异丙醇,加入1uL AMV-RT反转录酶,从而使引物可以结合,无RNase糖元的建议浓度为250μg&#47?因为真核生物的基因含有大量的非编码区、tubes等,更灵敏,因为cDNA合成前的过程会使抑制剂变性、高压灭菌等.* 选择GC含量为40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物.由于RNA酶广泛存在而稳定,在本身的聚合酶活性之外,这会形成引物二聚体,RNase抑制剂1uL,在室温（15℃到30℃）最多可以保存2个月;端所发现的poly(A)尾杂交.来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年,随时可能将RNA降解.0mM EDTA中65℃保温10分钟以终止DNaseⅠ消化.*氧钒核糖核苷复合物.3&#39.然后用高压灭菌除去残留的DEPC,然后经0.干粉引物可以在-20℃保存至少1年：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀.*塑料器皿可用0,以保证引物同目的序列有效退火.当准备使用RNA时.2．3 RT-PCR的引物设计RT-PCR引物设计和一般PCR引物设计可以遵循同样的原则,最关键的因素是分离得到全长的RNA.这些外源性的RNA酶可污染器械.以大于10μM浓度溶于TE的引物在-20℃可以稳定保存6个月.* 设计5&#39.真核生物的基因组是DNA.将样品在2；⑵70度水浴5分钟.设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T,以防交叉污染.逆转录反应可以使用逆转录酶.洗涤RNA使用70％乙醇洗涤.可以在加入Trizol的同时加入无RNase的糖元.为了将扩增的cDNA同沾染的基因组DNA扩增产物分开.对于小于50mg的组织或106个培养细胞的样品.1．6RNA抽提新方法-TRIZOL法TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂,在没有缓冲液或盐的条件下,确保引物的Tm值与预计的保温温度相同.RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行.1．RNA的提取RNA的提取其实原理很简单.另外.如果使用GSP,并降解RNA,B,Tm会差异很大.2．RT-PCRRT-PCR是指将逆转录(Reverse Transcription、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNase带入各种容器内或污染用具.热稳定逆转录酶可以在较高温度保温以增加反应严谨性.2．6 促进逆转录的添加剂包括甘油和DMSO在内的添加剂加到第一链合成反应中,逆转录和PCR在同时为逆转录和PCR优化的条件下,经过此步.*关于一次性塑料制品,这样通常可以消除RNase的活性.在除去水样层后.如果1&#47.尽量避免使用一次性塑料手套,适用于较高的保温温度.随机引物法是三种方法中特异性最低的.1．1 分离高质量RNA成功的cDNA合成来自高质量的RNA,这会破坏引物退火稳定性.TRIZOL是有毒物,但是应该对其进行互补性和内部二级结构的检测,又对RNA酶有强烈的变性作用、塑料制品,保证序列独特性,一旦接触皮肤后立即以大量的洗涤剂和清水清洗.一般当扩增较长的全长cDNA目标模板时.AMV也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性.*其它,往往由于二次污染而带有RNase.用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计,再浸泡在3% H2O2 室温10min、NP-40,因为获取的DNA里面会含有非编码区;末端存在互补序列,最低可以达到0,这就会消除较低温度时产生的非特异性产物,需要设计多于一个反义引物,RNaseH处理可以增加灵敏度.当计算引物Tm值时并不包括这些序列.保存RNA应该尽量低温.另外.因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA,C对RNA的降解,最多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影响或MMLV的活性.在RNA分离过程中加入的作为载体的糖元有助于增加小量样品的产量、电泳槽.或者为了提高特异性,这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA：* 典型的引物18到24个核苷长.为了避免产生于基因组DNA的产物,比如低拷贝的,再经过沉淀,降低了cDNA合成的产量和长度、构建cDNA文库,尤其是克隆较大的cDNA时,使其失活.RNA操作区应保持清洁,oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化.融解RNA一般使用TE,而且比短序列杂交慢,但在室温（15℃到30℃）仅能保存不到1周,dNTP 2uL（这些应该先配好,但是不能过于干燥：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂,应该使用有较高热稳定性的逆转录酶.2．8 小量RNA检测方法的提高当仅有小量RNA时.对于多数RT-PCR反应.为获得最大的特异性,为避免RNA被洗掉,如Trizol,或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火,晾干,只能通过提取其mRNA并RT-PCR这条颇费周折的途径、SDS.然而.2．2 RT-PCR的步骤⑴在冰浴离心管里面加入模板RNA 4uL.细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步.22μm滤膜过滤除菌：DNA复合物中的RNA水解掉.1．4 防止RNA酶污染的措施.2．1 RT-PCR的原理RT-PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起.为获得最佳结果.引物在整个转录本的多个位点退火：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白.Tm对于设定PCR退火温度是必需的.*有机玻璃的电泳槽等、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用.RT-PCR比其他包括Northern印迹,所以RNA的制备与分析操作难度极大,乙醇干燥,如果一个GSP退火温度为55℃,然后用0,双蒸水冲洗,这些编码区叫做外元（exon）.根据所使用的公式及引物序列的不同,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染.在理想状态下：由氧化钒离子和核苷形成的复合物.一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作,因此尽管使用了这些抑制剂.然而某些特别的逆转录酶可以在50℃或更高进行反应,从而降低了产量.因为大部分公式提供一个估算的Tm值.而这些污染了的器具是RNA操作的大敌,每一步都在最佳条件下进行,建议保存在2-8°C的环境下,扩大污染.为了获得最长的cDNA.引物需要足够长、硫氰酸胍.塑料手套不仅常常给操作带来不便.收集上面的的水样层后.2．11 提高逆转录保温温度为了充分利用GSP特异性的全部优点.使用较好的RNA分离方法;末端富含GC,RNaseH的处理加强了或AMV合成的cDNA所产生的信号.2．9 一步法同两步法RT-PCR的比较两步法RT-PCR比较常见.4％,退火温度足够低.* 避免3&#39,那甘油在扩增反应中的浓度为0、试剂等均应专用,如EDTA或SDS；⑶加入5×反应液4uL.目的序列上并不存在的附加序列.尽管如此.*RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）,因为其热稳定性较好,在这种情况下.2．12 减少基因组DNA污染RT-PCR所遇到的一个潜在的困难是RNA中沾染的基因组DNA,混匀.2．4 引物退火温度引物的另一个重要参数是熔解温度（Tm）.为了防止痕量RNase的污染,产生短的,此步可以省掉,一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成.开始低于估算的Tm 5℃,可以加入10％的甘油并在45℃保温、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,以2℃为增量,并加入预热的2×的反应混合物提高特异性（cDNA热启动合成）,也要小心不要从手指上引入RNase,而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火.3M,可以用盐酸胍,因为95℃保温的PCR变性步骤一般会将RNA,也可存在于灰尘中.它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性,比MMLV和AMV能得到更多量和更多全长,混匀.使用PCR仪可以简化RT-PCR所需的多种温度切换,可以加入到引物5&#39,在水中保存3年仍保持稳定,可以和多种RNA酶结合、异丙醇,所以反应可以在高于正常的37-42℃的温度下进行,为什么不直接从DNA PCR得到我们需要的基因呢,所以实验中有很多地方需要注意、离心机等的污染.较高的保温温度也可以增加特异性,就会由于在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始,对于长期贮存更是如此,经过剪切和拼接,cDNA的数量和复杂度要少得多,并经常更换、移液器.而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染、T1等,在缓冲液和还原剂（如DTT）存在的条件下加入;引物混合物直接从65℃变性温度转移到逆转录保温温度,从而抑制酶的活性,降低了特异性,去离子水5uL.用DEPC等处理的塑料制品.所以.*所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间.不管起始模板是总RNA还是poly(A)+ RNA,GSP所带有的特异性就没有完全利用.在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染.建议每20μl反应体系使用0,增加了反应的产量,可以消除大多数二级结构、3M NaAc（pH-5.GSP是反义寡聚核苷,需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例；⑸37度水浴1小时（此步是反转录过程）,故不能使用）.共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用,样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原.较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成,引物2uL,为达到最佳效果.糖元是水溶性的、研究人员的手及各种试剂,RNaseH处理是可选的,RNA一般分布于上层,晾干.* 避免存在可能会产生内部二级结构的序列,可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中,有助于减少残余污染;端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸.一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法.基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物.应将干粉和溶解的引物储存在-20℃.除了使用较高的逆转录温度外：逆转录酶催化RNA转化成cDNA,会导致灼伤,可先用去污剂洗涤.Oligo(dT)起始比随机引物特异性高,那么如果使用AMV或M-MLV在低严谨性的37℃进行逆转录.一般不必使用oligo(dT)选择性分离poly(A)+RNA、获得RNA病毒基因时,在水中贮存一个星期就基本降解了.RNaseH-的MMLV逆转录酶及RNaseH-的AMV,可耐受多种处理而不被灭活.真核生物的DNA转录成为RNA之后,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制.这使得在较为严谨的条件下可以获得目的模板的部分拷贝.GSP可以同与mRNA3&#39.比如,而设计失败的引物则各有各的缺点,如限制位点和启动子序列,可以设计分别同分开的外显子退火的引物.较长的序列可能会与错误配对序列杂交,可以使用下列方法沉淀RNA.分离RNA一半用酚,否则不易溶解,冰浴30秒（此处是为了使引物和模板正确配对）.这种方法经常用于获取5&#39,混匀；⑷37度水浴5分钟,由mRNA再翻译成蛋白质,在操作过程中极有可能造成移液器,离心,在一只管中顺次进行,poly(A)+RNA会增加检测的灵敏度、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术.一步法可以得到更高的灵敏度.蛋白RNase抑制剂仅防止RNase A,抑制扩增.RNaseH活性同聚合酶活性相互竞争RNA模板与DNA引物或cDNA延伸链间形成的杂合链,因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合.引物对的Tm差异如果超过5℃,更易于操作.*异硫氰酸胍.加入氯仿后离心,真正编码蛋白的区段是被这些内元隔开的,这是因为整个cDNA样品都被扩增,可以同RNA保持在水相中以辅助随后的沉淀;最末端退火的扩增引物序列相同,离心机;10的逆转录反应产物加入到PCR中.为了在逆转录反应中最大限度提高RT-PCR的灵敏度.RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量,买来后可直接用于RNA操作,离心3-5秒,都具有内源RNaseH活性,将RNA和引物在65℃保温.因此消除或大大降低逆转录酶的RNaseH活性将会大有裨益,才形成成熟的mRNA.*尽量使用一次性的塑料制品：加入NaAc至0,所有退火温度只是一个起始点,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活,存于-70℃;引物混合物从65℃变性温度转到逆转录保温温度.RT-PCR灵敏度会受cDNA合成量的影响,样品分成水样层和有机层.TRIZOL在室温下能稳定保存12个月.ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20、玻璃制品.RT-PCR的模板可以为总RNA或poly(A)+选择性RNA,以随机引物.oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR.2．7 RNaseH处理在PCR之前使用RNaseH处理cDNA合成反应可以提高灵敏度,加入少量异戊醇.对于成功的一步法RT-PCR：通过变性剂破碎细胞或者组织,不管是M-MLV还是AMV,从而导致实验失败,在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用.*配制的溶液应尽可能的用0.这是当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,尤其是当使用基因特异性引物（GSP）进行cDNA合成时：SDS.RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,产物置冰上进行下一步PCR实验.在一步法RT-PCR中.因为其较高的特异性,称为内元（intron）,同时还要足够高,克隆再表达,在37℃处理12hr以上,所以与使用随机引物相比,并定期进行除菌：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂.* 避免3&#39,如果直接从真核生物的基因组DNA获取目的基因,最后溶解.高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂.对于多数RNA模板.1% DEPC,这不足以抑制PCR.1．3 常用的RNA酶抑制剂*焦碳酸二乙酯（DEPC）.它同大多数真核细胞mRNA 3&#39.EDTA可以螯合镁离子.使用无RNaseH活性（RNaseH-）的逆转录酶.这种方法有助于防止较低温度时所发生的分子间碱基配对.随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始.建议在20μl的第一链合成反应体系中使用1pmol反义GSP,洗涤,从富含RNase的样品（如胰脏,稍有疏忽就会前功尽弃.在逆转录反应中经常加入RNase抑制剂以增加cDNA合成的长度和产量.用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物；RT)反应和PCR (Polymerase Chain Reaction)反应组合在一起的方法.被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物.然而一步法RT-PCR具有其他优点,可以在逆转录之前使用扩增级的DNaseⅠ对RNA进行处理以除去沾染的DNA,同时增加了热稳定性,逐步提高退火温度.因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解;10的反应产物进行PCR.设计理想的引物都有以下共同的特点.另外,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原.但是由于RNA酶无处不在,并不能防止皮肤上的RNase.*无法用DEPC处理的用具可用氯仿擦拭若干次,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性,接触皮肤或者不慎吞服、尿素,都可以检测到扩增结果、氯仿等有机溶剂,然后取出1&#47.RNase抑制剂要在第一链合成反应中,两个引物应具有近似的Tm值,可以减低核酸双链的稳定并解开RNA二级结构,部分长度的cDNA;末端的错误配对,避免对后续实验产生干扰）,RT-PCR尤其具有挑战性.不要在高于60℃时使用oligo(dT)和随机引物,即使热变性后也是如此,建议使用厂家供应的出厂前已经灭菌的tips和tubes等,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,所以模板一般选用poly(A)+RNA.但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性.RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值.沉淀RNA一般用乙醇,000×g离心5分钟,余下的-70度保存、RNase保护分析.1% DEPC水冲洗.随机引物需要在增加到60℃前在25℃保温10分钟,12,与蛋白层分开,有时,还可以通过直接将RNA&#47,去掉这些非编码区,然后迅速置于冰上冷却.在无逆转录时所得到的PCR产物来源于基因组.另外对每个RNA模板进行一个无逆转录的对照实验、tips,以确定一个给定片段是来自基因组DNA还是cDNA,提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法在做Northern等杂交实验
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摘要 : DNase I，即Deoxyribonuclease I，中文名称为脱氧核糖核酸酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I水解单链或双链DNA后的产物，5'端为磷酸基团，3'端为羟基。
DNase I可以将DNA链消化成寡脱氧核苷酸，因此常常用于过程中消化掉提取核酸中所残留的DNA成分而得到高纯度的RNA产物。
DNase I，即Deoxyribonuclease I，中文名称为酶I，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。DNase I水解单链或双链DNA后的产物，5'端为磷酸基团，3'端为羟基。
DNase I活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点;二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个突出的粘末端。
特点：不含RNase(RNase free)，可以用于各种RNA样品的处理。提供了用于DNase I失活所需的。
用途：制备不含DNA的RNA样品;RT-PCR反应前RNA样品中去除等可能的DNA污染;体外T7, T3, SP6等RNA Polymerases催化的RNA转录后去除DNA模板; DNase I footprinting研究DNA-蛋白质相互作用;缺口平移(nick translatioin);产生DNA随机片断文库;细胞凋亡TUNEL检测中部分剪切基因组DNA作为阳性对照。
来源：从牛胰腺纯化得到。
：约32kDa(单体)。
活性定义：37℃10分钟内，将能够完全降解1&g pBR322所需的酶量定义为1个活性单位。
活性检测条件：40mM Tris-HCl(pH8.0)，10mM MgSO4，1mM CaCl2，1&g of pBR322 DNA。
纯度：不含其它DNA内切酶和外切酶，不含RNA酶。
酶储存溶液：50mM Tris-acetate(pH7.5)，10mM CaCl2，50%(v/v)glycerol。
Reaction Buffer(10X)：100mM Tris-HCl(pH7.5 at 25℃)，25mM MgCl2，1mM CaCl2。
失活或抑制：加入EDTA至终浓度为2.5mM后，65℃加热10分钟可使DNase I失活。酚氯仿抽提也可以使DNase I失活。金属离子螯合剂，达到毫摩尔/升浓度的锌离子，0.1%的SDS，DTT、巯基乙醇等还原剂，50-100mM以上盐浓度均对DNase I有显著抑制作用。
使用说明：
1. RT-PCR反应前RNA样品中DNA的去除：
a. DNA模板限制性核酸内切酶作用后线性化。酚/氯仿和氯仿/异丙醇提取DNA，用乙醇沉淀后，溶于适量
的无菌去离子水中。
b. 向一无RNA酶的EP管中依次加入下列试剂：
Reaction Buffer (10X)
补充经DEPC处理的去离子水
DNase I(1U/&l)
注意：如需处理较大量的RNA样品，可以按照比例放大上述反应体系。如果能在上述反应体系中加入
适量Ribonuclease inhibitor以防止RNA降解则更佳。
c. 37℃孵育30分钟。
d. 向上述反应体系中加入1&l 25mM EDTA，65℃孵育10分钟以失活DNase I。注意：在没有鏊合剂如
EDTA等存在情况下加热，RNA可被水解。
e. 上述加热处理过的RNA样品即可直接用于处理好的RNA可用作RT-PCR反应的模板。
2. 体外RNA反转录后模板DNA的去除：
a. 在每含有0.5&g模板DNA的反转录反应体系中加入1U DNase I。注意：在某些情况下，模板DNA完全消
化所需的DNase I的量需通过实验进行摸索。
b. 37℃ 孵育15分钟。
c. 酚/氯仿抽提失活DNase I。
3. 缺口平移进行DNA标记：
a. 参考下表格设置反应体系：
Reaction Buffer (10X) for DNA Polymerase I
3 dNTP Mixture (1mM each, without the labeled dNTP) *
[&-32P]-dNTP, ～110TBq/mmol (3000Ci/mmol)
1.85-3.7MBq (50-100&Ci)
DNase I (freshly diluted to 0.002U/&l)**
DNA Polymerase I, E.coli
0. 5-1.5&l (5-15U)
Template DNA
补充无核酸酶去离子水
* 3 dNTP Mixture(1mM each, without the labeled dNTP)：分别取除已经标记的dNTP外的3种dNTP
(100mM)各1&l加入到97&l 的无核酸酶的去离子水中混匀即可。例如标记的为dATP，则需混合
dTTP、dCTP和dGTP三种dNTP至每种的最终浓度为1mM。配制好的dNTP可存放于-20℃以备后续使
** DNase I可以用1X Reaction Buffer for DNA Polymerase I进行稀释。
Reaction Buffer(10X)for DNA Polymerase I：500mM Tris-HCl(pH7.5 at 25℃)，100mM MgCl2，
10mM DTT。
b. 立即15℃孵育15～60分钟。
c. 上述反应体系中加入1&l of 0.5M EDTA(pH 8.0)终止反应。
d. 从中取出少量例如1&l检测标记效率。通常标记效率至少可以达到108cpm/&g DNA。
e. 可用Sephadex G-50或Bio-Gel P-60去除[&-32P]-dNTP，以纯化获得标记的DNA。
4. DNase I也可用于其他途经，但使用方法均与上述讲述类似，可以参考上述用途进行。
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看错说明书，把DNaseI漩涡震荡混匀了怎么办，会对RNA提取有多大影响？
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酚氯仿抽提也可以使DNase I失活。金属离子螯合剂&#57347。DNase I才会失活或者被抑制&#mM以上盐浓度均对DNase I有显著抑制作用.1%的SDS达到毫摩尔/升浓度的锌离子&#57347、巯基乙醇等还原剂0;DTT理论上不会有影响的.5mM后65℃加热10分钟可使DNase I失活，只有在这样的条件下：加入EDTA至终浓度为2
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