表达草兔卵透明带2和3基因的分析--《西北农林科技大学》2015年硕士论文
表达草兔卵透明带2和3基因的分析
【摘要】：草兔啃食破坏农作物及苗木,随着数量剧增,危害我国生态系统并损害人类的利益,因此被视为有害脊椎动物。合适的生殖相关抗原将有利于实现免疫不育控制草兔数量。哺乳动物的卵透明带蛋白具有极强抗原性,产生的抗体可以有效阻碍精卵结合。为了探究草兔卵透明带2蛋白抗原性,以及定位抗原表位。根据GenBank上欧洲兔的卵透明带2(ZP2)基因序列,设计5′端磷酸化的反转录引物用于合成特异cDNA作为模板,通过普通PCR扩增草兔ZP2 cDNA。测序获得的2184bp序列比对成功后,预测其信号肽和跨膜区域分别位于ZP235-56和ZP。去除信号肽与跨膜区域的1,716bp ZP2f基因连入pET-28a(+)的SacI和XhoI酶切位点之间,将克隆获得954bp的hZP2基因连入pET-28a(+)的EcoRI和XhoI酶切位点之间,成功构建了重组原核表达载体pET-28a-ZP2f和pET-28a-hZP2后分别转化E.coli BL21。经优化诱导表达体系后,最终确定最佳诱导重组大肠杆菌表达ZP2f的条件是:在加入1.2 mM IPTG的培养基中,28℃下培养8h;hZP2最适的诱导条件是37℃下0.7mM IPTG诱导15h。重组的E.coli BL21经诱导后表达68.46 kDa可溶性的ZP2f融合蛋白、41.17kDa可溶性的hZP2融合蛋白,经Western blot鉴定,结果表明相对于表达大片段ZP2f基因,hZP2融合蛋白表达量明显提高。将2,194bp的ZP2基因插入pEGFP-N1载体中获得pEGFP-N1-ZP2真核表达载体,转染RK13细胞后更换加有G418的培养基培养14天筛选抗性细胞。在倒置荧光显微镜下筛选稳定的抗性细胞,以获得能够稳定发荧光的重组RK13细胞。提取该重组RK13细胞基因组DNA,通过PCR与测序证实了发生自发重组使得ZP2基因连同GFP基因成功插入RK13细胞基因中;提取重组RK13细胞总RNA,通过RT-PCR与测序验证了ZP2成功转录;同时在SDS-PAGE胶上和Western blot膜上都有同ZP2蛋白相近大小条带。这些结果进一步证实ZP2基因位于重组SFV基因组中启动子后并且获得表达。由于大量表达外源蛋白会阻碍细胞生长,有些细胞会出现ZP2基因缺失,导致该重组细胞荧光较弱。本实验将草兔ZP3基因连入载体pSC11成功获得pSC11-ZP3穿梭载体;通过转染,将穿梭载体转入已感染肖普纤维瘤病毒(SFV)的兔肾脏细胞(RK13)中。在已感染RK 13细胞中,SFV病毒与穿梭载体间在共同拥有的胸苷激酶处发生同源重组,将ZP3基因连同穿梭载体上的标记基因lacZ重组到SFV病毒的基因组中。在加有X-gal培养基中,重组成功的SFV病毒因为能够表达lacZ基因,使得被感染的RK13细胞显蓝色,经过多次挑选蓝色细胞并反复冻融细胞使其裂解,最终获得足够纯净的重组SFV病毒。提取重组SFV病毒基因组DNA作为模板,通过PCR方法扩得同ZP3分子大小相近条带并测序后,结果显示基因序列同ZP3基因一致;通过RT-PCR也证实了重组SFV能够转录ZP3;在SDS-PAGE胶上和Western blot膜上都有同ZP3蛋白相近大小条带。最终通过噬菌斑方法测定重组SFV病毒效价为4.2×107 pfu/mL。这些结果进一步证实ZP3基因存在重组SFV基因组中,且能够大量表达。
【关键词】：
【学位授予单位】：西北农林科技大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2015【分类号】：S764.5【目录】：
摘要6-8Abstract8-12第一章 文献综述12-22 1.1 草兔简介及其危害现状12 1.2 免疫不育技术12-13 1.3 卵透明带简介与研究进展13-15 1.4 痘病毒简介15-17 1.5 抗原传递载体肖普纤维瘤病毒17-18 1.6 穿梭载体pSC1118-19 1.7 基因表达系统19-20 1.8 研究目的与意义20-21 1.9 研究的主要内容21-22
1.9.1 草兔ZP2基因克隆，原核和真核表达21
1.9.2 构建能够表达草兔ZP3基因的重组肖普纤维瘤病毒21-22第二章 材料与方法22-37 2.1 材料22-23
2.1.1 实验动物22
2.1.2 菌株与质粒、细胞与病毒22
2.1.3 主要试剂22
2.1.4 主要仪器22-23 2.2 试验方法23-37
2.2.1 实验一草兔ZP2基因克隆，原核和真核表达23-33
2.2.1.1 草兔卵巢总RNA的提取、纯化及检测23-25
2.2.1.2 cDNA第一链的合成及环化25
2.2.1.3 草兔ZP2基因克隆25-26
2.2.1.4 草兔ZP2基因原核表达载体的构建26-27
2.2.1.5 草兔ZP2基因在E.coli BL21中的诱导表达体系优化及其鉴定27-28
2.2.1.6 草兔ZP2基因真核表达载体的构建28-29
2.2.1.7 含草兔ZP2基因的RK13细胞筛选及纯化29-31
2.2.1.8 稳定荧光RK13细胞中ZP2基因的存在与转录检测31-32
2.2.1.9 稳定荧光RK13细胞中ZP2基因的表达情况检测32-33
2.2.2 实验二构建能够表达草兔ZP3基因的重组肖普纤维瘤病毒33-37
2.2.2.1 重组草兔ZP3-His cDNA克隆33
2.2.2.2 重组穿梭载体pSC11-ZP3-His的构建33
2.2.2.3 重组SFV的构建33-35
2.2.2.4 重组SFV中ZP2基因的存在、转录以及表达检测35-36
2.2.2.5 重组SFV病毒滴度的测定36-37第三章 结果与分析37-54 3.1 实验一草兔ZP2基因克隆，原核和真核表达37-47
3.1.1 草兔ZP2基因克隆37-38
3.1.2 草兔ZP2基因序列的生物信息学分析38-39
3.1.3 重组原核表达载体pET-28a-hZP2、pET-28a-ZP2f的鉴定39-40
3.1.4 ZP2f、hZP2基因的诱导表达体系优化40-44
3.1.5 hZP2基因表达产物的Western blot检测44-45
3.1.6 重组真核表达载体pEGFP-N1-ZP2的鉴定45
3.1.7 重组RK13细胞的筛选45-46
3.1.8 重组RK13细胞的分析46-47 3.2 实验二构建能够表达草兔ZP3基因的重组肖普纤维瘤病毒47-54
3.2.1 重组草兔ZP3-His cDNA与氨基酸序列分析47-48
3.2.2 重组pSC11-ZP3-His穿梭载体的分析48-50
3.2.3 构建重组SFV的分析50-52
3.2.4 重组SFV效价测定52-54第四章 讨论与结论54-58 4.1 讨论54-56
4.1.1 实验一草兔ZP2基因克隆，原核和真核表达54-55
4.1.2 实验二构建能够表达草兔ZP3基因的重组肖普纤维瘤病毒55-56 4.2 结论56-58
4.2.1 实验一草兔ZP2基因克隆，原核和真核表达56
4.2.2 实验二构建能够表达草兔ZP3基因的重组肖普纤维瘤病毒56-58参考文献58-65致谢65-66作者简介66
欢迎：、、)
支持CAJ、PDF文件格式
【参考文献】
中国期刊全文数据库
张仁舟;杨松涛;夏咸柱;;[J];动物医学进展;2009年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库
黄维金;朱蓉;赵晨燕;徐静;万延民;齐影;刘强;王文波;温智恒;周艳;孟淑芳;俞永新;王佑春;;[J];中国生物制品学杂志;2012年09期
刘振江;刘昊;刘燕瑜;郭欢欢;凡敏;岳云强;陆飞;秦艳青;李国江;鲁会军;金宁一;;[J];中国动物传染病学报;2011年06期
肖朋朋;刘昊;阎富龙;陈智飞;朱羿龙;辛舒;王茂鹏;靖杰;鲁会军;金宁一;;[J];中国病原生物学杂志;2014年07期
中国重要会议论文全文数据库
黄维金;朱蓉;赵晨燕;李媛媛;万延民;齐影;刘强;王文波;温智恒;周艳;孟淑芳;王佑春;俞永新;;[A];2012年中国药学大会暨第十二届中国药师周论文集[C];2012年
中国博士学位论文全文数据库
梁硕;[D];吉林大学;2011年
文波;[D];吉林大学;2013年
中国硕士学位论文全文数据库
郭臻;[D];华中师范大学;2011年
于倩;[D];华中师范大学;2010年
刘振江;[D];吉林农业大学;2012年
梁余培;[D];浙江理工大学;2013年
武存霞;[D];南京农业大学;2013年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库
王文玲;黄保英;邓瑶;王秀平;谭文杰;阮力;;[J];病毒学报;2007年05期
【相似文献】
中国期刊全文数据库
;[J];生物技术通报;1992年03期
王尽淘;[J];农药译丛;1999年03期
;[J];生物技术通报;1998年04期
;[J];生物技术通报;1991年04期
;[J];生物技术通报;1991年11期
;[J];生物技术通报;1994年04期
;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库
胡风庆;;[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年
郑玉姝;智海东;王云峰;仇华吉;童光志;赵宏坤;;[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
吴小锋;曹翠平;姚慧鹏;鲁兴萌;Mark R;[A];中国蚕学会第四届青年学术研讨会会议论文集[C];2004年
吴小锋;曹翠平;鲁兴萌;;[A];中国蚕学会第七届二次理事会暨学术年会论文集[C];2005年
朱家源;毕良宽;朱斌;唐冰;李爽;刘阳;薛春利;蔡浩;;[A];第八届全国烧伤外科学年会论文汇编[C];2007年
言慧;陈晓光;;[A];中国动物学会第七届全国青年寄生虫学工作者学术讨论会论文摘要集[C];2002年
马兴元;;[A];新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展（下册）[C];2001年
尹清强;韩彪;康相涛;;[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会——第九届学术研讨会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库
李云亮;[D];江苏大学;2015年
王志伟;[D];中国科学技术大学;2006年
肖璐;[D];四川大学;2005年
夏东翔;[D];第四军医大学;1990年
曹慧颖;[D];中国农业科学院;2005年
轩辕铮铮;[D];南开大学;2010年
高正伦;[D];吉林大学;2007年
董丽;[D];中国农业大学;2015年
张开泰;[D];中国人民解放军军事医学科学院;1999年
刘松财;[D];吉林大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库
周智敏;[D];西北农林科技大学;2015年
赵蕾;[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
苏佳;[D];吉林大学;2007年
任艳丽;[D];河南农业大学;2004年
刘芳;[D];重庆医科大学;2005年
赵检;[D];华中农业大学;2011年
张虎;[D];苏州大学;2004年
周旭;[D];中国人民解放军军事医学科学院;2003年
晁叶青;[D];中国海洋大学;2008年
范守城;[D];重庆大学;2004年
&快捷付款方式
&订购知网充值卡
400-819-9993
《中国学术期刊（光盘版）》电子杂志社有限公司
同方知网数字出版技术股份有限公司
地址：北京清华大学 84-48信箱 大众知识服务
出版物经营许可证 新出发京批字第直0595号
订购热线：400-819-82499
服务热线：010--
在线咨询：
传真：010-
京公网安备75号身体成梭型这种体形的意义减少游泳时的阻力．（2）若用解剖剪剪去结构[6]，将会暴露出的结构是鳃该结构的主要部分是鳃丝，其主要功能是进行气体交换．（3）根据图二写出有关数字所指部位的名称：家兔的神经系统是由[1]大脑、[2]脊髓和[3]神经组成的．（4）家兔适于吃植物性食物的特点是门齿适于切断植物纤维，臼齿适于磨碎食物，并且有特别发达的盲肠来消化植物纤维．（5）家兔的心脏和人的心脏结构相似，具有四腔，体内有两条循环路线．输送氧气的能力很强，有利于体内物质的分解，为身体提供足够的能量．
鱼生活在水中，兔生活在陆地上，它们分别有许多适于生活环境的结构特点。下面列举了部分内容，请据图回答问题：⑴从图一中可以看出鲫鱼的外形特点是              这种体形的意义                。⑵若用解剖剪剪去结构[6]，将会暴露出的结构是  ????        该结构的主要部分是   ???????       ，其主要功能是?????????????????? 。(3)根据图二写出有关数字所指部位的名称：家兔的神经系统是由[? ]        ??   、[? ]      ??    和[? ]    ???     组成的（4）家兔适于吃植物性食物的特点是   ????      适于切断植物纤维，     ??    适于磨碎食物，并且有特别发达的 ?????       来消化植物纤维。（5）家兔的心脏和人的心脏结构相似，具有四腔，体内有两条循环路线。输送  ?      的能力很强，有利于体内物质的分解，为身体提供足够的能量。 
精英家教网新版app上线啦！用app只需扫描书本条形码就能找到作业，家长给孩子检查作业更省心，同学们作业对答案更方便，扫描上方二维码立刻安装！
请输入姓名
请输入手机号我相信缘，也相信分，也相信缘分，也相信有缘无分
视频地址复制
Flash地址复制
Html地址复制
离线看更方便
用或其他应用扫描二维码
好萌的兔子，好想养一只
新浪微博//profile?topnav=1&wvr=6&is_all=1
广播电视节目制作经营许可证：（沪）字第1248号
| 网络文化经营许可证：沪网文[6号 | 信息网络传播视听节目许可证：0910417 | 互联网ICP备案：沪ICP备号-3 沪ICP证：沪B2- | 违法不良信息举报邮箱： | 违法不良信息举报电话：转3
网上有害信息举报专区： |