荧光光谱法的绿色荧光蛋白激发波长长的选择

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-05-04 06:47 标签： 绿色荧光蛋白激发波长
荧光化合物的检测 - 色谱世界
荧光化合物的检测
【】【】【引用网址】http://www.chemalink.net/books/C/506/0.html
&&& 在荧光化合物的高灵敏度检测中，获取检测的最佳激发波长和发射波长是至关重要的。如果没有其它因素的干扰，荧光化合物的最佳激发和发射波长可以通过该化合物的激发和发射光谱获取，而且荧光化合物的激发和发射光谱能提供一定的定性依据。但是，在液相色谱的分离检测过程中，还不能做到对色谱峰的激发和发射光谱的在线采集。&&& 对于复杂组分的测量，为了获得最灵敏的检测，可以采取的办法是使用具有光谱扫描功能的荧光分光检测器，两次进样。第一次进样、激发波长选在低波长UV区，发射波长为一个光谱范围。大多数荧光化合物在低波长UV区有较强的吸收，此波长下收集发射光谱已够用。例如：在Ex=260nm，一次进样15 种多核芳烃（PNA）混合物，采集Em为300nm-600nm 的所有化合物的发射光谱。从这些化合物的发射光谱，可以确定检测的最佳发射波长时间程序。第二次进样是在确定的最佳发射波长时间程序下，采集所有化合物的激发光谱，结果用于确定合适的激发波长。两次进样结果，使操作者获得了最佳检测条件。&&& 另外，对于大多数有机化合物，从二极管阵列检测器获取的UV光谱与其荧光激发光谱很相近。两种光谱的区别主要由检测器特性如光谱分辨率，或者光源等因素引起。实际上，这种区别常常可以忽略。因此，采取光电二极管阵列检测器与荧光检测器串联使用的方法，由二极管阵列检测器得到UV光谱和荧光检测器得到的荧光发射光谱，一次进样就可以获取一系列化合物的最佳激发和发射波长。&&& 在氨基甲酸酯的质量控制中，需要分析杂质)2,3-二氨基吩嗪（DAP）和 2-氨基-3-羟基吩嗪（AHP）的含量。用DAD和FLD检测器可以采集两种杂质的标准样品的UV 光谱和发射光谱，图4-5-10是DAP的光谱图，可以看出DAP 的UV光谱与其荧光激发光谱很相近。图4-5-11, 是在不同激发波长下得到的色谱图。
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&&& 在日常分析中，基体会严重干扰样品的测定。波长时间程序常被用来提高选择性和检测灵敏度，但在复杂基体样品分析时，由于化合物的保留值相近，波长的改变常会造成定量不准和保留时间变化。使用多通道（多波长）的同时采集色谱流出信号，能够得到高选择性、高灵敏度的准确检测结果。例如，HP1100系列的FLD能同时四通道采集色谱峰。以前只有质谱和光电二极管阵列检测器具有谱库检索功能，荧光检测器的现代发展也提供了峰识别和纯度检验功能。利用标准荧光化合物的激发光谱和发射光谱建立的谱库，峰的确证更加容易、可靠。分子发光分析法的激发光谱和发射光谱_科普知识_中国百科网
分子发光分析法的激发光谱和发射光谱
    分子发光分析法 -激发光谱和发射光谱 1．激发光谱分子发光分析法荧光和磷光均为光致发光现象，所以必须选择合适的激发光波长。激发光谱的测绘方法为：固定荧光的最大发射波长，然后改变激发光的波长。根据所测得的荧光（或磷光）强度与激发光波长的关系作图，得到激发光谱曲线，见图3-3A。激发光谱曲线上的最大荧光（或磷光）强度所对应的波长，称为最大激发波长，用λex表示。它表示在此波长处，分子吸收的能量最大，处于激发态分子的数目最多，因而能产生最强的荧光。2．发射光谱 又称荧光（或磷光）光谱。选择最大激发波长作为激发光波长，然后测定不同发射波长时所发射的荧光或磷光强度，得到荧光或磷光光谱曲线，见图3-3F、P。其最大荧光或磷光强度处所对应的波长称为最大发射波长，用λem表示。溶液荧光光谱通常有以下几个特征：1）stokes位移。在溶液荧光光谱中，所观察到的荧光的波长总是大于激发光的波长，即λem＞λex。这主要是由于发射荧光之前的振动驰豫和内转换过程损失了一定的能量，这是产生Stokes位移的主要原因。2）荧光发射光谱的形状与激发波长无关。由于荧光发射发生于第一电子激发态的最低振动能级，而与荧光体被激发至哪一个电子态无关，所以荧光光谱的形状通常与激发波长无关。3）与激发光谱大致成镜像对称关系。一般情况下，基态和第一电子激发单重态中振动能级的分布情况是相似的，所以荧光光谱同激发光谱的第一谱带大致成镜像对称。
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流式细胞术
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必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发
激发的光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内
荧光染料光谱的重叠应当尽量减少
高表达量的抗原几乎可以用任何荧光染料标记抗体检测，而较低表达的抗原则需要用较高S/N比值的荧光染料标记的抗体检测。常用荧光的强弱如下：PE&APC&PE-Cy7&Percy-Cy5.5&FITC&APC-Cy7。
检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料（如APC），可以得到较好的S/N比值。
根据仪器选用荧光染料：
1、每个人通道只能选择一种荧光染料；
2、各个通道之间的荧光染料可以随意搭配，搭配的荧光染料之间发射光谱重叠尽量小。
激发光波长
FITC\GFP\Alexa Fluar488\Bidipy\Fluo-3
PE\Propidium Iodide(PI)
PerCP\ PerCP-Cy5.5\PE-Cy5\PE-Cy5.5\PE-Teses Red\7-AAD
PE-Cy7\PE-Alexa Flour750
APC\Cy5\Alexa Fluor647\Alexa Fluor660\ Alexa Fluor700
APC-Cy7\APC-Alexa Flour750
Hoechsr33342-Blue\DAPI
Hoechsr33342-Red
Parific Blue\Cascade Blue\Alexa Flour 405
Parific orange
不同的流式细胞仪可选的荧光染料&
做多色实验，使用荧光染料多，可以登陆eBioscience网站/resources/fluorplan-spectra-viewer.htm，借助FluorPlanSpectra Viewer 进行荧染料光选择，减少荧光叠加现象，便于后期数据分析。
荧光溢漏：当一个荧光经过激光之后，激发发射光及发射波长，而各个荧光发射光之间有一定的重叠，会溢漏一部分的荧光到其他邻近的通道里。
荧光补偿：如果我们要检测一个通道的信号的时候必须要将其他通道溢漏过来的光减掉，才能检测到目标通道的真正信号，而这个纠正荧光溢漏的过程就是我们所说的荧光补偿。
荧光补偿和荧光染料本身的特质有关，和PMT有关。为了减少溢漏值，可以增加主通道的PMT电压，或者减少被溢漏通道的PMT电压。月度关注热点
请问，测试荧光光谱的仪器是什么呢
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请问，测试荧光光谱的仪器是什么呢？荧光光谱仪和荧光分光光度计有什么不同？还是两种都能测啊？查看完整版本请点击这里：
danzi ( 11:44:00)
我做的是ZnO晶体，样品是粉末状的，主要是想测荧光强度，我们学校只有荧光分光光度计，问了老师，说只能做溶液的，不能做粉末的，可是，就我所了解的，还不知道ZnO能溶在哪种溶剂里，呵呵
malong ( 11:44:28)
个人觉得还是找一台可以测固体荧光的荧光仪吧，日立的F7000或者F4500， 很多时候物质在不同的状态下性质还是会不一样的。而且溶剂化作用也有一定的影响。:tuzi1:
美人鱼 ( 11:44:56)
哦，知道了，谢谢你的建议啊，我找到有F4500的了，呵呵！谢谢你啊
886爱 ( 11:45:31)
请问你是哪个学校的，我正在找能做溶液的荧光分光光度计，我是中国农业大学的，毕设急用，先谢过了
malong ( 11:46:00)
想问下这位朋友，一量子点的紫外吸收为500nm，用480nm的光激发测定其荧光发射光谱，在520nm出峰，这正常吗？
跳跳哈里 ( 11:46:24)
你好，我有一种荧光粉末，我想测一下它的激发光谱和发射光谱，我们实验室没有仪器，请问你们对外做测试吗？
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