《紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性的测定》E= Ae×T/W ，Ae=A0-As+Ak，T= CV/A0×51/V0×17求公式解释。

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-08-18 09:09 标签： 土壤酶活性
一、脲酶测定(苯酚钠-次氯酸钠比色法)；脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物；1、试剂配制：；（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶；钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH；（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇；用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中；（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为；（5）N
一、脲酶测定(苯酚钠-次氯酸钠比色法)
脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：
（1） pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化
钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2） 苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后
用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3） 次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。 （4） 10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5） N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN
的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
标准曲线绘制：分别取0、0.5、1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5mL氮工作液置于25mL刻度试管中，加蒸馏水至10mL，再加2mL苯酚钠溶液和1.5mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容25mL。1h内再分光光度计上于578nm处比色。
2、操作步骤
（1）称取2.5ｇ土置于25mL刻度试管中, 加0.5mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15往瓶中加入2.5mL10%尿素液和5mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养3ｈ。（当脲酶活性为3~80微克NH3-N时，本法能获得可靠的结果。若脲酶活性小于3微克，培养时间需增至24h）。
（2）然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。对每一土样，设置用水代替基质的对照。对整个实验，进行无土壤基质的对照，以检验实验的纯度。
（3）取滤液0.5mL置于25mL刻度试管中,用蒸馏水稀释至5mL,然后加入2mL苯酚钠溶液,并立即加入1.5mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,
（4）在波长578ｎｍ处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
3、结果计算
以3/24小时后1g土壤中NH3－N的质量（mg）表示脲酶活性（Ure）
Ure＝a?V?n/m
式中：a为由标准曲线求得的NH3－N浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）0.5；n为分取倍数50；m为烘干土重（g）2.5。 注意事项：
1. 每一个样品应该做一个无基质对照，以等体积的蒸馏水代替基质，其他操作与样品实验
相同，以排除土样中原有的氨对实验结果的影响。
2. 整个实验设置一个无土对照，不加土样，其他操作与实验相同，以检验试剂纯度和基质
自身分解。
3. 如果样品吸光值超过标曲的最大值，则应该增加分取倍数或减少培养的土样。
二. 过氧化氢酶测定(紫外分光光度法)
1. 试剂配制
a. 0.3％过氧化氢溶液：按1:100将30%H2O2用水稀释
b. 1.5N 硫酸：取42mL浓硫酸，稀释后定容至500mL
c. 0.02N 高锰酸钾（1/5KMnO4）溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161g，溶于1升无CO2
蒸馏水中，贮于综色瓶中，备用。
d.饱和铝钾矾：十二水硫酸铝钾在20℃溶解度为10.84g,30℃的溶解度为15.41g
2. 操作步骤
（1）取2g风干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％H2O2溶液（现配）。同时设置对照，即三角瓶中注入40mL蒸馏水和5mL 0.3％过氧化氢溶液，而不加土样。将三角瓶放在振荡机上振荡20min后，迅速加入饱和铝钾矾溶液1mL, 6000rad离心15min。取上清液9mL加入盛有1mL1.5N硫酸（以稳定未分解的过氧化氢），摇匀后。溶液在240nm处比色，测定吸光度As。同时做无土对照A0和无机质对照Ak。
3. 结果计算
Ae?TC?V?51
?17 ,Ae?A0?As?Ak，T?
其中，E是土壤过氧化氢酶的活性； T是单位吸光度相当于过氧化氢的克数， A0是无土对照，即空白溶液的吸光度， As是样品溶液的吸光度， Ak是无基质溶液的吸光度 C是高锰酸钾的浓度，C=0.02mol/L
V是吸取V0mL（10ml）的无土对照即空白溶液用高锰酸钾滴定所消耗的高锰酸钾溶液体积，0.1。
W是有效土壤质量。?9?0.4g
数据获取时间：到 A01=0.084；
三、蔗糖酶测定（比色法）：
1、试剂配制
（1）3，5－二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20mL2N氢氧化钠和50mL水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过7天）。
（2）pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（23.876g磷酸氢二钠.12H2O溶于1L蒸馏水中）0.5mL加1/15M磷酸二氢钾（9.078g磷酸二氢钾溶于1L蒸馏水中）9.5mL即成。 （3）8％蔗糖溶液：80g蔗糖溶于1000mL水中 （4）甲苯
（5）标准葡萄糖溶液：将葡萄糖预先在80℃烘至恒重。然后取500mg溶于100mL蒸馏水
中，即成标准葡萄糖溶液(5mg还原糖/mL）。再将次液稀释10倍制成葡萄糖工作液(0.5mg/mL）。
标准曲线绘制：取0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5mL葡萄糖工作液，分别注入25mL刻度试管中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
2、操作步骤
称取5g过1mm筛的风干土，置于50mL三角瓶中，注入15mL 8％蔗糖溶液，5mL pH 5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。
到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液0.5mL，注入25mL刻度试管中，加1.5mL3，5－二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3－氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至25mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。
3、结果计算
以24h后1g土壤中葡萄糖的质量（mg）表示蔗糖酶活性（Suc）：
Suc＝a?V?n/m
式中：a为由标准曲线求得的葡萄糖浓度（mg/mL）；V为显色液体积（50mL）；n为分取倍数；m为烘干土重（g）。
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紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性
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