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香猪NRAMP1基因多态性及与仔猪腹泻相关性研究硕士论文.pdf62页
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感谢为我辛勤劳作的父母及家人
衷心感谢导师许厚强教授三年来对我的精心培养。在我的学习，实验和生活
方面无不凝聚着许老师的一片心血；衷心感谢导师徐厚强教授为我创造了良好的
实验和学习条件；导师渊博的学识、严谨的治学态度、执着的敬业精神、高度的
责任感和崇高的人格魅力深深地影响着我，使我终生受益。同时还要特别感谢师
母稽辛勤教授在学习及生活上给予的关心。
本实验的完成得到了刘若余教授、陈眷华教授、林家栋副教授、燕志宏副教
授、主性副教授、陈祥副教授、张勇副教授、李辉老师、张启林老师指导和帮助，
在此表示衷心的感谢。
感谢在采样过程中给予我帮助的毕节地区畜牧局和纳雍县畜牧局相关同志。
衷心感谢李兴美、何勇、张蓝艺、曹娟、于冰、李白鸽、韩雪等同学以及师
兄妹们的帮助。
特别感谢我的父母、姐姐，亲人是我在外学习的强大后盾和精神支柱，没有
他们就没有我今天的成绩。
在论文付梓之际，谨再次向上述老师、家人、同学和朋友表示深深的谢意。
2009年12月
贵 州 大 学
2009届 硕士研究生学位论文
香猪NRAMP1基因多态性及与仔猪腹
泻相关性研究
学位类别：
业：动物遗传育种与繁殖
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猪Nramp 1 基因多态性与免疫功能的相关性
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猪Nramp 1 基因多态性与免疫功能的相关性
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3秒自动关闭窗口中国荷斯坦牛Nramp1基因部分序列分析及其与乳腺炎关联研究--《四川农业大学》2008年硕士论文
中国荷斯坦牛Nramp1基因部分序列分析及其与乳腺炎关联研究
【摘要】：
本试验设计4对引物Primer1,Primer2,Primer3和Primer4分别扩增第9、第10、第11外显子和第12内含子。采用PCR-SSCP方法首次研究了中国荷斯坦牛Nramp1基因exon9,exon10和exon11序列及其与奶牛乳腺炎的关联性。结果如下:
在Primer1,Primer2和Primer3的扩增片段中共发现3个SNP多态位点,位于Nramp1基因序列的7012bp(第9内含子)、7401bp(第11外显子)和7455bp(第11外显子)处。
Primer1的PCR扩增产物不具有SNP位点。
Primer2的PCR扩增产物经PCR-SSCP检测到3种基因型MM,MN和NN,基因型频率分别为0.756,0.198和0.046,基因型分布服从Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05)。等位基因M和N的基因频率分别为0.854和0.146,其中M为优势等位基因。基因型为多态信息含量为0.2183,显示该位点遗传多态性为低度多态(PIC＜0.25)。测序分析检测到7012bp的C/T突变,处于内含子9中(GenBank登录号:EU281620)。
Primer3的PCR扩增片段经PCR-SSCP检测到3种基因型AA,AB和BB,基因型频率分别0.610,0.314和0.076,基因型分布服从Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)。等位基因A和B的基因频率分别为0.767和0.233,其中A为优势等位基因。基因型为多态信息含量为0.2942,显示该位点遗传多态性为中度多态(0.25＜PIC＜0.05)。测序分析检测到2个SNPs,均处于外显子10中,分别为7401bp的G/C突变和7455bp的A/C突变,分别导致Pr0356Ala和Leu374Met替换。
Primer4克隆测序得到了intron12的部分准确序列并提交到NCBI数据库(GenBank登录号:EF682067)。
GLM分析了扩增片段不同基因型与与奶牛乳腺炎的关联性,结果显示牛场效应和产犊季节对体细胞评分的影响极显著(P＜0.01),胎次对体细胞评分的影响显著(P＜0.05),不同基因型对体细胞评分的影响不显著(P＞0.05)。
【关键词】：
【学位授予单位】：四川农业大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2008【分类号】：S823.91【目录】：
Abstract5-9
1 文献综述9-29
1.1 免疫概述9-13
1.1.1 天然免疫与获得性免疫9-10
1.1.2 吞噬作用10-11
1.1.3 炎症11
1.1.4 胞内菌在宿主细胞内生存的机制11-13
1.2 奶牛乳腺炎的研究概况13-19
1.2.1 定义与分类13
1.2.2 发生与发病率13-14
1.2.3 危害14-16
1.2.4 诊断16
1.2.5 防治现状与发展方向16-18
1.2.6 遗传学研究18-19
1.3.NRAMP1基因的研究进展19-24
1.3.1.Nrampl基因概述19-20
1.3.2 Nramp1的结构和功能20-22
1.3.3 Nramp1基因的表达调控22-23
1.3.4 Nramp1基因与疾病的关系23-24
1.4 SSCP技术的研究概况24-27
1.4.1 SSCP的建立与发展25
1.4.2 PCK-SSCP方法的优缺点25-26
1.4.3 PCR-SSCP的应用26
1.4.4 SRP及其研究方法26-27
1.5 研究的目的意义与内容27-29
2 试验材料与方法29-39
2.1 试验材料29-32
2.1.1 试验样本29
2.1.2 牛奶体细胞测定29-30
2.1.3 试验主要仪器设备30
2.1.4 试验主要试剂及配制30-31
2.1.5 引物信息及PCR反应条件31-32
2.2 试验方法32-36
2.2.1 技术路线32
2.2.2 基因组DNA提取32-33
2.2.3 PCR-SSCP分析与基因型判定33-35
2.2.4 内含子12的克隆测序35-36
2.3 序列结果36-37
2.4 数据统计分析37-39
2.4.1 数据收集和处理37
2.4.2 奶牛乳腺炎的判断标准37
2.4.3 基因频率和基因型频率的计算37
2.4.4 遗传多态性分析37-38
2.4.5 Hardy-Weinberg平衡状态的检验38-39
2.4.6 不同基因型与生产性状的相关分析39
3 结果与分析39-48
3.1 模板DNA的抽提和序列分析结果39-44
3.1.1 模板DNA的抽提结果39-40
3.1.2 PCR-SSCP的检测结果40-42
3.1.3 内含子12的克隆测序42
3.1.4 Nramp1基因部分序列测序结果42-44
3.2 NRAMP1基因的遗传学分析44-46
3.2.1 Nramp1基因型频率和基因频率44
3.2.2 Nramp1基因的遗传多态性分析44-45
3.2.3 Hardy-Weinberg平衡的检验45-46
3.3 不同基因型与生产性状的相关分析46-48
4.讨论48-54
4.1 PCR反应条件的优化48
4.2 中国荷斯坦牛NRAMP1基因的遗传特征48-49
4.3 SCC评估乳腺炎的优缺点49-50
4.4 牛NRAMP1基因多态性与SCS的关联性50-51
4.5 影响奶牛乳腺炎的因素分析51-52
4.5.1 牛场对奶牛乳腺炎的影响51-52
4.5.2 基因型对奶牛乳腺炎的影响52
4.5.3 胎次对奶牛乳腺炎的影响52
4.6 NRAMP1基因序列完整性分析52-54
5.结论54-55
参考文献55-62
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京公网安备75号转Nramp1基因克隆牛的研制--《西北农林科技大学》2015年博士论文
转Nramp1基因克隆牛的研制
【摘要】：结核病是一种全球性的、人畜共患传染病,是严重危害养殖业和人类健康的重大疫病之一。由于没有有效的预防和根除方法,目前主要采用检疫-扑杀结合的方法。结核病的发生与机体的抗病力密切相关,因而,如何提高机体的抗结核能力一直是人们关注的焦点。近年来,病原-宿主相关作用机制研究的深入、基因编辑技术和动物克隆技术的快速发展,使抗结核牛羊的培育和生产成为可能。研究显示,机体对结核分支杆菌的抵抗力强弱与天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1(Nramp1)的表达存在量依赖性关系。因此通过转基因手段来增强牛Nramp1基因表达,培育抗病种群,可成为控制牛结核病的一个新切入点。本研究分别克隆了秦川牛Nramp1开放阅读框及荷斯坦奶牛Nramp1基因启动子区(5’侧翼区-1483~+73)序列,构建了牛Nramp1吞噬细胞特异性真核表达载体,转染荷斯坦奶牛新生牛成纤维细胞,筛选阳性克隆作为核移植供体细胞,生产培育转Nramp1基因克隆牛,取得以下结果:1.基因克隆、载体构建与功能验证。以秦川牛外周血总RNA为模板PCR扩增Nramp1基因开放阅读框,获得的序列对比Gen Bank中的牛的相应的基因序列(Gen Bank序列号U12862.1),发现存在2个碱基差异:第1个差异碱基致使基因编码的第49个氨基酸发生变化使苏氨酸(ACA)转变为丙氨酸(GCA);第2个差异碱基并未引起其编码氨基酸的差异,即第53位氨基酸均为精氨酸(AGG→CGG)。荷斯坦奶牛Nramp1基因5’侧翼区(-1483~+73)序列在巨噬细胞内有启动子活性,且H37Ra可以诱导调节该区段的启动子活性。使用牛Nramp1基因5’侧翼区(-1483~+73)序列调控Nramp1基因表达,构建了牛Nramp1吞噬细胞特异性表达载体p Lox P-2A-N。载体p Lox P-2A-N中使用FMDV 2A自剪肽连接GFP与Neo基因,并在细胞筛选标记基因两侧添加同向的Lox P位点。将该片段分别转入E.coli BM25.8菌株和HEK293,经菌体Cre酶及Cre酶细胞共孵育实验均证明在Cre酶的作用下,Lox P可有效去除中间的筛选标记基因,但序列中会残存一个Lox P位点。2.转基因细胞株的筛选与鉴定。线性化载体p Lox P-2A-N转染奶牛成纤维细胞获得转Nramp1基因细胞株D4、E3。Q-PCR鉴定2株细胞外源基因拷贝数为1。染色体步移试验检测出D4株外源基因插入第29号染色体、E3外源基因插入第10号染色体,两细胞株外源基因插入位点均位于基因组非编码区内。细胞核型试验证明2株细胞染色体数目均为60条。3.核移植与转基因牛生产、鉴定。以D4、E3作为核移植供体细胞生产的转Nramp1基因重构胚胎体外及体内发育率正常,获得3头犊牛(大于2月龄)经PCR与Soutern Blot鉴定均为转Nramp1基因克隆牛。Q-PCR分析外源基因插入没有影响其插入位点上下游基因m RNA的表达水平。分离转基因牛与非转基因牛(供体细胞来源)外周血单核细胞诱导为巨噬细胞。结核分支杆菌H37Ra侵染牛MDMs。正常培养条件下,转基因牛MDMs Nramp1基因表达量与非转基因牛差异不显著;攻菌后,转基因牛MDMs Nramp1基因表达量显著高于非转基因牛。攻菌3 d后,转基因牛MDMs细胞荷菌数显著低于非转基因牛。说明秦川牛Nramp1基因的转入增强了荷斯坦奶牛MDMs对结分支核菌的抑制与杀伤作用,即转入Nramp1增强了牛对结核分支杆菌的抵抗能力。4.SCNT胚胎早期发育阶段体外培养体系的确立。通过SCNT检测胚胎发育率、囊胚细胞总数、ROS水平、囊胚细胞凋亡率和ICM比例指出牛SCNT胚胎体外培养全程添加Vit-C可以提高胚胎卵裂率但降低囊胚孵化率,降低了胚胎质量与发育能力。在转基因牛培育过程中不适宜使用Vit-C作为添加剂。综上所述,本研究获得3头转Nramp1基因克隆牛,完善了转基因牛生产技术体系。从增强动物体自身天然免疫力角度出发,通过转基因手段培育抗病种群,为牛结核病的防控创造一个新切入点。
【关键词】：
【学位授予单位】：西北农林科技大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2015【分类号】：Q78;S858.23【目录】：
摘要5-7Abstract7-12文献综述12-30 第一章 影响机体抵抗分支杆菌感染的遗传因素12-19
1.1 天然免疫力相关巨噬细胞蛋白 113-14
1.2 细胞内病原抗性基因 114
1.3 γ-干扰素受体及信号通路14-15
1.4 维生素D及其受体15-16
1.5 人类白细胞抗原16-17
1.6 巨噬细胞移动抑制因子17
1.7 全基因组关联研究17-18
1.8 展望18-19 第二章 Nramp1 研究进展19-30
2.1 Nramp基因家族19-21
2.2 Nramp1 基因抗结核研究21-24
2.2.1 机体免疫力与结核分支杆菌的相互作用21-22
2.2.2 Nramp1 基因多态性研究22-23
2.2.3 缺氧诱导因子 1α 与Nramp123-24
2.3 Nramp1 基因转录调控24-28
2.3.1 Nramp1 近端启动子24-25
2.3.2 组蛋白修饰模式25-26
2.3.3 Nramp1 表达调控元件26-28
2.4 本研究的内容及意义28-30试验研究30-97 第三章 Nramp1 细胞特异性表达载体构建及启动子活性分析30-53
3.1 材料30-33
3.1.1 实验动物和组织细胞30
3.1.2 菌株和质粒30-31
3.1.3 主要试剂31
3.1.4 测试化验加工31
3.1.5 引物设计31-33
3.2 方法33-42
3.2.1 筛选报告基因序列扩增及功能检测33-35
3.2.2 载体pLoxP-2A-A的构建35-36
3.2.3 荷斯坦奶牛Nramp1 基因启动子区扩增及活性检测36-38
3.2.4 Nramp1 细胞特异性表达载体pLoxP-2A-N载体构建及其功能验证38-42
3.3 结果42-49
3.3.1 筛选报告基因序列扩增及功能检测42-44
3.3.2 载体pLoxP-2A-A的构建44-45
3.3.3 荷斯坦奶牛Nramp1 基因启动子区扩增及活性检测45-46
3.3.4 Nramp1 细胞特异性表达载体pLoxP-2A-N构建及其功能验证46-49
3.4 讨论49-52
3.5 结论52-53 第四章 转牛Nramp1 基因成纤维细胞株筛选及鉴定53-69
4.1 材料53-55
4.1.1 实验动物和组织细胞53
4.1.2 菌株和质粒53
4.1.3 主要试剂53-54
4.1.4 引物设计54-55
4.2 方法55-62
4.2.1 新生荷斯坦奶牛成纤维细胞的分离培养55-56
4.2.2 转Nramp1 基因成纤维细胞筛选56-58
4.2.3 转Nramp1 基因成纤维细胞株鉴定58-62
4.3 结果62-67
4.3.1 新生荷斯坦奶牛成纤维细胞的分离培养62
4.3.2 转Nramp1 基因成纤维细胞筛选62-65
4.3.3 转Nramp1 基因成纤维细胞鉴定65-67
4.4 讨论67-68
4.5 小结68-69 第五章 转Nramp1 基因牛的生产与鉴定69-97
5.1 材料69-71
5.1.1 实验动物和组织细胞69
5.1.2 菌株和质粒69
5.1.3 主要试剂69-70
5.1.4 引物设计70-71
5.2 方法71-80
5.2.1 SCNT胚胎体外培养条件优化71-74
5.2.2 转Nramp1 基因重构胚的培养74-75
5.2.3 转Nramp1 基因牛生产及鉴定75-80
5.3 结果80-91
5.3.1 培养液添加Vit-C对牛SCNT胚胎发育的影响80-85
5.3.2 转Nramp1 基因克隆胚的制备85-86
5.3.3 转Nramp1 基因克隆牛的生产86-91
5.4 讨论91-96
5.5 小结96-97结论97-98创新之处与进一步研究的课题98-99参考文献99-115附录115-118缩略 词118-120致谢120-121作者简介121-122
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