real-0271 real time clockper是用ct值比较 还是用增加倍数比较

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-08-27 02:33 标签： 0271 real time clock
Real-time qPCR 常见问题分析 - PCR实验 - 生物秀
标题: Real-time qPCR 常见问题分析
做标准曲线时候，可否用2个不同体系浓度的稀释分别对于内参和目的基因?建议最好用同样稀释倍数做曲线，因为模板浓度会影响扩增效率。2
熔解曲线中，Tm不出现在80度左右?扩增片段100bp左右的，一般应该出现在80度左右。如果低于此温度出现，可能是模板降解。3
1. 做标准曲线时候，可否用2个不同体系浓度的稀释分别对于内参和目的基因?
建议最好用同样稀释倍数做曲线，因为模板浓度会影响扩增效率。
2. 熔解曲线中，Tm不出现在80度左右?
扩增片段100bp左右的，一般应该出现在80度左右。如果低于此温度出现，可能是模板降解。
3. 扩增曲线没有Ct值，仅仅一条斜线?什么原因?
模板浓度过低或者模板降解。
4. 如果内参和目标基因表达量差别比较大，也就是目的基因的表达量少，
Ctcon=15，Cttarget=38，可否应用?
可以用于数据分析。因为表达量低，从而用过高模板进行扩增，从而同内标的模板不同，反而会增大数据统计的误差。
5. 引物浓度可否是50nM，是否太低?
如果扩增曲线和熔解曲线比较好，这个浓度当然可以。如果更低，扩增结果好的情况下，同样可以运用。
一句话，所有的模板、引物等浓度尽量不要用高的，会影响扩增效率。
6. miRNA多个扩增时候，如果一个的扩增效果比较，其它熔解曲线不止一个峰，如何解决?
primer对于miRNA是专一的。所以重新设计引物是不可取的。那么只能是提高Tm或者更换mastermix等。反应体系会影响反应产物的。
7. 相对定量方法，如果用Ct值比较，是各个样品平均后在2delt Ct还是分别2 delt Ct在平均比较好?
相对定量的方法各有优缺点，主要取决于实验的目的和材料的准备。如果是材料群体个体差异不大，这2种方法基本没有很大的区别;如果是个体差异比较大，建议用双标准曲线做。就是分别做内参和目的基因的标准曲线，分别带入Ct值计算。
8. 熔解程序可否不加?
如果是扩增效果好，特异扩增，可以不加熔解程序;但建议做好加上。
9. 扩增反应体系5uL，扩增效率低，什么原因?
反应体系小，各种因素的影响比较大，比如引物浓度、模板浓度及其金属离子等会影响扩增效率的。
10. 如何减少非特异性扩增的干扰?
设计一对好引物，提高primer的退火温度，以及设定吸光温度。
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应用荧光定量比较Ct值法测定基因相对表达量
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3秒自动关闭窗口定量pcr CT请问做荧光定量PCR时,CT值的结果在30左右,而不是20-25之间,这样的结果可信吗
西子BS80RJ96
请问你做Real Time PCR做几个循环的?40个吗?40个循环的话,CT值在30左右很正常的啊,CT值30的话大概是10000copies,说明模板含量低嘛,定量定量就是要CT值有大有小的才有比较嘛
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扫描下载二维码Real time pcr目的基因Ct值相差1,内参差不多是怎么回事?做了2次都这样,不想是加样的问题
浮生梦魇TA0496
用内参的方式进行realtime定量是不需要考虑加样量和反转录效率的问题的,因为结果都是和内参比,和内参同多同少.realtime不准是很常见的事,rna降解、引物特异性差、模板太浓或太稀等等许多因素都会影响,因此要优化,并多做对照和平行还有如果你定的是质粒上的基因,用内参就不可靠了,因为质粒的拷贝数是随细胞而异的
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恩 加样手抖了吧 平行性太差了会不会是模板的问题呢？我提了RNA后没跑电泳直接反转录，只测了OD值和浓度，浓度都是在1000ug/ul左右的，260/280也在1.8-2.0之间，会不会是RNA发生了降解，引起目的基因扩增不好？你是每个平行做三组吧 三组之间差别大怎么可能是模板问题呢 除非你说的是做三次差的多那我再做几次好了。之前也做过，都没这种问题啊。再请问一下，反转录后用cDNA做Actin的...
你是每个平行做三组吧 三组之间差别大怎么可能是模板问题呢 除非你说的是做三次差的多
那我再做几次好了。之前也做过，都没这种问题啊。再请问一下，反转录后用cDNA做Actin的普通PCR，结果很好，能说明RNA没有降解吗？
能吧 一般你溶好的RNA 最多-80放个两三周 不然肯定会有降解的
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Real-time+PCR检测弓形虫方法学的建立和初步应用.pdf53页
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