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被如下文章引用：
AUTHORS: ,,,,,,
KEYWORDS: 肝细胞癌,肝癌干细胞,亚砷酸钠,Oct,Sox
JOURNAL NAME:
Jan 09, 2016
ABSTRACT: 目的观察HepG2、Hep3B、HuH7和SMCC-7721细胞对亚砷酸钠的反应，CD133及CD13分子的表达和肿瘤球形成的差异，分析低浓度亚砷酸钠处理前后HuH7和原代HCC细胞Oct4、Sox2因子的表达变化，探讨低浓度亚砷酸钠对HCC细胞生长的抑制机制。方法CCK-8法检测0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μg/mL不同浓度亚砷酸钠处理48、72、96h对HepG2、Hep3B、HuH7和SMCC-7721细胞生长的抑制作用；分析HepG2、Hep3B、HuH7、SMCC-7721和原代HCC细胞CD13、CD133表达及肿瘤球形成能力，确定是否含肝癌干细胞（LCSCs）；观察0.5μg/mＬ亚砷酸钠处理HuH7和原代HCC细胞前后Oct4和Sox2基因和蛋白表达的变化，分析低浓度亚砷酸钠对LCSCs有何作用。结果亚砷酸钠处理HCC细胞48、72、96h，亚砷酸钠明显抑制HepG2、Hep3B、HuH7和SMCC-7721细胞生长，对HCC细胞增殖抑制作用与浓度和作用时间有关。亚砷酸钠处理HCC细胞96h，0.2、0.4μg/mL亚砷酸钠已经明显抑制SMCC-7721细胞生长（P0.05），0.8μg/mL亚砷酸钠非常明显抑制HuH7细胞增殖（P<0.01）。亚砷酸钠对HuH7细胞存在低浓度刺激HuH7细胞增殖和较高浓度抑制HuH7细胞增殖的双向作用，随着作用时间延长，相同浓度下抑制作用增强。低浓度亚砷酸钠对SMCC-7721、HepG2和Hep3B细胞几乎无刺激增殖作用。HepG2、Hep3B和SMCC-7721既不表达CD133，也不形成肿瘤球。HuH7和原代HCC细胞同时表达CD133、CD13标志，也具有形成肿瘤球能力，HuH7和原代HCC细胞含有CD133+CD13+LCSCs。HuH7和原代HCC细胞表达Oct4和Sox2基因和蛋白，0.5μg/mL亚砷酸钠可以下调HuH7和原代HCC细胞Oct4和Sox2基因和蛋白表达。结论低浓度亚砷酸钠下调或抑制含CD133+CD13+LCSCs的HuH7和原代HCC细胞Oct4和Sox2基因和蛋白表达，推测低浓度亚砷酸钠可能诱导LCSCs分化。第三军医大学组织器官再生工程研究中心人才引进及工作人员招聘
中心简介：
中心负责人朱楚洪教授为“十三五”国家重点研发计划首席科学家、国家杰青获得者，所领导的学科为第三军医大学国家重点培育学科，实验室为国家发改委组织工程国家地方联合工程实验室血管组织工程中心，国家发改委血管植入物国家地方联合工程实验室人工血管中心。课题组基础研究与应用研究并重，前期研发了新型生物人工血管、生物人工角膜、糖尿病促愈合生物敷料、心肌修复水凝胶等系列产品，在Acs Nano，Advanced Science、Biomaterials、Arterioscler Thromb Vasc Biol等杂志发表系列论著。
研究方向：
1. 血管化复杂组织器官构建及新型医疗器械研发
2. 药物缓释及工程化改造的细胞治疗新技术开发
3. 材料学与再生医学研究
4. 神经、免疫与再生医学研究
近三年代表性论著：
1.Huo D, LiuG, Li,Y, Wang Y, Guan G,Yang M ,Wei K, Yang J,Zeng L,Li G, Zeng W,Zhu C*. Construction of Antithrombotic Tissue-Engineered Blood Vessel via Reduced Graphene Oxide Based Dual-Enzyme Biomimetic Cascade. ACS Nano.2017,doi: 10.1021. (IF:13.942)
2. Li Y, Wan S, Liu G, Wang C, Huo D, Li G, Yang M, Wang Y, Guan G, Ding N, Liu F, Zeng W*, Zhu C*.Netrin-1 Promotes Inflammation Resolution to Achieve Endothelialization of Small-diameter Tissue Engineering Blood Vessels by Improving Endothelial Progenitor Cells Function in Situ.Advanced Science. 2017. doi: 10.1002. (IF:9.034)
3.Liu G, Li L, Huo D, Li Y, Wu Y, Zeng L, Cheng P, Xing M, Zeng W, Zhu C*.A VEGF delivery system targeting MI improves angiogenesis and cardiac functionbased on the tropism of MSCs and layer-by-layer self-assembly.Biomaterials-131. (IF: 8.402)
4.Cheng P, Zeng W, Li L, Huo D, Zeng L, Tan J, Zhou J, Sun J, Liu G, Li Y, Guan G, Wang Y, Zhu C*. PLGA-PNIPAM microspheres loaded with the gastrointestinal nutrient NaB ameliorate cardiac dysfunction by activating Sirt3 in acute myocardial infarction. Advanced Science. ):1600254. (IF:9.034)
5.Chen W, Zeng W, Sun J, Yang M, Li L, Zhou J, Wu Y, Sun J, Liu G, Tang R, Tan J,Zhu C*.Construction of an Aptamer-SiRNA Chimeras Modified Tissue- Engineered Blood Vessel for Cell Type-Specific Capture and Delivery.ACS Nano. ):6069-76. ） (IF:13.942)
1、优秀人才引进
因研究需要，中心现招聘优秀科技人才，优秀人才以PI制引进，研究可涉及生物学、材料学、药学、免疫学、生物医学工程、化学、医学等各个与再生医学与工程学相关的方向，不限于血管研究，欢迎有志之士来电详细咨询（联系人：李老师，联系电话:）或将简历发送至：（邮件题目请采用“科技人才引进+姓名”的格式）。
优秀人才引进标准
近五年以第一作者身份发表系列SCI论著，其中1篇20.0以上或2篇10.0以上或4篇JCR一区（大类）论著的优秀博士、博士后，年龄不超过35岁，在《细胞》《自然》《科学》或《柳叶刀》《新英格兰医学杂志》《美国医学会杂志》等系列杂志发表高水平论著人员，年龄可放宽至40岁。
工作生活待遇
1、提供200-300万元科研启动经费；
2、50万元安家费；
3、25-35万元年薪；
4、团职公寓（80平米左右）
2、博士毕业生招聘
招聘要求：医学(基础医学、临床医学)、材料学、药学、生物医学工程、生物学等相关专业。招聘博士毕业研究生6-8名。
待遇：经考核合格后可直接聘用为国防公务员编制文员，享受军队相关待遇，从事基础科研、教学及产学研相关工作。
3、工作人员招聘
因研究工作需要，特招聘相关工作人员8-10名，主要负责医疗器械产品的相关研究及检测、报批工作以及相关的再生医学基础研究。实验室经费充足，待遇条件优厚，欢迎各位青年才俊来电咨询（联系人：李老师，联系电话:）或将简历发送至：（邮件题目请采用“工作人员应聘+姓名”的格式）
招聘要求：医学、材料学、药学、生物医学工程、检验、生物学、化学、药学等相关专业专科、本科、硕士等学历。
待遇：待遇高于地方单位同等岗位，具体根据实际能力面谈，硕士学位晋升中级职称后，除五险一金外纯收入6000元每月加年终绩效。优秀硕士生可带薪攻读博士学位。优秀本科生可在职读研。优秀专科毕业生可招聘为大学专业技术人员。
4、博士后引进
中心拟引进材料学、药学、生物医学工程、药学、神经科学、免疫学等相关专业博士后。博士后研究人员在站时间一般为2年，根据项目需要可在2-4年内灵活确定，确需延长在站时间的，依照国家、军队相关规定进行调整。在站期间，对博士后研究人员实行科研资助和生活资助制度。
博士后生活资助类别、资助标准
Ⅰ类资助：在站工作4年，资助总额100万元。其中，日常生活资助48万元，按1万元/月标准发放；科研绩效资助52万元，每年度考核合格发放2万元年度绩效资助，出站考核合格一次性发放46万元绩效资助。
Ⅱ类资助：在站工作3年，资助总额60万元。其中，日常生活资助36万元，按1万元/月标准发放；科研绩效资助24万元，每年度考核合格发放2万元年度绩效资助，出站考核合格一次性发放20万元绩效资助。
Ⅲ类资助：在站工作2年，资助总额30万元。其中，日常生活资助24万元，按1万元/月标准发放；科研绩效资助6万元，每年度考核合格发放2万元年度绩效资助，出站考核合格一次性发放4万元绩效资助。
其中，进站前身份为地方统招统分博士毕业生、无人事（劳动）关系人员的博士后研究人员日常生活资助按1万元/月标准发放；现役军人身份、地方在职人员身份的博士后研究人员，进站后日常生活资助按其已收入工资情况补足1万元/月标准发放。
注：博士后可以申请学校二室一厅博士后公寓，除上述待遇外，发表文章另有文章发表奖励及导师绩效奖励。博士后结束后可申请转为国防事业编制文职人员，达到人才引进标准以优秀人才引进成为年薪制PI，给予科研启动经费和分配公寓房。
联系人：李老师 电话： 邮箱：
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今日搜狐热点下调Ape1Ref-1在Genistein防护放射性肺损伤和PDT对非小细胞肺癌杀伤作用的实验研究_甜梦文库
下调Ape1Ref-1在Genistein防护放射性肺损伤和PDT对非小细胞肺癌杀伤作用的实验研究
分类号 学 号R734 密级公开学校代码90031硕士学位论文下调 Ape1/Ref-1 在 Genistein 防护放射性肺损伤和 PDT 对非小细胞肺癌杀伤作用的实验研究 夏指 导 教 师 王 东蕾教 授导 师 组 成 员 培 养 单 位 第三军医大学第三附属医院（所）全军战创伤中心 临床医学 专 业 名 称 硕士专业学位 肿瘤学 2013 年 5 月 论文答辩日期 丁彦青 朱波 王东林 2013 年 5 月申请学位类别 论文提交日期答 辩 委 员 会 主 席 评 阅 人二一三年五月
目录缩略语表 .............................................................................................................................. 1 英文摘要 .............................................................................................................................. 4 中文摘要 .............................................................................................................................. 8 论文正文 下调Ape1/Ref-1 在Genistein防护放射性肺损伤和PDT对非小细胞肺癌杀伤作用的实验研究 .................................................................................................................11 第一章 第二章 前 言 .........................................................................................................11三羟异黄酮下调Ape1/Ref-1 对放射性肺损伤防护作用的实验研究 ...........13 材料与方法 ................................................................................................13 结 讨 果 ....................................................................................................17 论 ....................................................................................................242.1 2.2 2.3 第三章Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒联合 HpD-PDT对非小细胞肺癌杀伤作用的实验研究 .........................................................................................................28 3.1 3.2 3.3 材料与方法 ................................................................................................28 结 讨 果 ....................................................................................................33 论 ....................................................................................................37全文结论 .............................................................................................................................39 参考文献 .............................................................................................................................40 文献综述 .............................................................................................................................46 研究生期间发表论文情况..................................................................................................60 致 谢 .............................................................................................................................61
第三军医大学硕士学位论文缩略语表英文缩写 APE1 AI BER bp BSA CAR cDNA d DAB DMSO DNA DSB DSBR EB EDTA FCM FCS FITC Hepes h HpD HRP IC kb KD min 英文全称 Apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 Apoptosis index Base-excision repair Base pair Bovine serum albumin Coxsackie B virus-adenovirus receptor complementary DNA day Diaminobenzidine Dimethyl sulfoxide Deoxyribonucleic acid double strand break DNA double-strand-break repair Ethidium bromide Ethylene dianinetraccetic acid Flow cytometry Fetal calf serum Fluorescein isothiocyanate N-2-hydroxyethyl piperaine-N/-2-ethane sulfonic acid hour hematoporphyrin derivative Horseradish peroxidase inhibiting concentration kilobase Kilo-doltons Minute1中文全称 脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶 凋亡指数 碱基切除修复 碱基对 牛血清白蛋白 柯萨奇 B 组病毒和腺病毒受体 互补 DNA 天 二氨基联苯胺 二甲基亚砜 脱氧核糖核苷酸 双链断裂 DNA 双链断裂修复 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 流式细胞分析 胎牛血清 异硫氰酸荧光素 N-2-羟乙基哌嗪-N/-2-乙磺酸小时 血卟啉衍生物 辣根过氧化酶 抑制剂量 千碱基对 千道尔顿 分钟第三军医大学硕士学位论文MMR MOI MTT NER NSCLC nt OD OGG1 PBS PCR-CTP P PFA PDT PI PLL PMSF PTGS Ref-1 RGS RIF RILI RIP RNA RNAi ROS rpm siRNA s SCGE shRNAMismatch repair multiplicity of infection错配修复 感染复数3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2H- 3-(4 ， 5- 二甲基噻唑 -2)-2 ， 5tetrazoliumbromide Nucleotide excision repair non-small cell lung carcinomas nucleotide Optical density 8-oxoguanine glycosylase-1 Phosphate buffered saline polymerase chain reaction with confronting two-pair primers Polyformaldehydum Photodynamic therapy Propidium iodide Poly-L-Lycine phenylmethyl sulphonyl fluoride posttranscriptional gene silencing Redox factor-1 relative gray scale radiation-induced fibrosis radiation-induced lung injury radiation-induced pneumonitis Ribonucleic acid RNA interfering Reactive oxygen species rounds per minute Small interfering RNA second Single cell gel electrophoresis Short Hairpin RNA2二苯基四氮唑嗅盐 核苷酸切除修复 非小细胞肺癌 核苷酸 光密度 8-羟基鸟嘌呤 DNA 糖苷酶 1 磷酸盐缓冲液 两对引物-聚合酶链反应多聚甲醛 光动力疗法 碘化丙锭 多聚赖氨酸 苯甲基磺酰氟 转录后基因沉默机制 氧化还原因子 相对灰度值 放射性肺纤维化 放射性肺损伤 放射性肺炎 核糖核酸 RNA 干扰 活性氧分子 每分钟转速 小干扰 RNA 秒 单细胞凝胶电泳 短发夹 RNA第三军医大学硕士学位论文SLDR SPF SSB TEMED TUNEL Tris VEGF XRCC1 8-oxo-Gsublethaldamage repair Specific Pathogen Free single strand break N,N,N&#39;,N&#39;- tetramethyl-ethylenediamine TdT-mediated biotin-dUTP nick-end labelling tris(hydroxymethyl) aminometnane vascular endothelial growth factor X-ray repair cross-complementing 1 8-Oxoguanine亚致死损伤修复 无特殊病原体 单链断裂 四甲基乙二胺 TdT 介导 dUTP 缺口末端标记 三(羟甲基)氨基甲烷 血管内皮细胞生长因子 X 线修复交叉互补基因 1 8-羟基鸟嘌呤3第三军医大学硕士学位论文Study of down-regulation of Ape1/ Ref-1 expression by genistein is associated with mitigating the effect of radiation and killing effect of photodynamic therapy on human non-small cell lung cancerAbstractRadiation-induced lung injury (RILI) is a severe complication commonly found as a result of nuclear war or accident, total body irradiation before stem cell transplantation and the radiotherapy of thoracic tumors. However, the current clinical treatment cannot efficiently prevent RILI and the further fibrosis, which results in a high mortality rate. There are two major obstacles in the treatment of RILI: 1. the oxidative injury of DNA. 2. The inflammatory cytokine cascade induced by the driven oxidative stress and the activated target cells such as alveolar epithelial cells type Ⅱ, and vascular endothelial cells, etc., that were driven by the oxygenated intermediate product of reactive oxygen species (ROS). Regarding the oxidative injury of DNA, the studies of radio-biology have revealed DNA as the major target of ionizing radiation (IR). Either through a direct ionizing or an indirect mechanism of ROS, the IR can lead to the oxidation of the purine and pyrimidine in the cells, the absence of bases (AP site), the single-strand breaks and the associated double-strand breaks. Almost all the living cells including human cells have four pathways of DNA repairing: Nucleotide excision repair, base excision repair, double-strand break repair and mismatch repair. These are basic defense and protection mechanisms of the cells to maintain the stability and integrity of the genome. The present studies have also reported that the apurinic/ apyrimidinic endonuclease 1(APE1, also known as redox factor-1Ref-1) is not only the major rate-limiting enzyme of the DNA base excision repair pathway, but also a protective gene that defenses oxidative stress-induced apoptosis through the regulation of several transcription factors redox state. Previous studies have suggested that the -κB(NF-κB) may regulate the inflammatory cytokine cascade reaction which leads to non-targeted effects, which plays a key role in the cause and the amplification of4第三军医大学硕士学位论文radiation-induced lung injury. The research on the inhibition of NF-κB activity may provide a new platform for the development of special treatment of the radiation-induced lung injury. Polyphenols small molecule compounds genistein can inhibit NF-κB DNA binding activity by reducing the increase of radiation-induced Ape1/Ref-1 expression. However, the expression characteristics, regularity and reaction mechanisms of Ape1 / Ref-1 protein in the radiation-induced lung injury are still unclear. The effective measures of RILI prevention and control are also missing. The investigations of these problems are highly desirable in clinics to improve the RILI treatment and prevention.. Study objective 1. To investigate the effect and the molecular mechanism of the genistein (GEN) in the protection against the RILI by depressing the expression of Ape1/Ref-1, which provide theoretical basis to the prevention and treatment of the RILI. 2. To study the killing effect of human lung adenocarcinoma (A549) and the molecular mechanism of the photodynamic therapy (PDT) induced by a combination of Ad5/F35-APE1 siRNA and hematoporphrphyrin derivative (HpD). To further investigate the pathway of Ape1/Ref-1-NF-κB in the prevention of RILI, hence enrich the knowledge of the molecular biological effect of Ape1/Ref-1. Materials and methods 1. The development and amplification of the Ad5/F35-APE1 siRNA re 2. The observation of the RILI prevention effect of genistein: the mouse model of radiation pneumonitis protected by the genistein and amifostine was developted (compared with the control group): genistein and amifostine were given at various times. The pathological morphology and the hydroxyproline content in the lung tissue were examined. Using the methods of liquid-phase chip, double antibody sandwich method, and ROS-specific fluorescent probes, the inflammatory cytokines (IL-1, TNF-α, IL-6, TGFβ1) / inflammatory cell number and changes of the intracellular ROS level in the serum and bronchoalveolar lavage fluid were detected. These were conducted to clarify the protective effect, the timing of administration, the dose/effect and time/effect relations of genistein, as a preparation for the next experiments. 3. The discussion on the mechanisms of genistein in protecting the target cells of RILI5第三军医大学硕士学位论文(alveolar type II epithelial cells and endothelial cells). In this controlled study, the technologies of Western blot and EMSA were used to detect the increased expression of Ape1/Ref-1 caused by the genistein induced depression of radiation. The same methods were also adopted to investigate the effect on the activeness of the NF-κB as a result of the depressed expression of Ape1/Ref-1 by Genistein. 4. Regulate the impact and possible mechanism of synergistic effect of Ape1/Ref-1: The exogenous intervention (Ape1/Ref-1 RNAi transfection) was applied to affect the inhabitation of the A549 The APE1 protein expression and the activity of NF-κB were detected by Western blot method and EMSA method respectively in order to validate the reduced synergistic effect of the Ape1/Ref-1 and NF-κB and the possible mechanisms. Results 1. The observed effect of the genistein (GEN) in the protection against the RILI: The pathological test indicated that the degree of the pulmonary fibrosis in the RILI mice increased with the time after irradiation. However, genistein can relief the inflammation and fibrosis of the lung tissue. After irradiation, the increasing trends of TGF-β1, IL-6, IL-1, TNF-α and other inflammatory cytokines were also observed in serum and bronchoalveolar lavage fluid. An increased hydroxyproline level in the lung tissue was also found. Genistein can reduce the level of a variety of inflammatory cytokines and hydroxyproline content (P &0.05). Especially if genistein was given 24 hours before irradiation, a comparable efficacy can be achieved as amifostine was given 30 minutes before irradiation. 2. The genistein protective mechanism of RILI: the content of ROS in A549 cells was significantly elevated after irradiation, yet the genistein significantly reduced the expression of intracellular ROS; The genistein can reduce the radiation-induced increase of APE1 protein and NF-ΚB expression (P &0.05). 3. verify the affect on the NF-κB synergies by regulating Ape1/Ref-1:After the introduction of the HpD-PDT, the inhibition of A549 cell proliferation and the increase of apoptosis were significantly higher than that in the control group (P &0.05). The inhibition efficiency depended on the HPD concentration and the laser dose. The combination of Ad5/F35-APE1 siRNA and PDT displayed a stronger proliferation inhibition of A549 cells. The intracellular levels of ROS and the expression of inflammatory factors increased6第三军医大学硕士学位论文significantly (P &0.05). HpD-PDT induced enhancement of APE1 protein expression by A549 cells reached the peak at 24h. The APE1 expression in the A549 cells infected by 10MOI Ad5/F35-APE1 siRNA recombinant adenovirus was inhibited most significantly at 48 hours. Conclusion 1. Based on the studies on the mouse model of RILI, the expression of nucleoprotein APE1/Ref-1 in the lung tissue was significantly increased, showing the characteristics of shifting from the nucleus to the cytoplasm which increased firs The radiation can induce an increased expression and andectopic expression of APE1/Ref-1, hence affect the repair of RILI through DNA damage repair and / or redox functions. 2. APE1/Ref-1 is a regulatory factor of inflammatory factors. The levels of TGF-β1, IL-6, IL-1β and TNF-α in the serum / lavage fluid were predictors of RILI. This study provides new experimental evidence to predict the incidence of RILI. 3. Important protective role against RILI of genistein by regulating APE1/Ref-1 expression was verified and the regulatory mechanism was clarified. Genistein can significantly reduce the inflammatory exudate in the alveolar space, the hydroxyproline content in the lung tissue and collagen deposition in the RILI mice. The mechanism is associated with the depression of ROS level to reduce the expression of APE1/Ref-1 and NF-κB, hence decrease the secretion of inflammatory factors. This study provides new means for the prevention and treatment of RILI. 4. Genistein has unique advantages of the protection against RILI. Regarding the radiotherapy of lung cancer, genistein does not only protect against RILI by depressing the expression of Ape1 / Ref-1, but also increase the radio-sensitivity of lung cancer cells by regulating the DNA damage repair and Redox dual function.Keywords: L RILI; G Ape1/Ref-1; ROS; NF-κB; HpD-PDT; Ad5/F35-APE1 siRNA; hydroxyproline.7第三军医大学硕士学位论文下调 Ape1/Ref-1 在 Genistein 防护放射性肺损伤和 PDT 对 非小细胞肺癌杀伤作用的实验研究摘 要放射性肺损伤(Radiation-induced lung injury, RILI)是战时或平时如核武器损伤、核 辐射事故、造血干细胞移植预处理以及胸部肿瘤放疗的常见严重并发症，且目前的临 床救治措施并不能有效预防或转归放射性肺炎及进一步的纤维化，病死率极高。制约 放射性肺损伤治疗的关键问题一个是 DNA 氧化损伤，一个是含氧中间产物活性氧 (reactive oxygen species，ROS)驱动氧化应激、启动肺泡Ⅱ型上皮细胞和血管内皮细胞 等靶细胞产生的炎性细胞因子级联反应。对于 DNA 氧化损伤，电离辐射的生物学研 究表明，细胞 DNA 是电离辐射(IR)最为主要的靶分子，IR 可通过直接电离和 ROS 间 接作用致细胞嘌呤和嘧啶碱基氧化、碱基缺失(AP 位点)以及单链断裂进而形成双链断 裂，人体细胞乃至所有生物细胞都存在着核苷酸切除修复、碱基切除修复、双链断裂 修复和错配修复等四个较为完善的 DNA 修复通路，这是细胞维持基因组稳定和完整 的一种基本防御及保护机制。目前的研究表明，脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶 (apurinic/ apyrimidinic endonuclease 1,APE1)又称为氧化还原因子( redox factor-1，Ref-1)，它不仅 是 DNA 碱基切除修复途径的主要限速酶，还是一种能通过调控多种转录因子氧化还 原状态，对氧化应激诱导细胞凋亡具有防御作用的保护基因。已有研究提示辐射诱导 的核转录因子-κB(NF-κB)可能在调节炎性细胞因子级联反应产生非靶向性效应，从而 在介导和放大放射性肺损伤中发挥关键作用， 针对抑制 NF-κB 活性的研究将可能为开 发放射性肺损伤特殊的治疗方法提供一个平台。多酚类小分子化合物三羟基异黄酮具 有下调辐射所致 Ape1/ Ref-1 表达增加从而抑制 NF-κB DNA 结合活性功能。但目前关 于 Ape1/ Ref-1 蛋白在放射性肺损伤的表达特点、 规律及作用机制尚不清楚， 也无明确 有效的 RILI 防治措施， 严重制约着放射性肺损伤的防治， 研究阐明这些问题对提高放 射性肺损伤的救治水平有非常重要的意义。 研究目的 1. 研究三羟异黄酮(genistein, GEN)下调 Ape1/ Ref-1 的表达对放射性肺损伤的保 护作用及其分子机制，为防治放射性肺损伤提供理论依据。 2. 研究 Ad5/F35-APE1 siRNA 重组腺病毒联合血卟啉衍生物 （hematoporphrphyrin8第三军医大学硕士学位论文derivative, HpD） 介导的光动力疗法 （photodynamic therapy, PDT） 对人肺腺癌细胞 A549 的杀伤作用及其分子机制，进一步验证在放射性肺损伤防护中 Ape1/ Ref-1-NF-κB 的 作用途径，理论上进一步丰富我们对 Ape1/ Ref-1 分子生物功能的认识。 研究内容和方法 1. Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒的构建、扩增； 2. 三羟异黄酮防护放射性肺损伤的效应观察： 建立三羟异黄酮及氨磷汀防护放射 性肺损伤小鼠模型（与对照组比较）：不同时间给予三羟异黄酮及氨磷汀，检测组织 病理形态、肺组织羟脯氨酸含量；应用液相芯片法、双抗体夹心法、ROS特异性荧光 探针技术检测血清、肺泡灌洗液中炎性细胞因子（IL-1、TNF-α、IL-6、TGFβ1）/炎性 细胞数和胞内ROS含量的改变；以明确三羟异黄酮的防护效应、给药时机、量效和时 效关系，为下一步实验做准备； 3. 三羟异黄酮防护放射性肺损伤靶细胞（肺泡 II 型上皮细胞和内皮细胞） 的机制 探讨：应用对照研究，采用 Western blot 法及 EMSA 等技术检测三羟异黄酮下调辐射 所致 Ape1/Ref-1 表达增加；三羟基异黄酮下调 Ape1/Ref-1 表达对 NF-κB 活性的影响； 4. 调控 Ape1/Ref-1 对协同效应的影响及可能机制：应用外源性干预（Ape1/Ref-1 RNAi 转染）对 A549 细胞增殖抑制影响；Western blot 法及 EMSA 法分别检测 APE1 蛋白的表达及 NF-κB 活性影响来验证下调 Ape1/Ref-1 与 NF-κB 的协同效应及可能机 制。 研究结果 1. 三羟异黄酮防护放射性肺损伤的效应观察：病理检测显示照射后时间越长，放 射性肺损伤小鼠肺纤维化越重，三羟异黄酮能减轻肺组织炎症及纤维化；照射后小鼠 血清及肺泡灌洗液中 TGF-β1、IL-6、IL-1 和 TNF-α 等炎性因子和肺组织羟脯氨酸的 含量也呈递增趋势，三羟异黄酮能降低各种炎性因子和羟脯氨酸的含量 (P&0.05) ，尤 其是照射前 24h 给予三羟异黄酮能达到与照射前 30 分钟给予氨磷汀类似的疗效。 2. 三羟异黄酮防护放射性肺损伤的机制探讨：经射线照射后，A549 细胞内 ROS 含量明显升高， 三羟异黄酮能明显降低胞内 ROS 的表达； 三羟异黄酮能下调放疗所致 的 APE1 蛋白及 NF-ΚB 表达的升高（P&0.05） 。 3. 验证调控 Ape1/Ref-1 对 NF-κB 协同效应的影响：HpD-PDT 作用后，A549 细 胞增殖受抑、凋亡增加显著高于对照组（P&0.05） ，其抑制效率依赖于 HPD 浓度及激 光剂量，同时 Ad5/F35-APE1 siRNA 联合 PDT 对 A549 细胞具有更明显的增殖抑制作 用，胞内 ROS 含量及炎性因子的表达显著升高（P&0.05） 。HpD-PDT 诱导 A549 细胞9第三军医大学硕士学位论文APE1 蛋白表达增强在 24h 达到高峰，10MOI Ad5/F35-APE1 siRNA 重组腺病毒感染 A549 细胞 48 小时抑制 APE1 表达最为显著。 结论 1. 放射性肺损伤小鼠模型研究显示，辐射诱导肺组织核蛋白 APE1/Ref-1 表达显 著增高， 呈现由胞核向胞浆移位并先增高后降低特征； 辐射诱导 APE1/Ref-1 表达增加 和异位表达，可通过其 DNA 损伤修复和/或氧化还原功能影响放射性肺损伤修复。 2. APE1/Ref-1 是炎性因子的调控因子，血清/ 肺泡灌洗液 TGF-β1、IL-6、 IL-1β 和 TNF-α 含量是放射性肺损伤的预测指标。 研究发现为预测放射性肺损伤的发生提供 了生物学预测指标。 3. 三羟异黄酮调控 APE1/Ref-1 表达防护放射性肺损伤的重要作用并阐明了其调 控机制。三羟异黄酮可显著减轻放射性肺损伤小鼠肺泡腔内炎性渗出以及肺组织羟脯 氨酸含量和胶原纤维沉积，其作用机制与其降低 APE1/Ref-1 及 NF-ΚB 表达从而减轻 炎性因子分泌有关。研究发现为放射性肺损伤的防治提供了新的手段和方法。 4. 三羟异黄酮对防护放射性肺损伤具有独特优势。对于肺部肿瘤放射治疗，三羟 异黄酮在下调 Ape1/ Ref-1 表达防护 RILI 的同时，尚可通过调控其 DNA 损伤修复和 Redox 双功能增加肺癌细胞放射治疗敏感性。 5. Ad5/F35-APE1 siRNA 重组腺病毒能显著增强 A549 细胞 PDT 敏感性，主要是 通过 2 种机制实现的：一方面通过抑制 A549 细胞 PDT 后的 DNA 损伤修复能力；另 一方面通过抑制 A549 细胞对 PDT 所致氧化损伤的修复。 6. PDT 可诱导肺腺癌 A549 细胞 APE1 蛋白表达增强， 但通过 Ad5/F35-APE1 siRNA 可抑制 PDT 诱导的 APE1 蛋白的表达。 关键词：人肺腺癌细胞；放射性肺损伤；三羟异黄酮；Ape1/Ref-1； 光动力学疗法；血卟啉衍生物；Ad5/F35-APE1 siRNA 重组腺病毒； ROS；NF-κB；炎性因子；羟脯氨酸。10第三军医大学硕士学位论文下调 Ape1/Ref-1 在 Genistein 防护放射性肺损伤和 PDT 对 非小细胞肺癌杀伤作用的实验研究第一章 前 言肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，居所有恶性肿瘤死因的首位，其发病率及死 亡率呈逐年增长的趋势。放射治疗是胸部肿瘤最主要的治疗手段之一，而放射性肺损 伤( radiation-induced lung injury, RILI) 包括放射性肺炎(radiation-induced pneumonitis, RIP) 和放射性肺纤维化(radiation-induced fibrosis, RIF)作为胸部肿瘤放疗常见的严重 目前普遍认为由 ROS (reactive oxygen 并发症和剂量限制因素， 尚缺乏有效防护手段[1]。 system, ROS)驱动氧化应急反应启动的“炎性细胞因子级联效应”是介导和放大 RILI 的 核心事件[2-5]。已有研究证实，核转录因子-κB（nuclear factor kappa B, NF-κB）可为电 离辐射刺激活化， 通过上调 NF-κB DNA 结合活性介导炎性细胞因子释放， 抑制 NF-κB 能有效减轻炎性反应[6, 7]。明确电离辐射活化 NF-κB 的信号通路是选择性抑制 NF-κB 活性的分子靶点。多功能蛋白脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶 / 氧化还原因子（ apurinic/ apyrimidinic endonuclease 1/ redox factor-1, Ape1/Ref-1），作为一种重要的低氧诱导细 胞凋亡、坏死和氧化应激的保护基因，具有 DNA 氧化还原和损伤修复双功能，能通 过改善生物体对缺氧和氧化应激的适应性，最大程度地减轻细胞损伤 [8]。 Ape1/Ref-1 是 DNA 碱基切除修复(base excision repair, BER)的关键限速酶[9]，是基因毒性药物致 伤、细胞放射性损伤及其他氧化损伤的重要修复因子。Ape1/Ref-1 通过氧化还原机制 调节 AP-1、p53、myb、HIF-1α，NF- κB 等转录因子的 DNA 结合活性及下游靶基因 VEFG 等表达，而参与氧化应激、细胞周期调控及凋亡等多种关键的细胞反应[10]。这 些转录因子与肿瘤氧化损伤的耐受密切相关， 因此就可能通过下调 Ape1/ Ref-1 表达抑 制 NF-κB 活性, 而增加 Ape1/ Ref-1 表达则激活 NF-κB[11, 12]。 我们前期研究证实 5,7,4/三羟基异黄酮（genistein）是一种值得深入研究的辐射防护剂 [13]，然而，三羟异黄酮 是否能通过下调 Ape1/ Ref-1 表达降低 NF-κB 活性从而防护 RILI 仍不清楚。 5,7,4’-三羟基异黄酮（genistein）是多酚类化合物中的一种特殊类型，是大豆异黄 酮的主要成分。我们前期的研究已证实三羟基异黄酮可依赖其类雌激素活性并通过直 接刺激血细胞生成防护放射性造血损伤[14]。RNA 干扰(RNA interference ,RNAi) 是由 双链 RNA (double-strand RNA, dsRNA) 引起的转录后基因沉默机制(posttranscriptional11第三军医大学硕士学位论文gene silencing，PTGS) ，具有序列高效性、低毒性及特异性，RNAi 作为一项全新的 基因阻断技术，是当前最具卓越应用前景的抗肿瘤基因治疗方式 , 近年倍受人们的关 注和研究 [15] 。因对细胞天然的感染性，病毒载体成为重要的基因载入手段，目前腺 病毒载体、逆转录病毒载体和 AAV 载体等病毒载体已经成功应用于导入 shRNA(short hairpin RNA)。其中，腺病毒载体具有宿主范围广、感染效率高、无 DNA 整合、包装 容量较大、制备方便且易纯化和浓缩等特点，成为目前基因治疗研究和临床试验中应 用最为广泛的病毒载体之一[16]。 本研究拟复制放射性肺损伤小鼠模型，通过不同时间点给予三羟异黄酮及氨磷 汀，重点观察 RILI 发生发展及其与血清、肺泡灌洗液中炎性细胞因子（IL-1、TNF-α、 IL-6、TGFβ1），细胞内的 ROS 和肺组织羟脯氨酸含量的时效关系，阐明三羟异黄酮 对 RILI 的防护效应；同时应用 RT-PCR 、 ELISA 、 EMSA 技术和 RNA 干扰沉默 Ape1/Ref-1 基因， 以期探讨下调 Ape1/Ref-1 抑制 NF-κB 活性在三羟异黄酮防护放射性 肺炎中的作用。本研究从 Ape1/Ref-1 基因角度探讨三羟异黄酮协同抗炎和抗氧化分子 机理，从理论上进一步丰富了三羟异黄酮对辐射损伤的防护作用。12第三军医大学硕士学位论文第二章三羟异黄酮下调 Ape1/Ref-1 对放射性肺损伤防护作用 的实验研究放射治疗是胸部肿瘤最主要的治疗手段之一，而放射性肺损伤( radiation-induced lung injury, RILI) 包括放射性肺炎(radiation-induced pneumonitis, RIP) 和放射性肺纤 维化 (radiation-induced fibrosis, RIF)作为胸部肿瘤放疗常见的严重并发症和剂量限制 因素，目前尚缺乏有效防护手段[1]。DNA 的氧化损伤和 ROS (reactive oxygen system, 已有研究证实， ROS)驱动的“炎性细胞因子级联效应”是制约 RILI 治疗的关键问题[2-5]。 核转录因子-κB （nuclear factor kappa B, NF-κB） 可为电离辐射刺激活化， 通过上调 NF-κB DNA 结合活性可以介导炎性细胞因子的释放，相反，抑制 NF-κB 能有效减轻炎性反 应 [6, 7]。多功能蛋白脱嘌呤脱嘧啶核酸内切酶 / 氧化还原因子（ apurinic/ apyrimidinic endonuclease 1/ redox factor-1, Ape1/Ref-1）是 NF-κB 的氧化还原激活子，因为下调 Ape1/ Ref-1 表达可抑制 NF-κB 活性； 反之， 增加 Ape1/ Ref-1 表达则可激活 NF-κB[11, 12]。 既往研究证实 5,7,4/-三羟基异黄酮（genistein）是一种值得深入研究的辐射防护剂[14]， 研究证实，三羟异黄酮可通过下调 Ape1/ Ref-1 表达降低 NF-κB 活性从而增强治疗前 列腺癌的敏感性[12]。然而，三羟异黄酮是否能通过下调 Ape1/ Ref-1 表达降低 NF-κB 活性从而防护 RILI 目前仍不清楚。因为“炎性细胞因子级联效应”是介导和放大 RILI 的核心事件，而 NF-κB 活性与炎性细胞因子释放密切相关，我们推测三羟异黄酮可通 过 Ape1/Ref-1―NF-кB―炎性因子途径防护 RILI。 因此, 在本研究中， 我们检测 APE1/ Ref-1 在 RILI 不同阶段以及给予三羟异黄酮处理后的表达，并通过在体和离体试验观 察照射后 NF-кB 的变化，同时与氨磷汀（Amifostine，WR-2721）对照研究小鼠肺组 织的病理改变、血清和肺泡灌洗液炎性因子及羟脯氨酸含量的变化，以期阐明三羟异 黄酮可通过 Ape1/Ref-1―NF-кB―炎性因子途径对 RILI 的防护效应，为放射性肺损伤 的治疗提供新的手段。2.1材料与方法2.1.1 材料 2.1.1.1 主要仪器和设备 LEICA AM 2135 型切片机13德国 Leica第三军医大学硕士学位论文电热恒温干燥箱 BX-50 型显微镜 PM-20 型显微摄像系统 电子天平 电子酸度计 温控微波炉 5415 型台式离心机 79-1 型磁力加热搅拌器 水平电泳仪和电泳槽 凝胶成像系统 PH 计 微量移液器 超低温冰箱 96 孔板 5804 型台式冷冻离心机 Precise 全数字化直线加速器 电热恒温水浴箱 2.1.1.2 主要试剂和试剂盒 鼠抗人 APE1 单克隆抗体 DPX 封片剂 甲醛 H2 O2 DAB 显色试剂盒 甲醇 三羟异黄酮 氨磷汀 DCF 探针 鼠抗人 β-actin 单克隆抗体 EMSA 试剂盒 ELISA 试剂盒14上海跃进医疗器械厂 日本 Olympus 日本 Olympus 美国 sartotius 美国 Beckman 中国 Galanz 德国 Eppendorf 江苏中大仪器厂 美国 Bio-Rad 美国 Bio-Rad 美国 sartotius 法国 GILSON 美国 NUAIRE AB gene 德国 Eppendorf ELEKTA 公司 北京长风仪器仪表公司美国 Novus Biologicals 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司 北京化学试剂公司Power VisionTM(IgG 抗体-HRP 多聚体)复合物 北京中杉金桥生物技术有限公司 北京中杉金桥生物技术有限公司 北京化学试剂公司 美国 Sigma 印度太阳药业 美国 Sigma 美国 Sigma ThermoFisher cientific 深圳 NeoBioscience 公司第三军医大学硕士学位论文羟脯氨酸试剂盒 2.1.1.3 主要试剂配制 1.1 3% H2O2-甲醇 30% H2O2 甲醇 1.2 0.01mol/L PBS 0.2mol/L PB NaCl 双蒸水 2.1.2 方法 2.1.2.1 动物、细胞株南京建成科技有限公司50ml 定容至 500ml50ml 8.8g 定容至 1000ml8周龄 C57BL／ 6J雌性小鼠 60只，体重 (20±2)g，购于第三军医大学大坪医院实验 动物中心，利用随机数字表把小鼠分为 4组： ①对照组（ Control组） 10只； ②单纯照 射组 （R组） 10只； ③三羟异黄酮+照射组 （GEN+R组） 30只； ④氨磷汀+照射组 （Ami+R 组）10只。三羟异黄酮(纯度≥98%，Sigma Inc) 以生理盐水为溶剂，分别于照射前24 小时、16小时、8小时，以200mg/Kg皮下注射[17.18]；氨磷汀(印度太阳药业Inc) 以生理 盐水为溶剂，按 100 mg/kg于照射前 30分钟皮下注射；均饲养于标准层流动物房。人 A549肺腺癌细胞株（ATCC序列号 CCL-185）：由第三军医大学新桥医院肿瘤研究所 惠赠，常规传代培养。 2.1.2.2 照射方法 1%戊巴比妥钠肌肉注射 （50mg/Kg） 充分麻醉小鼠， 采用特制塑料鼠夹固定， 8MV X 线 ( Precise 全 数 字 化 直 线 加 速 器 ， ELEKTA 公 司 ) ， 吸 收 剂 量 率 0.5Gy ／ min ， SSD=100cm行全胸照射[19]。对照组小鼠在同等条件下肺部假照射0 Gy，其余各组小鼠 单次全胸照射(12±0.2)Gy。 2.1.1.3 肺组织病理学观察 解剖小鼠，取左肺组织于10％的中性甲醛固定，常规脱水、浸蜡、石蜡包埋、切 片（5μm）、HE染色及Masson三联染色，在光学显微镜下观察肺组织的病理改变。 2.1.1.4 流式分析仪检测细胞 ROS 含量 将 2.0×105 个/孔对数生长期的 A549 细胞接种于 24 孔板，每孔 0.5ml，贴壁后分为 6 组：对照组、单纯照射 5Gy 组、单纯照射 10Gy 组、单纯三羟异黄酮组、三羟异黄酮+ 照射 5Gy 组(Genistein+IR 5Gy 组)、三羟异黄酮+照射 10Gy 组(Genistein+IR 10Gy 组)；15第三军医大学硕士学位论文三羟异黄酮按终浓度 30μmol/L 于照射前 24 小时加入， 以 8MV X 线， 吸收剂量率 0.5Gy ／min，分别照射 5 Gy 或 10 Gy；处理结束后继续培养 24 小时；用 500ul 的 DMSO 充 分溶解 DCF(Sigma Inc) 1.7mg；配制 50mmol/L NaOH 溶液，取 500ul 加入 DCF 中， 溶液呈荧光黄绿色；室温下避光孵育 30min；取 15ml 离心管加入 6ml PBS，将已激活 的 DCF 加入其中，置于冰上备用；处理结束后用 PBS 洗细胞一次，用 2%血清/PBS 稀释 DCF 探针（1:20），而后加入各培养孔继续培养 1h；探针装载结束后用 PBS 收 集细胞，然后 PBS 洗细胞 2 次；应用流式细胞仪检测细胞内 ROS 含量。 2.1.1.5 Western-blot 检测 APE1 蛋白表达 取照射后各组小鼠右肺组织提取总蛋白， 上样后转膜 1.5 小时，鼠抗人 APE1/ Ref1 多克隆抗体(1：200 ，Novus 公司) 孵育 1.5 小时，HRP 标记的二抗(1：2000 ，Pierce 公司) 孵育 1.0 小时，化学发光试剂盒( Pierce 公司)显色 。 2.1.1.6 EMSA法测定NF-ΚB的表达 将 2×105 个/ 孔 A549 细胞接种于 24 孔板培养板，设对照组、单纯 Genistein 组、 单纯照射 5Gy 组、Genistein+IR 5Gy 组，三羟异黄酮终浓度为 30μmol/L，于照射前 24 小时加入；以 8MV X 线，吸收剂量率 0.5Gy／min，分别照射 5Gy，照射完毕后各培 养孔继续培养 12h。收集细胞按试剂盒说明书提取细胞核蛋白（Pierce 公司）备用。 分别取照射后 3 天各组小鼠右肺组织按试剂盒说明书提取细胞核蛋白（Pierce 公司） 备 用 。 NF-ΚB 探 针 ： 5’TCAACTCCCCTGAAAGGGTCCG NF-ΚB-R ，5’AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGCNF-ΚB-F。按照 EMSA 试剂盒说明书（ThermoFisher Scientific）进行 NF-ΚB 的检测。 2.1.1.7 双抗体夹心ELISA法测定血清及肺泡灌洗液中的炎性因子表达 照射后2周，1%戊巴比妥钠肌肉注射（50 mg/kg），充分麻醉后摘除眼球，行眶 静脉采血，血液搜集至干净的EP管，静置30分钟后，1000 rpm离心 3分钟，取上清置 于干净EP管中， -70℃冰箱保存。 切开颈部皮肤游离气管后， 用医用留置针行气管插管， 每次用1ml的生理盐水灌洗全肺并收集支气管肺泡灌洗液（BALF），重复 3次，共回 收约2ml，4℃，1000 rpm离心10分钟，收集上清液置于-70℃冰箱保存。按试剂盒说明 书采用 ELISA法测定血清及肺泡灌洗液中的 IL-1β 、 TNF-α 、 IL-6、 TGFβ1，绘制标准 曲线， 计算上述炎性因子浓度。 分别于照射后4、 8、 12周， 1%戊巴比妥钠肌肉注射 （50 mg/kg）麻醉小鼠，充分麻醉后摘除眼球，行眶静脉采血，血液收集至干净的 EP管， 静置30分钟后， 1000 rpm离心3分钟， 取上清置于干净EP管中， -70℃冰箱保存。 按ELISA 试剂盒（NeoBioscience公司）说明书测定血清中的TGFβ1，绘制标准曲线，计算TGFβ116第三军医大学硕士学位论文炎性因子浓度。 2.1.1.8 湿肺羟脯氨酸含量测定 采用比色法测定肺组织内羟脯氨酸含量。羟脯氨酸试剂盒购自南京建成科技有限 公司。分别于照射后 4、8、12 周，解剖小鼠，取出右肺组织，精确称取右上叶肺组织 匀浆，加入水解液后以 95℃加热水解，冷却后加入颜色指示剂和调 pH 的甲液，混匀， 再加调 pH 的乙液直至指示剂颜色变成黄绿色，调整 PH 值在 6-6.8 左右，然后加蒸馏 水至 10ml,混匀后取 3ml 稀释水解液，与适量活性炭混匀，离心后取上清 1ml，依次加 入试剂一、二、三各 0.5ml 混匀，60℃水浴 15 分钟，离心后取上清在 550nm 处做分 光光度计检测。以每 100 毫克肺组织中含羟脯氨酸量的微克数表示。 2.1.3 资料分析及统计学处理 各组计量资料均用 x ±s 表示，进行多样本均数两两比较的单因素方差分析和 t 检 验，P＜0.05 有统计学差异。采用 SPSS 13.0 软件进行分析。2.2结果2.2.1 小鼠肺组织形态学观察 对照组小鼠肺组织结构清晰，肺泡壁及毛细血管壁完整，无肺萎陷，支气管腔 及肺泡腔内未见炎性渗出物 （图2.1A） 。 而单纯放疗组肺组织照射后3d病变以渗出为 主，肺间质及肺毛细血管水肿、充血，肺泡腔及细支气管内见较多的炎性细胞，间 质水肿致肺泡壁轻度增厚，肺泡间部分含水肿液（图2.1B）。单纯照射后第4周和8 周，可见肺组织实变区呈斑片状分布，在支气管周围尤为明显。肺泡壁中度增厚， 壁内成纤维细胞和毛细血管数目增多，尚见淋巴细胞、巨噬细胞及多核巨细胞；肺 泡腔缩小，腔内可见巨噬细胞簇集成团，局部可见陈旧性出血灶。纤维化区可见大 量增生的纤维细胞和胶原纤维沉积，炎性细胞相对较少，出现明显的局灶性纤维化 （图2.1C） 。Gen+IR组各个时间点肺组织亦呈急性炎性到肺间质纤维化改变，但胶 原沉积、成纤维细胞灶形成以及炎性细胞浸润较单纯照射组明显减轻（图 2.1D- 图 2.1G） ，尤其是Gen 24h+IR组（图2.1F、G）和Ami+IR组（图2.1H、I） ，大部分肺泡 结构完整，仅见少量肺泡壁中度增厚，肺间质少量淋巴细胞浸润，肺泡间隔无明显 增宽，支气管、血管周围少量纤维胶原组织。Masson三联染色结果显示小鼠肺间质 内沉积大量蓝色胶原纤维，对照组仅见少量纤维组织（图2.2A）；单纯照射组于照 射后2周肺纤维组织逐渐开始增生 （图2.2B） ， 照射4周、 8周后形成明显的肺纤维化， 肺组织结构紊乱，并可见大量染成蓝色的胶原纤维沉积（图2.2C、D）。17第三军医大学硕士学位论文图2.1小鼠肺照射后组织形态学改变（HE×400)）A：对照组；B：IR组3d；C：IR组8周；D：Gen8h+IR组8周；E：Gen8h+IR组12周；F：Gen24h+IR 组8周；G：Gen24h+IR组12周；H：Ami+IR组8周；I：Ami+IR组12周；图2.2小鼠肺组织Masson三联染色显示肺组织在受照射后胶原纤维的变化（Masson×400） A：对照组；B：照射后2周；C：照射后4周；D：照射后8周18第三军医大学硕士学位论文2.2.2 活性氧（ROS）含量的测定 与对照组比较， A549 细胞经照射后细胞内 ROS 水平明显升高（ p&0.05 ） ；而 Genistein 联合照射处理显著地降低了细胞内 ROS 的生成，与对照组差异不明显，但 相比单纯照射组则显著降低（p&0.05） （见图 2.3） ，说明 Genistein 能够有效地抑制射 线所激发的靶细胞内大量活性氧物质的产生。图 2.3流式细胞术分析 A549 细胞内 ROS 含量2.2.3 Genistein 对放射性肺损伤小鼠肺组织 Ape1/Ref-1 表达的影响 Western blot 结果显示，对照组小鼠肺组织 Ape1/Ref-1 表达各时相点变化不大， 而在照射组小鼠肺组织 Ape1/Ref-1 表达随着小鼠放射性肺损伤的发生发展呈现先增高 后降低规律，照射后 1d Ape1/Ref-1 表达开始升高，第 3d 达高峰，明显高于对照组 （p&0.05），约是对照组 2.2 倍，此后随着小鼠放射性肺损伤发展逐渐降低，第 28d 与对照组水平相当，而第 56d 则仅为对照组的 1/5（p&0.05）（图 2.4）。于照射开始 前 24h 皮下注射三羟异黄酮 200mg/ Kg，照射后 3d，Western blot 结果显示，照射组 Ape1 蛋白表达量最高，其次为对照组，再次为单纯 GEN 组，而 Genistein+IR 组表达 量最低，提示 Genistein 可显著降低放疗诱导的 Ape1/Ref-1 表达升高（图 2.5）。19第三军医大学硕士学位论文图2.4Western blot 检测放射性肺损伤小鼠肺组织Ape1/Ref-1各时相点的表达图2.5Western blot 检测genistein对放射性肺损伤小鼠肺组织Ape1/Ref-1表达的影响2.2.4 EMSA 检测放射性肺损伤小鼠肺组织及 A549 细胞中 NF-ΚB 的表达 分别取照射后 3 天各组小鼠右肺组织提取细胞核蛋白检测 NF-ΚB 的表达， 其结果 显示：对照组小鼠肺组织中 NF-ΚB 的表达较低，其余各组与对照组相比均有所增高， 说明照射后肺组织中 NF-ΚB 的表达均不同程度增加，以单纯放疗组增加最显著 （p&0.05） 。经三羟异黄酮和氨磷汀分别预处理后 NF-ΚB 的表达增加不明显，说明照 射前 24 小时给予三羟异黄酮及照射前 30min 给予氨磷汀可以明显降低肺组织中 NF-ΚB 的表达，而照射前 16 小时及 8 小时给予三羟异黄酮则没有类似的作用（见图 2.6） 。A549 细胞经照射后 NF-ΚB 的表达明显增高，而给于 genistein 预处理后 NF-κB 表达量有所降低，说明下调 Ape1/ Ref-1 表达可抑制 NF-κB 活性（见图 2.7）。20第三军医大学硕士学位论文图 2.6EMSA 检测放射性肺损伤小鼠肺组织中 NF-ΚB 的表达 （ 1、 Genistein 24h+IR 组； 2、 Genistein16h+IR 组；3、Genistein 8h+IR 组；4、Amifostine +IR 组；5、单纯照射组；6、对照组）图 2.7EMSA 检测 A549 细胞中 NF-ΚB 的表达（1、单纯照射组；2、Genistein+IR 组；3、单纯Genistein 组；4、对照组）2.2.5 ELISA分析放射性肺炎小鼠血清和肺泡灌洗液中各炎性因子的表达 2.2.5.1 IL-1β蛋白含量 应用 ELISA 法检测三羟异黄酮对小鼠血清和肺泡灌洗液 IL-1β 蛋白表达的影响。 与对照组相比， 除照射前 24h 给予三羟异黄酮组小鼠肺泡灌洗液中 IL-1β 蛋白含量外， 其余各组均显著升高（P＜0.05） ，提示肺放射性损伤时存在 IL-1β 蛋白高表达。与单 纯放疗组相比， 照射前 24h 给予三羟异黄酮组和照射前 30min 给予氨磷汀组小鼠 IL-1β 蛋白显著降低（P＜0.05） ，而照射前 8h, 16h 给予三羟异黄酮无明显差异（P＞0.05） ， 表明经皮下注射途径应用三羟异黄酮防护放射性肺损伤，须在照射前 24h 给予才能达 到照射前 30min 应用氨磷汀的类似疗效，能显著降低血清和肺泡灌洗液中 IL-1β 蛋白 含量（见表 2.1, 表 2.2） 。 2.2.5.2 TNF-α蛋白含量 应用 ELISA法检测三羟异黄酮对小鼠血清和肺泡灌洗液 TNF-α蛋白表达的影响。 与对照组相比，照射前24h给予三羟异黄酮组小鼠血清TNF-α蛋白含量以及照射前16h,21第三军医大学硕士学位论文24h 给予三羟异黄酮组肺泡灌洗液 TNF-α蛋白含量无显著差异（ P＞ 0.05） ，而其余各 组均显著升高（ P＜ 0.05） 。与单纯放疗组相比，照射前给予三羟异黄酮各处理组和氨 磷汀组小鼠血清TNF-α蛋白均显著降低（P＜0.05） ，而肺泡灌洗液TNF-α含量在照射前 16h、24h给予GEN+R组也存在明显差异（P＜ 0.05） ，表明TNF-α可较为敏感地预测三 羟异黄酮防护放射性肺损伤效应（见表2.1, 表2.2） 。 2.2.5.3 IL-6蛋白含量 应用 ELISA法检测三羟异黄酮对小鼠血清和肺泡灌洗液 IL-6蛋白表达的影响。与 对照组相比，除外照射前 16h 给予三羟异黄酮组和氨磷汀组小鼠血清 IL-6，其余各组 IL-6均有显著升高（P＜0.05） ；与单纯放疗组相比，照射前8h给予三羟异黄酮组小鼠 血清IL-6含量明显升高 （P＜0.05） ， 其余各组IL-6含量虽有所降低， 但差异亦不显著 （P ＞0.05） ，而在肺泡灌洗液中各处理组IL-6蛋白含量均显示明显降低（P＜0.05） ，提示 相比肺泡灌洗液， 血清IL-6含量并非预测三羟异黄酮防护放射性肺损伤的合理指标 （见 表2.1, 表2.2） 。 2.2.5.4 TGFβ1蛋白含量 应用ELISA法检测三羟异黄酮对小鼠血清和肺泡灌洗液 TGFβ1蛋白表达的影响。 与对照组相比， 除照射前24h 给予三羟异黄酮组小鼠肺泡灌洗液中TGFβ1蛋白含量外， 其余各组均显著升高（ P ＜ 0.05 ） ，表明肺放射性损伤小鼠血清和肺泡灌洗液均存在 TGFβ1蛋白高表达，提示TGFβ1是预测急性放射性肺炎的较为敏感指标。与单纯放疗 组相比，照射前 24h 给予三羟异黄酮组小鼠血清 TGFβ1显著降低（ P＜ 0.05） ，而肺泡 灌洗液 TGFβ1 含量三羟异黄酮各处理组以及氨磷汀组均显著降低（ P ＜ 0.05 ） ，提示 TGFβ1可较为敏感地预测三羟异黄酮防护放射性肺损伤效应（见表2.1, 表2.2） 。表2.1IL-1β、TNF-α、IL-6、TGFβ1在各组小鼠血清中的含量（n=10, pg/ml, x ±s） IL-1β TNF-α 27.84±1.49 63.11±2.37* 55.12±4.18*◇ 37.02±3.57*◇ 32.58±2.67◇ 38.81±2.90*◇ IL-6 11.22±1.72 26.01±9.51* 39.75±1.06*◇ 14.45±2.19 17.63±5.55* 15.40±5.53 TGFβ1 .88 .81* 63.00* 97.88* 621.48*◇ .50*对照组 单纯放疗组 GEN 8h+IR组 GEN 16h+IR组 GEN 24h+IR组 Ami+IR组*90.52±4.61 215.09±7.38* 244.11±2.31* 252.26±7.38* 129.89±4.03*◇ 170.23±9.43*◇P&0.05与“对照”相比，◇ P&0.05与“单纯放疗组”相比。22第三军医大学硕士学位论文 表 2.2 IL-1β、TNF-α、IL-6、TGFβ1 在各组小鼠肺泡灌洗液中的含量（n=10, pg/ml, x ±s） IL-1β 对照组 单纯放疗组 GEN 8h+IR组 GEN 16h+IR组 GEN 24h+IR组 Ami+IR组*TNF-α 529.42±23.00 972.40±43.97* 867.49±20.00* 570.21±31.44◇ 544.42±14.23◇ 641.35±14.82*IL-6 320.87±6.89 948.48±56.49* 658.0±54.09*◇ 480.50±21.21*◇ 442.52±31.31*◇ 698.48±7.13*◇TGFβ1 127.37±8.19 650.00±8.93* 493.88±2.51*◇ 253.42±69.59* ◇ 159.59±0.91◇ 374.76±1.73*◇103.98±4.15 532.57±37.51* 454.41±39.81* 310.30±13.65* 115.19±7.52◇ 223.02±7.72*◇P&0.05与“对照”相比，◇ P&0.05与“单纯放疗组”相比。2.2.6. 肺组织羟脯氨酸的含量变化 各组结果分析显示， 照射后随时间延长， 各组小鼠肺组织羟脯氨酸含量逐渐增高， 说明照射后肺组织胶原蛋白水平上升，间接反映了其纤维化程度加重，是小鼠发生肺 间质纤维化的一个指征。与对照组相比，照射后4w，GEN+IR各组及氨磷汀+IR组羟脯 氨酸含量无显著差异（P＞0.05） ，维持在基本正常水平，而照射后8w、12w，GEN+IR 各组及氨磷汀 +IR 组羟脯氨酸含量高于对照组（ P ＞ 0.05 ） ；在照射后 3 个时间点上， GEN+IR各组和氨磷汀+IR组羟脯氨酸含量均明显低于单纯放疗组（P＜0.05） ，说明通 过皮下注射途径给予三羟异黄酮可以明显抑制辐射引起的肺组织羟脯氨酸含量增高， 与氨磷汀的效果类似， 表明三羟异黄酮对小鼠放射性肺纤维化具有一定的防治作用 （见 表2.3） 。表2.3 各组小鼠双肺组织羟脯氨酸含量(n=10, ug/100mg, x ±s) 4周 对照组 单纯放疗组 GEN 8h+IR组 GEN 16h+IR组 GEN 24h+IR组 Ami+IR组 51.206±0.878 146.781±0.492 87.010±1.430◇ 76.252±6.960◇ 79.569±18.872◇ 77.579±0.459◇ 8周 51.206±0.878 149.793±6.243 90.580±2.049◇ 92.014±0.512◇ 85.924±1.586◇ 78.084±0.051◇ 12周 51.206±0.878 156.211±5.296 93.130±0.102◇ 97.340±0.716◇ 94.890±0.615◇ 94.150±1.627◇◇ P&0.05 与“单纯放疗组”相比。23第三军医大学硕士学位论文2.2.7. ELISA 分析放射性肺纤维化小鼠血清 TGFβ1 的含量 照射后随时间延长，各组小鼠血清中 TGFβ1的表达也逐渐增强，照射后 12w达到 高峰（P＜0.05） 。在照射后4w、8w和12w这三个时间点上， GEN+IR各组及氨磷汀+R 组TGFβ1含量均高于对照组（ P＜ 0.05） ，表明肺放射性纤维化小鼠血清中存在 TGFβ1 蛋白高表达，提示TGFβ1与放射性肺纤维化的发生发展密切相关，是预测放射性肺纤 维化的较为敏感指标；同时，与单纯放疗组相比，GEN+IR各组小鼠TGFβ1含量均明显 降低（P＜0.05） ，该作用与Ami+R组比较无明显差异（P&0.05） ，提示三羟异黄酮对放 射性肺纤维化的保护作用与氨磷汀类似（见表2.4） 。表2.4各组小鼠血清TGFβ1含量(n=10, pg/100mg, x ±s) 4周 8周 .90 .37 .53◇ 77.632◇ .89◇ .11◇ 12周 .90 .00 61.84◇ 76.32◇ 8.42 .37对照组 单纯放疗组 GEN 8h+IR组 GEN 16h+IR组 GEN 24h+IR组 Ami+IR组.90 .63 .89474◇ 30.26◇ .21◇ .21◇◇ P&0.05与“单纯放疗组”相比。2.3讨论恶性肿瘤严重威胁着人类的生命健康。放射治疗是胸部肿瘤最主要的局部治疗手 段之一 [20] ，而放射性肺损伤 ( radiation-induced lung injury, RILI) 包括放射性肺炎 (radiation-induced pneumonitis, RIP) 和放射性肺纤维化(radiation-induced fibrosis, RIF) 作为胸部肿瘤放疗常见的严重并发症和剂量限制因素，其发生率达5~15%，一旦发生， 通常引起严重的临床后果[21]，临床上亟待寻找一种理想的辐射防护剂。 放射性肺损伤动物模型建立对进一步研究放射性肺损伤机制及防治至关重要。目 前以建立放射性肺损伤鼠类动物模型应用最为广泛。虽然小剂量多次照射被认为更符 合临床常规治疗剂量， 但对放射肺损伤进行短期研究， 目前多采用大分割单次照射法， 如孟玲玲等采用6MV-X线单次照射小鼠右肺30Gy，观察至照射后2个月[22]。在本实验 中我们应用 8 周龄 C57BL/ 6J 雌性小鼠，采用 12Gy 全肺单次照射构建放射性肺损伤模 型， 通过肺组织HE、 Masson染色检测小鼠肺组织炎性病理改变和胶原纤维沉积， ELISA24第三军医大学硕士学位论文法检测 TNF-α、 IL-1β、 IL-6 和 TGF-β1等炎性因子表达，以及比色法测定肺组织羟脯 氨酸的含量，我们成功构建放射性肺损伤小鼠动物模型，与刘英等[23]和韩光等[24]报道 的相似。 新近的研究认为放射性肺损伤( radiation-induced lung injury, RILI)的发生是一个 由多种细胞参与并相互作用而产生的多种因子共同调控的复杂病理过程[25.26]。一旦靶 细胞即肺泡Ⅱ型上皮细胞、血管内皮细胞等受辐射损伤后，立即合成和分泌多种生长 因子和抑制因子，并持续至放射后数周至数月，如肿瘤坏死因子 (TNF)、纤维母细胞 生长因子β(FGFβ)、转化生长因子(TGFβ)、表皮生长因子(EGF)、白介素1(IL-1)、白介 素6(IL-6)、 血小板源性生长因子(PDGF)和纤维连接素(fibronec-tion)等[27.28]， 其中TGFβ1 起着关键性的作用 [29.30]。已有研究证实肺泡 II型上皮细胞和纤维母细胞是表达 TGFβ1 的主要细胞；TGFβ1主要作用于胶原的转录和翻译过程，诱导肺脏高水平表达结缔组 织生长因子，加速肺纤维化发生[31、32]。TGFβ1高表达的患者发生放射性肺纤维化的几 率较低表达水平者要高，且更严重。新近的研究结果均表明，肺的成纤维细胞增殖和 细胞外基质增加应归咎于肺实质细胞产生的TGFβ1的作用，TGFβ1是诱发放射性肺纤 维化的主要细胞因子。 羟脯氨酸是胶原纤维中特有的一种成分， 占正常胶原蛋白的13.4 ％左右，其含量恒定，参与了肺纤维化的发展，能直接反映肺组织内胶原纤维的变化 情况。分析羟脯氨酸含量可以为病理状态下的肺纤维化提供一个可靠的量化指标，已 广泛应用于肺纤维化的研究。本研究中，我们应用ELISA法检测放射性肺炎小鼠血清 和肺泡灌洗液 TNF-α 、 IL-1β、 IL-6 和 TGF-β1蛋白表达的变化，发现电离辐射均可导 致四种炎性因子表达显著升高，其中TGFβ1, IL-1β相比较TNF-α和IL-6更是较好地预测 放射性肺损伤的敏感指标。 这与国内外其他学者认为血浆TGF-β1水平可作为放射性肺 损伤预测因子的研究结果相一致[33-36]。同时，我们应用ELISA法检测放射性肺纤维化 小鼠血清TGF-β1表达的变化和比色法检测肺组织中羟脯氨酸含量的变化， 发现电离辐 射可导致TGFβ1和羟脯氨酸表达显著升高，照射后随着时间延长，TGFβ1和羟脯氨酸 的表达亦逐渐增强，其表达水平的高低反映了放射性肺纤维化的严重程度，其中血清 的TGFβ1相比较肺组织的羟脯氨酸更能敏感地预测肺放射性肺纤维化。 目前放射性肺损伤最常用的治疗方法仍是使用肾上腺皮质激素， 同时辅以抗生素、 支气管扩张剂、给氧等对症治疗措施，但并不能有效预防或逆转放射性肺炎及进一步 的肺纤维化。我们前期研究证实5,7,4/-三羟基异黄酮（genistein）是一种值得深入研究 的辐射防护剂， genistein是多酚类化合物中的一种特殊类型，是大豆异黄酮的主要成 分[14]。本研究结果清楚的显示：在总体趋势上，除对照组外，其余各实验组小鼠的肺25第三军医大学硕士学位论文组织按照射后时间延长呈现由肺泡炎至肺纤维化的动态变化，与文献报道一致[20]。照 射前24小时, 16小时或8小时皮下注射三羟异黄酮与照射前30 min皮下注射氨磷汀组比 较，各组肺组织均出现急性炎症到肺纤维化变化，但与单纯放疗组对比，炎症范围缩 小，肺间质及肺泡壁毛细血管充血情况减轻，炎性渗出减少，后期胶原纤维增生减少， 表明放疗前给予Genistein可明显缓解急性放射性肺炎及放射性肺纤维化反应，与氨磷 汀一样对放射性肺损伤有明显的防护作用。 近年来大量研究发现，核转录因子-κB (NF-κB）在介导炎性细胞因子释放中扮演 着重要角色 [6, 7]，三羟基异黄酮淬灭辐射诱导的自由基和抑制氧化应激诱导的 NF-κB DNA结合活性是其抗辐射作用的主要分子基础[37-39]。前期的研究证实，三羟基异黄酮 可通过下调 Ape1/ Ref-1 表达降低 NF-κB 活性 [11] 。本研究通过 Western bolt 方法检测 Ape1/Ref-1在小鼠放射性肺损伤不同阶段的表达情况发现 Ape1/Ref-1 表达先增高后降 低：照射后1d开始升高，3d达高峰，约是对照组2.2倍，此后随着小鼠放射性肺损伤发 展逐渐降低，28d降至对照组水平，56d明显低于对照组，约是对照组的1/5。这可能与 电 离 辐 射 产 生 的 大 量 ROS 使 肺 组 织 细 胞 处 于 氧 化 应 激 状 态 ， 从 而 代 偿 性 合 成 Ape1/Ref-1蛋白以满足调控参与细胞氧化应激反应的转录因子，而随着放射性肺损伤 进展，肺损伤修复过程中消耗的Ape1/Ref-1蛋白超过了肺组织细胞的合成有关[40]。照 射前24h给予genistein预处理，采用Western Blot法检测表明，单纯放疗组Ape1/Ref1蛋 白表达量最高，其次为对照组，再次为单纯GEN组，而Genistein+IR组表达量最低，故 可以认为给予Genistein预处理降低了放疗所致的Ape1/Ref1蛋白升高。已有研究表明， Ape1/Ref-是NF-κB的氧化还原激活子，下调Ape1/ Ref-1表达可抑制NF-κB活性，增加 Ape1/ Ref-1表达则激活NF-κB[11, 12]。本研究通过在体和离体试验均取得一致的结果： 照射后NF-κB的表达明显增加，而给于genistein或Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒预处理 后NF-κB表达量有所降低， Genistein+Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒协同处理后表达量最 低，进一步验证Ape1/Ref-是NF-κB的氧化还原激活子。 研究结果还显示：射线能明显地刺激靶细胞内产生大量 ROS， Genistein能有效抑 制照射后细胞内ROS表达的升高；应用ELISA法检测三羟异黄酮对小鼠血清和肺泡灌 洗液中IL-1β、TNF-α、IL-6、TGF-β1等急性炎性因子表达的影响，研究发现三羟异黄 酮经皮下注射途径给药防护肺损伤，须在照射前24h给予才能达到照射前30min应用氨 磷汀的类似疗效，降低炎性因子表达，相比IL-1β，TNF-α是预测三羟异黄酮防护放射 性肺损伤效应的较为敏感指标，而肺泡灌洗液IL-6水平相比血清是预测三羟异黄酮防 护放射性肺损伤的合理指标。本研究还发现，在照射后4w、8w、12w，各实验组小鼠26第三军医大学硕士学位论文TGFβ1相对含量明显高于对照组，这种增高的趋势从第4周就开始，第12周达到高峰， 而羟脯氨酸的含量也逐步增加，两者动态的变化趋势与小鼠肺纤维化的病理发展过程 相关，至于TGFβ1不仅是预测急性放射性肺损伤的较为敏感指标，而且可较为敏感地 预测三羟异黄酮防护放射性肺损伤效应TGFβ1较羟脯氨酸更能敏感合理地预测放射性 肺纤维化。Genistein能明显抑制照射后TGFβ1和羟脯氨酸的表达，在所测的3个时间点 上Gen+IR各组和Ami+IR组的TGFβ1和羟脯氨酸的相对含量都低于单纯照射组， 且均维 持在较低水平，特别是照射前24h给予三羟异黄酮能达到照射前30min应用氨磷汀的类 似疗效。 总之，Genistein可防护放射性肺损伤，其机制之一可能是通过降低Ape1/Ref1蛋白 表达从而下调NF-κB以此减少炎性因子合成来实现的。随着分子生物学研究的进一步 发展，Genistein防护放射性肺损伤的更多分子机制将被逐一揭开，这必将会为临床防 护放射性肺损伤提供一条新的、有效的治疗途径。27第三军医大学硕士学位论文第三章Ad5/F35-APE1 siRNA 重组腺病毒联合 HpD-PDT 对非小 细胞肺癌杀伤作用的实验研究肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，居所有恶性肿瘤死因的首位，且其发病率和 死亡率呈逐年增加趋势，尽管手术、放疗、化疗和生物治疗等有了长足进步，但目前 肺癌患者的长期生存率仍不理想，亟待探索肺癌治疗新手段 [41.42]。血卟啉衍生物（hematoporphrphyrin derivative, HpD） 介导的光动力治疗 （Photodynamic therapy， PDT） 利用肿瘤细胞选择性吸收光敏剂并在特定波长激光照射下活化光敏剂产生光化学反应 杀伤细胞的肿瘤微创治疗方法， 在肺癌治疗中具有重要地位[43. 44]。 在有氧条件下， PDT 通过合适波长光激发靶细胞内光敏剂产生活性氧物质（reactive oxygen species，ROS）直 接损伤肿瘤细胞、使微血管受损造成癌组织血流灌注减少以及产生多种炎性因子而致细 胞发生凋亡或坏死。肺癌细胞可表达脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（apurinic apyrimidinic endonuclease，APE1）[45]，APE1/ Ref-1 作为一种氧化应激和低氧诱导细胞凋亡、坏死 的重要保护基因，具有氧化还原和 DNA 损伤修复的双功能，并通过调节生物体对氧 化应激和缺氧的适应性，最大程度地减少细胞损伤[46]。本研究应用本室前期构建的重 组腺病毒 Ad5/F35-APE1 siRNA 干扰载体，采用 MTT、流式细胞术法、ELISA 法和 Western blot 检测 HpD-PDT 对 A549 细胞的杀伤作用，为今后以 APE1 为靶点联合 HpD-PDT 治疗肺癌提供理论依据。3.1材料与方法3.1.1 材料 3.1.1.1 主要仪器和设备 低温离心机 超净工作台 CO2 细胞培养箱 -80℃超低温冰箱 PH 计 DHG-9203A 型电热恒温鼓风干燥箱 凝胶成像系统 德国 Heraeus 公司 苏州净化设备公司 美国 Thermo 公司 日本 Sanyo 美国 sartotius 上海精密实验股份设备有限公司 美国 Bio-Rad 公司28第三军医大学硕士学位论文CKX41 型倒置显微镜 水平电泳仪 电热恒温水浴箱 电子天平 5804 型台式冷冻离心机 直线加速器 TS-1 型脱色摇床 DMN-9602 酶标分析仪 Elixl Rios 纯水系统 79-1 型磁力加热搅拌器 电热恒温干燥箱 630PDT 激光治疗仪 5415 型台式离心机 3.1.1.2. 主要材料和试剂 鼠抗人 APE1 单克隆抗体 SDS RPMI 1640 培养基 胎牛血清 TEMED 磷酸盐缓冲液(PBS) 青霉素 链霉素 聚丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺 鼠抗人 β-Actin 单克隆抗体 胰蛋白酶 N’N’-亚甲双丙烯酰胺，丙烯酰胺 四甲基偶氮唑盐(MTT) Triton X-100 BSA 尿素 甲酰胺日本 OLYMPUS 美国 Bio-Rad 北京长风仪器仪表公司 美国 sartotius 德国 Eppendorf 瑞典 ELEKTA 江苏海门其林贝尔仪器制造公司 北京普朗新技术有限公司 美国 Millipore 公司 江苏中大仪器厂 上海跃进医疗器械厂 德国 Diomed 公司 德国 Eppendorf美国 Novus Biologicals 美国 Ameresco 美国 Hyclone 美国 Hyclone 美国 Ameresco 北京中杉金桥生物技术有限公司 华北制药股份有限公司 华北制药股份有限公司 美国 Ameresco 美国 Sigma 美国 Hyclone 美国 Ameresco 美国 Sigma 美国 Ameresco 美国 Ameresco 美国 Ameresco 美国 Ameresco29第三军医大学硕士学位论文葡聚糖凝胶 T4 多聚核苷酸激酶(T4 PNK) 6×上样缓冲液 [γ-32P]ATP X 光片 二硫苏糖醇(DTT) 二甲基亚砜(DMSO) 血卟啉衍生物(HpD) Vybrant? Apoptosis Assay Kit 鼠抗人 Rb 单克隆抗体 抗鼠 IgG-HRP 二抗 抗鼠 IgG-TRITC 二抗 化学发光试剂 DAB 显色试剂盒 RPMI 1640 培养基 低熔点琼脂 溴化乙啶(10mg/ml) Hepes PMSF，Aprotinin，Leupeptin 3.1.1.3 细胞株美国 Ameresco 宝生物工程(大连)有限公司 宝生物工程(大连)有限公司 北京市福瑞生物工程公司 美国 Pierce 美国 Ameresco 美国 Sigma 重庆华鼎现代生物制药公司 美国 Invitrogen 美国 Santa Cruz 美国 Pierce 美国 Pierce 美国 Pierce 北京中杉金桥生物技术有限公司 美国 Hyclone 北京夏新生物有限公司 美国 Promega 美国 Hyclone 美国 Sigma人 A549 肺腺癌细胞株(ATCC 序列号 CCL-185)：由第三军医大学新桥医院肿瘤研 究所惠赠。 3.1.1.4 腺病毒 Ad5/F35-APE1 siRNA 重组腺病毒： 参照 Wang D [54]设计的有效 APE1 siRNA 序列， 应用 Ambion 公司在线设计软件(www.ambion.com)确定 APE1 siRNA cDNA 序列， 并由第 三军医大学大坪医院肿瘤中心 Xiang DB 博士根据此序列设计构建 Ad5/F35-APE1 siRNA 重组腺病毒，本元正阳公司包装生产，病毒颗粒数 3.8×1011 VP/mL，感染性滴 度 1.6×1010 TCID50/mL，其包装流程见图 3.1。30第三军医大学硕士学位论文图 3.1 重组腺病毒 Ad5/F35-APE1 siRNA 包装流程图3.1.2 方法 3.1.2.1 MTT 法检测 Ad5/F35-APE1 siRNA 重组腺病毒联合 HpD-PDT 对 A549 细 胞增殖抑制作用 将 1×105/ ml A549 细胞 100μl 接种于 96 孔板培养板，设对照组、单纯 HpD-PDT 组和 Ad5/F35-APE1 siRNA 重组腺病毒联合 HpD-PDT 组，1 mg/ ml HPD 贮存液用 RPMI1640 完全培养基稀释至 2.5、5、10、20μg/ ml 4 个浓度，照光设 0.5、1、2、4、 6、8、10 J / cm2 7 种剂量，每组有 6 个复孔。HPD 浓度为 5μg/ ml，按 7 种激光剂量 0.5、1、2、4、6、8、10 J / cm2 对 5、10MOI Ad5/F35 APE1 siRNA 重组腺病毒感染组 A549 细胞进行 PDT 照射，每组有 6 个复孔。370C、5 % CO2 孵箱中培养 24 h 贴壁后 加入不同浓度 HpD 的完全培养基 200μl，再避光培养 24 h 使细胞充分吸收 HpD，予 不同剂量激光照射后立即换新鲜的 1640 完全培养基再继续避光培养 24 h。将上述处 理的细胞每孔加入 MTT 溶液(5 g/ L) 20μl ，继续避光培养 4h 后终止培养， 每孔加入31第三军医大学硕士学位论文150μl DMSO，振荡 10min，使紫色结晶完全溶解，在 492 nm 处用酶标仪检测各组 OD 值，重复 3 次取均值，根据测得的 OD 值按如下公式计算出细胞相对抑制率[ 7]： 相对抑制率(%)=（对照组 OD 值―实验组 OD 值）/对照组 OD 值×100% 3.1.2.2 流式分析仪检测细胞凋亡 将 1×105/ ml A549 细胞 100μl 接种于 96 孔板培养板，设对照组、单纯 HpD-PDT 组、单纯 Ad5/F35 APE1 siRNA 重组腺病毒组和 Ad5/F35 APE1 siRNA 重组腺病毒 +HpD-PDT 组，PDT 组按 HPD 浓度为 5μg/ ml，光照剂量 4 J / cm2 进行照射，Ad5/F35 APE1 siRNA 重组腺病毒感染剂量为 10MOI； PDT24h 后收集各组细胞， 计数后调整细 胞浓度为 5×105-1×106/ml；取 1ml 细胞，4℃ 800g 转速离心 5min，弃上清，加 4℃预 冷的 PBS 4ml 重悬细胞， 离心后加入 185μl 结合缓冲液重悬细胞， 再分别加入 5μl Pacific Blue? annexin V 和 1μl 7AAD；室温避光孵育 20min，应用流式细胞仪检测。 3.1.2.3 流式分析仪检测细胞 ROS 含量 将 2.0×105 个/孔对数生长期的 A549 细胞接种于 24 孔板，每孔 0.5ml，贴壁后分为 4 组：对照组、单纯 HpD-PDT 组、Ad5/F35 APE1 siRNA 重组腺病毒组和 Ad5/F35 APE1 siRNA 重组腺病毒+HpD-PDT 组，PDT 组按 HPD 浓度为 5μg/ ml，照光剂量 4 J / cm2 进行照射，Ad5/F35 APE1 siRNA 重组腺病毒感染剂量为 10MOI；处理结束后培养 24 小时；用 500ul 的 DMSO 充分溶解 DCF1.7mg；配制 50mmol/L NaOH 溶液，取 500ul 加入 DCF 中， 溶液呈荧光黄绿色； 室温下避光孵育 30min； 取 15ml 离心管加入 6ml PBS， 将已激活的 DCF 加入其中，置于冰上备用；处理结束后用 PBS 洗细胞一次，用 2%血 清/PBS 稀释 DCF 探针（1:20），而后加入各培养孔继续培养 1h；探针装载结束后用 PBS 收集细胞，然后 PBS 洗细胞 2 次；应用流式细胞仪检测。 3.1.2.4 ELISA 法检测 IL-1β 和 TGFβ1 将2.0×105个/孔对数生长期的A549细胞接种于24孔板，每孔0.5ml，24小时贴壁后分 为4组： 对照组、 单纯HpD-PDT组、 Ad5/F35 APE1 siRNA重组腺病毒组和Ad5/F35 APE1 siRNA重组腺病毒+HpD-PDT组，PDT组按HPD浓度为5μg/ ml，照光剂量4 J / cm2进行 照射，Ad5/F35 APE1 siRNA重组腺病毒感染剂量为10MOI；处理后继续培养24小时， 收集培养液，按试剂盒说明书采用ELISA法 （NeoBioscience） 测定细胞培养液中的IL-1β、 TGFβ1，绘制标准曲线，计算上述炎性因子浓度。 3.1.2.5 Western-blot 检测 Ad5/F35-APE1siRNA 对 APE1 蛋白表达的时效和量效 关系及对 HpD-PDT 诱导 APE1 表达的敲低作用 将 A549 细胞按 1×105 个/ 孔分别接种于 6 孔板和 96 孔板，其中一个 6 孔板以 1032第三军医大学硕士学位论文MOI 腺病毒 Ad5/F35-APE1 siRNA 感染细胞 4 小时后吸弃培养液，更换培养基后继续 培养 6、 12、 24、 48h 收集细胞； 另一 6 孔板分别以 1、 2.5、 5、 10 MOI 腺病毒 Ad5/F35-APE1 siRNA 感染细胞 4 小时后吸弃培养液，更换培养基后继续培养 48h 收集细胞，提取蛋 白后按上述步骤进行 Western blot 检测 APE1 表达。96 孔板设对照组、单纯 HpD-PDT 组、 Ad5/F35 APE1 siRNA 重组腺病毒组和 Ad5/F35 APE1 siRNA 重组腺病毒+HpD-PDT 组，腺病毒处理组给予 10 MOI Ad5/F35-APE1siRNA 感染 A549 细胞 24h，HpD-PDT 处理组按 HpD 浓度 5 μg/ml、激光 10 KJ/m2 照射，照射后继续培养 24h 收集细胞，提 取蛋白后按上述步骤检测 APE1 表达。 3.1.3 资料分析及统计学处理 数据采用 SPSS10.0 统计处理， 各组均数间差异显著性比较采用 t 检验进行， P&0.05 为统计学差异显著，P&0.01 为统计学差异非常显著。3.2结果3.2.1 MTT 法检测 Ad5/F35-APE1 siRNA 重组腺病毒联合 PDT 对 A549 细胞增殖 抑制作用 HpD-PDT对A549细胞增殖抑制作用的结果显示： PDT能明显地抑制A549细胞的生 长增殖，且HPD浓度及激光剂量是决定抑制效率的关键条件，即随HPD浓度增加和激 光剂量的增大，A549细胞相对抑制率逐渐升高，在较低的激光剂量下，抑制率曲线上 升迅速，后逐渐趋缓达平台期（见图3.2）。Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒联合PDT也显 示， Ad5/ F35-APE1 siRNA腺病毒能显著增强PDT对A549细胞的增殖抑制， 尤其当PDT 作用强度小于IC50时，Ad5/F35-APE1 siRNA的增敏作用更为明显（见表3.1）。图3.2PDT对A549细胞的增殖抑制作用成剂量依赖型抑制（不同光敏剂浓度和不同激光剂量组之间比较，P值均&0.01）33第三军医大学硕士学位论文 表1B MTT测定Ad5/F35-APE1 siRNA联合PDT对A549细胞的相对抑制率（%） PDT 0.125 7.52 13.67 25.65 59.12 78.35 90.18 95.63 Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒+PDT 5MOI 1.345 19.64 28.63 57.86 74.28 90.14 97.88 99.36 10MOI 2.787 39.86 58.48 75.43 88.16 96.52 99.17 99.84激光剂量(J / cm2) 0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.03.2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡 流式细胞仪检测凋亡结果显示： 对照组与单纯Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒组 A549细胞凋亡不明显， HpD-PDT处理后A549细胞凋亡细胞比例增加， 而Ad5/F35-APE1 siRNA 重组腺病毒联合 HpD-PDT 组凋亡最明显，与其余各组之间的差异显著 (P ＜ 0.01)(图3.3)。图 3.3流式细胞仪检测凋亡结果34第三军医大学硕士学位论文3.2.3 活性氧（ROS）含量的测定 与对照组比较， A549细胞经HpD-PDT和 Ad5/F35-APE1 siRNA分别处理后细胞内 ROS水平明显升高（p&0.05） ；而Ad5/F35-APE1 siRNA联合PDT处理显著地增加了ROS 的生成，与其余各组之间的差异显著（p&0.05） （见图 3.4） ，说明 PDT通过合适波长光 激发靶细胞内光敏剂产生大量活性氧物质。图 3.4流式细胞术分析 A549 细胞内 ROS 含量3.2.4. ELISA分析IL-1β和TGFβ1的表达 与对照组相比，其余各组细胞培养液中IL-1β和TGFβ1蛋白含量均显著升高（P＜ 0.05） ， 提示PDT照射后细胞内存在IL-1β和TGFβ1蛋白高表达。 与单纯HpD-PDT处理组 相 比 ， Ad5/ F35-APE1 siRNA 组 升 高 不 明 显 （ P ＞ 0.05 ） ， 而 Ad5/ F35-APE1 siRNA+HpD-PDT组则显著增高（P＜0.05） ，表明Ad5/ F35-APE1 siRNA腺病毒能显著 升高细胞培养液中IL-1β和TGFβ1蛋白含量， 增强PDT对A549细胞的杀伤作用 （图3.5A, 图3.5B） 。35第三军医大学硕士学位论文图 3.5ELISA 分析 IL-1β 和 TGFβ1 结果（A：IL-1β 的表达。与对照组相比，*p&0.05；与单纯 HpD-PDT 相比， p&0.05） （B：TGFβ1 的表达。与对照组相比，*p&0.05； 与单纯 HpD-PDT 相比， p&0.05）3.2.5 Ad5/F35-APE1siRNA 影响 APE1 蛋白表达的时效和量效关系检测 应用 Western blot方法进一步检测Ad5/F35-APE1siRNA影响 APE1蛋白表达的时效 关系显示，Ad5/F35-APE1 siRNA能有效降低APE1蛋白表达，Ad5/F35-APE1 siRNA感 染时间延长，APE1蛋白表达逐渐降低，其中感染后48小时降低最为显著（见图3.6A） ； 进一步检测Ad5/F35-APE1siRNA影响APE1蛋白表达的量效关系：10 MOI感染剂量的 重组腺病毒能最有效地抑制APE1（见图3.6B） ；HpD-PDT可诱导APE1表达增强，而与 对照组比较Ad5/F35-APE1 siRNA可有效敲低PDT诱导的APE1表达增强（见图3.6C） 。36第三军医大学硕士学位论文图3.6Western blot检测APE1蛋白表达（A：Ad5/F35-APE1siRNA敲低APE1蛋白表达的时效关系； B：Ad5/F35-APE1siRNA敲低APE1蛋白表达的量效关系； C：Ad5/F35-APE1siRNA对PDT诱导APE1表达增强的有效敲低作用）3.3讨论光动力治疗(photodynamic therapy，PDT)是一种微创、非产热方式引起局部组织坏死 的治疗手段，与传统疗法相比，它最大优势在于可以选择性地杀伤肿瘤细胞，对正常组 织损伤较小，能最大限度地保留正常组织和器官的结构和功能，可与手术、放疗、化 疗联合应用， 具有良好的临床应用前景[43]。 尽管 PDT 在肿瘤的治疗上具有良好的前景， 但由于肿瘤细胞可能对其治疗过程中的氧化损伤及 DNA 损伤具有一定的自身修复作 用， 导致 PDT 仍然存在着局限的穿透深度、 治疗抵抗或耐受及肿瘤复发等问题。 其中， 人肺癌细胞可表达脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)， 是一种受 Hsp27 等调控、 又能诱 导 VEGF 表达增高，对低氧和氧化应激诱导细胞凋亡具有保护作用的重要基因[48]，可37第三军医大学硕士学位论文通过其氧化还原和 DNA 损伤修复双功能从而防止 PDT