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Cyber Green核酸染料效果同于SYBR Green I
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详&细&地&址：天津滨海新区第四大街天大科技园B5-403
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产品详细说明
产品英文名称：
SYBR Green I
SYBR Green I核酸染料
EINECS编号：
&产品简介： & & &&
& & & & &Cyber Green核酸染料效果同于SYBR Green I，Cyber Green 核酸染料是一种高敏感性的荧光染液，用于检测琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶中的双链DNA和寡核苷酸。当染液与核酸结合后，Cyber Green 核酸凝胶染液的荧光信号会明显增强，因此经Cyber Green 核酸凝胶染液染色的凝胶显示出非常好的信躁比，没有背景荧光。凝胶在跑胶后进行染色，效果更佳。
& & & & &Cyber Green 用于低含量的PCR产物，凋亡研究及异源双链分析中少量DNA的检测较为理想。可应用于DNA和RNA的检测、SSCP及异源双链分析。
检测原理：
& & & & & Cyber Green 核酸绿1号是一种结合于所有DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，Cyber Green 核酸绿1号发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，Cyber Green 核酸绿1号的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。
& & & & &Cyber Green 核酸绿1号是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单,无须脱色或冲洗。至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100Cyber &Green 核酸绿1号与dsDNA结合荧光信号会增强800-1000倍，用Cyber Green 核酸绿1号染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。可适用于多种电泳分析。
光谱特性：
& & & &&Cyber Green 核酸绿1号的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
产品优势：
&& &&& 高灵敏： 至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。
　　信噪比高： 样品荧光信号强，背景信号低。
　　操作简单： 无须脱色或冲洗。
　　适用范围广： 可适用于多种电泳分析。
　　使用方便： 不影响其它修饰酶作用。
　　经济： 价格便宜。
&天津百萤生物还可以提供如下产品：&&&
1.&&可标签肽&
&2.&&可标记核苷酸&
&3.&&可标签肽和寡核苷酸&
&4.&&可标记蛋白质和寡核苷酸&
&5.&&蛋白质标记试剂盒&
&6.&&生物素相关产品&
&7.&多种定量检测试剂盒&
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&12.&多种活性检测试剂盒&
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&如需更多产品，请联系我们！&&
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&传真：022-
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天津百萤生物科技有限公司（Tianjin Biolite Biotech Co., Ltd）成立于2011年，位于京津环渤海经济圈的中心地带-天津滨海经济开发区，由多位海外留学归来的学者创立。 　　百萤生物围绕荧光发光、荧光标记、荧光探针等技术进行产品研发，公司产品广泛用于核酸蛋白定量、细胞凋亡研究、细胞信号通路研究、细胞及线粒体膜电位检测、细胞器染色、活体示踪、抗体标记等科研领域。 百萤生物与美国AAT公司合作，共同研发推出众多创新产品，百萤生物也是AAT公司设在国内的代表处。基于公司雄厚的科研能力及技术储备，我们推出的荧光染料光信号强、信噪比高、操作简便，大部分产品均为目前市售产品的下一代创新产品。
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Cyber Green核酸染料效果同于SYBR Green I相关产品报价
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> 荧光定量PCR
荧光定量PCR
服务分类：
&/&实验设计与外包
&/&分子生物学
区域/单位：
北京 / 丰台区
& & & &荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。我们公司供利用荧光定量PCR的方法对样品中的基因表达情况进行相对定量或绝对定量分析的技术服务。服务内容　　相对定量&(mRNA表达量分析)　　基因表达的研究一般采用相对定量的方法。相对定量法必须对样品的目的基因和内参基因同时分别进行定量，然后求出对于内参基因的目的基因的相对量。通过对样品间的目的基因的相对量进行比较，可以对不同样品间的mRNA进行表达量分析。内参基因通常选用表达量相对恒定的Housekeeping Gene，如：GAPDH、β-actin等。通过同时对内参基因的实时检测，可以对样品之间由于起始细胞数不同、或RNA提取效率的不同等造成的RNA量误差进行校正，达到在严格意义上对样品之间的mRNA表达量进行分析之目的。& & &&TaqMan探针法　　PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。以Taqman探针作为检测信号的荧光定量PCR方法称为探针法。& & &&相对定量 SYBR Green I 染料法&&绝对定量　　　　绝对定量首先必须构建与检测样品目的基因具有相同序列的标准品，本公司服务内容为采用TA克隆的方法构建标准品。使用已知浓度的标准品制作5个点以上的标准曲线后，可以使用标准曲线对未知浓度的检测样品进行绝对量 (起始拷贝数)分析。　　绝对定量SYBR Green I 染料法　　SYBR Green I 是一种与双链DNA小沟结合的荧光染料，SYBR Green I只与双链DNA结合才能发出荧光，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，荧光信号与双链DNA分子数成正比，随着扩增产物增加而增加，荧光信号的强度代表了反应体系中双链DNA分子的数量。以SYBR Green I作为检测信号的荧光定量PCR方法称为染料法。　　绝对定量TaqMan探针法　　PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’端－3’端外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。以Taqman探针作为检测信号的荧光定量PCR方法称为探针法。& & &miRNA荧光定量PCR& & 实时荧光定量PCR技术是在PCR反应体系中加入荧光试剂，利用荧光信号实时检测PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR能够专一、灵敏、快速、高重复性地精确定量起始模板浓度。但是就成熟的microRNA而言，由于其是由21-25个核苷酸组成的小RNA，长度太短，并不能通过传统的实时定量PCR进行检测,但是通过特殊设计的茎环结构的反转录引物，配合实时定量PCR引物及探针可以精确检测微量样品中microRNA表达水平，也可以用终点PCR法定性检测。&miRNA荧光定量PCR特点：&&&&&&&&&虽然 microRNA 实时定量PCR是一种最近才发展起来的检测技术，其技术细节还在不断完善中,但是microRNA 实时定量PCR检测系统，相对其它microRNA检测技术有以下优点：&&&&& 1.高特异性 , 可以只对成熟 microRNA 进行定量，有效区分成熟 microRNA 分子和前体分子&&&&&&&&&以及其它成熟microRNA 的同源分子；&&&&& 2.快速，简单，省时，整个操作只需两步，不到 3 个小时，即可获得高质量的数据；&&&&& 3.检测灵敏度高，样品消耗少，仅需 1-10ng 的总 RNA 或 50pg 左右的 microRNA ；&&&&& 4.超宽的线性范围，可跨越 7 个数量级；服务特点&&&&&&&&实惠、专业、高效&&&&&&& 最优惠的价格 — 环比业内，我们价格最优惠；&&&&&&& 最专业的技术 — 使用进口试剂盒和耗材，专业服务供应商；&&&&&&& 最高效的服务 — 实验进度实时反馈，来样即检测，合同期内提供检测结果。服务流程：&&&&&&& 1、根据客户的需要设计引物（每个基因至少设计3对）&&&&&&& 2、为客户抽提DNA、RNA，并对RNA进行逆转录&&&&&&& 3、实时荧光定量PCR对标本进行定量检测&&&&&&& 4、提供完整的实验结果报告(定量检测数据、溶解曲线、扩增曲线)&&&&&&& 5、返回实验样品（引物、RNA和cDNA）样品要求　　客户需提供组织、细胞、血液等样品材料，或纯化好的总RNA或总DNA，反转录好的cDNA样品，具体要求如下：&&&&&材料种类&& &样品要求起始量&&&保存及运输方式&&&&血液新鲜血液及抗凝剂处理的全血1ml加入Trizol-80℃贮存，干冰运输&&培养细胞离心收集的细胞1x107动物组织一般材料100mg-80℃或者液氮贮存，干冰运输植物一般材料100mgRNAOD260/OD280在1.9-2.1之间，完整性好&&&1ug-80℃贮存，干冰运输DNAOD260/OD280在1.7-1.9之间，完整性好&1ug-20℃贮存，冰袋运输cDNA内参基因检测成功&20ul结果报告：CT值CT值反应检测样本量大小参数。我们提供原始检测CT值，只以数值形式展现在报告上。不参与具体数据分析。扩增曲线扩增曲线反应QPCR各样本扩增情况。给客户提供相应样本的扩增曲线，主要是向客户提供扩增证据。溶解曲线溶解曲线反应的是QPCR结果中，PCR产物是否具有特异性。通过判定溶解曲线是否单一性，由此判定扩增结果的唯一性和判定CT值的准确性。相关数据统计相关数据统计，我们为客户提供相关柱形图、线形图等一些简单、直观、真实反应数据变化的相关图表。用直观的形式为客户反应数据变化情况。
北京博恒科创生物科技有限公司
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SYBR Green I
SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
SYBR Green I
具有 绿色激发波长
无须脱色或冲洗
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
SYBR Green I是高灵敏的DNA，适用于各种电泳分析，操作简单：无须脱色或冲洗。至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。SYBR Green I 与dsDNA 结合荧光信号会增强800-1000倍，用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。可适用于多种电泳分析。SYBR Green I 适合于多种方法：， ， ，和等。SYBR Green I 与双链DNA的亲和力非常高，因此可以用做电泳前染色，对中常用的酶（如：Taq 酶、、、T4等）没有抑制作用。另外，SYBR Green I 与EB相比，诱变能力大大降低。SYBR Green I 核酸凝胶染液(SYBR Green Nucleic Acid Gel Stains)是一种高敏感性的荧光染液，用于检测琼脂糖凝胶及 中的双链DNA和寡核苷酸。当染液与核酸结合后，SYBR Green I 核酸凝胶染液的荧光信号会明显增强，因此经SYBR GreenI 核酸凝胶染液染色的凝胶显示出非常好的性价比，没有背景荧光。为获得最佳的结果，凝胶最好在跑胶后再进行染色。SYBR GreenI 核酸凝胶染液用于低含量的PCR产物，凋亡研究及 异源双链分析中少量DNA的检测较为理想。可应用于：DNA和RNA的检测；SSCP及异源双链分析。
高灵敏：至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。信噪比高：样品荧光信号强，背景信号低。操作简单：无须脱色或冲洗。适用范围广：可适用于多种电泳分析。使用方便：不影响其它作用。经济：价格比银染便宜。
SYBR Green I预染方法
1. 该方法适用于 和PAGE2. 工作液的配制：用将10000×的SYBR GreenⅠ稀释100倍，即为SYBR GreenⅠ工作液。SYBR GreenⅠ工作液可以置2-8℃冷藏一个月以上。3. 制胶：按常规方法制胶，不含任何染料。4. 样品染色：向分析样品中加入SYBR GreenⅠ工作液和载样缓冲液，室温放置10分钟，使SYBR GreenⅠ与样品中DNA充分结合。SYBR GreenⅠ工作液加入量为总上样量的1/10。5. DNA Marker染色：将5μL DNA Marker和1μLSYBR GreenⅠ工作液混匀，室温放置5分钟，使SYBR GreenⅠ与DNA充分结合。6. 上样、电泳：按常规操作。7.检测：用ABLUe可见光仪器检测
SYBR Green I后染方法
1. 按照常规方法进行电泳。2. 用PH 7.0 - 8.5 的（如：TAE，TBE 或 TE），按照10000：1的比例稀释SYBR GreenⅠ浓缩液，混匀，制成染色溶液。3. 将染色溶液倒入合适的聚丙烯容器中，放入凝胶，用铝箔等盖住容器使染料避光。室温振荡染色10-30分钟，染色时间因凝胶浓度和厚度而定。直接在玻璃平皿上染色，将配好的工作溶液轻轻地倒在胶板上，让工作液均匀地覆盖整个胶板，并染色30分钟。玻璃平皿必须预先经过溶液处理（避免染料吸附在玻璃表面上）。4. 用ABLUe观测。蓝光可透过玻璃，观测聚丙烯酰胺凝胶时，可直接将托有凝胶的玻璃平皿放入ablue内观测。
1. 在&SYBR GreenⅠ预染色方法&中，电泳时间不要超过2小时，否则SYBR GreenⅠ会从DNA上分离出来，会产生弥散状条带。2. 在常规用酒精沉淀核酸的过程中，SYBR Green I 可以全部从双链核酸上去掉。3. 如果想对用 SYBR Green I 染过的胶进行 Southern blots，建议在预杂化和杂化溶液中加入 0.1%- 0.3% 的SDS。4. 在紫外照射透视下，与双链 DNA 接合的 SYBR Green I 呈现绿色荧光。如果胶中含有单链 DNA 则颜色为而不是绿色。5. SYBR Green对玻璃和非聚丙烯材料具有一定。建议在稀释、贮存、染色等使用过程中用聚丙烯类容器。
1实验方法囊腔组织经液氮速冻后，放入-70℃冰箱保存备用。Real-time PCR法检测EMMPRIN的mRNA含量。1.1组织总RNA提取：（1）从液氮中取出组织，用已处理过的剪刀剪取约100mg组织块，加入1ml Trizol试剂，转移至匀浆器中，将匀浆器置于冰水上充分研磨，转移研磨好的至无/无的1.5ml中，室温下静置5min。（2）加入0.2ml氯仿，颠倒混匀10次充分混匀，室温下静置2-5min，4℃状态下进行离心，离心速度为12000r/min，离心时间10min；（3）小心吸取上层水相溶液至另一无RNA酶/无DNA酶的1.5ml离心管中，小心吸取上层水相，勿碰及或吸走，否则要重新离心再吸取（可吸取约0.4-0.5 ml）。（4）加入等体积，颠倒混匀后室温下静止15min，4℃状态下进行离心，离心速度为12000r/min，离心时间15min。小心弃上清，沿管壁加入1ml 75%乙醇（配置,预冷），室温下静置1min，4℃状态下离心，速度7500r/min，离心时间5min；小心倒掉上清，再4℃状态下离心，速度3500r/min，时间离心1min；离心后用10μl枪头小心吸去残余液体，最后用30μlDEPC-H2O溶解RNA。（5）提取的总RNA经测定，提取物浓度OD 260/280比值在1.8-2.0之间。1.2反应：用上述细胞中提取的2μg总RNA在下述20μl反应体系中逆转录成cDNA,该反应体系组成如下：5×RT-Buffer 4μl, oligd(T) 2.5μmol/L, dNTPs 5/L, RNA酶抑制剂（RNAsin) 20U。首先70?C预变性5min，然后加入MMLV 200U， 再于42?C孵育1h，72?C加热10min灭活逆转录酶。1.3 Real-time PCR 反应：1.3.1 确认 根据相关信息，PCR产物进行分析并且对其纯化，假设纯化所得DNA浓度为a×10x，对其做10倍梯度稀释7次，稀释浓度依次为a×10x-1、a×10x-2、a×10x-3、a×10x-4、a×10x-5、a×10x-6、a×10x-7选择合适稀释品作为模板。1.3.2 取上述逆转录反应产物于20μl反应体系中进行PCR反应。PCR引物由合成。PrimerSequence (5′to 3′)Length（）GAPDH Forward primer5&-GTCGGTGTGAACGGATTT-3&276GAPDH Reverse primer5&-ACTCCACGACGTACTCAGC-3&EMMPRINForward primer5’- TGGCCTTCACGTTCCTGAGT -3’215EMMPRINReverse primer5’ - GTCATCTGCATCCACCGTGT-3’反应体系组成如下：10×Buffer（2μl）、dNTP 10 mmol /L(0.4μl)、 25mmol/L (1.6μl)、5U TaqDNA多聚酶(0.3μl)、模板2μl、上、下游特异引物各0.25μl、16.2μl。按下述热循环参数运行：GAPDH内参照基因；预变性：94×；变性：94×2s，退火56×15s，延伸72×15S（采光） 共30个循环。EMMPRIN基因；预变性：94×2min；变性：94×2s，退火58×15s，延伸72×12s （采光）共35个循环。以SLAN软件分析并计算EMMPRIN与GAPDH的。2 实验结果2.1内参照基因、目的基因琼脂糖凝胶电泳结果：随机选择3份标本PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在理论片段大小位置有单一条带且无杂带和引物。2.2 试剂扩增效率验证：经过对标准品定量，内参照基因GAPDH扩增检测Ct值与浓度对数值的为0.99996，目的基因EMMPRIN扩增检测Ct值与浓度对数值的相关系数为0.99969。内参照基因和目的基因皆有良好的扩增效率（相关系数&0.98）。可用ΔCt法行数据统计。
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SYBR Green I
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，
SYBR Green I
reen I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
SYBR Green I核酸染料(电泳用)
SYBR Green I是高灵敏的DNA荧光染料，适用于各种电泳分析，操作简单：无须脱色或冲洗。至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。SYBR Green I 与dsDNA 结合荧光信号会增强800-1000倍，用SYBR Green I染色的凝胶样品荧光信号强，背景信号低。可适用于多种电泳分析。
SYBR Green I 适合于多种凝胶电泳方法：琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶电泳，脉冲电场凝胶电泳，和毛细管电泳等。
SYBR Green I 与双链DNA的亲和力非常高，因此可以用做电泳前染色，对分子生物学中常用的酶（如：Taq 酶、逆转录酶、内切酶、T4连接酶等）没有抑制作用。另外，SYBR Green I 与EB相比，诱变能力大大降低。
SYBR Green I 核酸凝胶染液(SYBR Green Ndcleic Acid Gel Stains)是一种高敏感性的荧光染液，用于检测琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶中的双链DNA和寡核苷酸。当染液与核酸结合后，SYBR Green I 核酸凝胶染液的荧光信号会明显增强，因此经SYBR GreenI 核酸凝胶染液染色的凝胶显示出非常好的性价比，没有背景荧光。为获得最佳的结果，凝胶最好在跑胶后再进行染色。SYBR GreenI 核酸凝胶染液用于低含量的PCR产物，凋亡研究及异源双链分析中少量DNA的检测较为理想。可应用于：DNA和RNA的检测；SSCP及异源双链分析。
SYBR Green I 核酸染料特点
高灵敏：至少可检出20pg DNA，高于EB染色法25-100倍。
信噪比高：样品荧光信号强，背景信号低。
操作简单：无须脱色或冲洗。
适用范围广：可适用于多种电泳分析。
使用方便：不影响其它修饰酶作用。
经济：价格比银染便宜。
电泳用SYBR Green I 使用方法
SYBR Green I预染方法
1. 该方法适用于琼脂糖凝胶电泳和PAGE凝胶电泳
2. 工作液的配制：用电泳缓冲液将10000×的SYBR GreenⅠ稀释100倍，即为SYBR GreenⅠ工作液。SYBR GreenⅠ工作液可以置2-8℃冷藏一个月以上。
3. 制胶：按常规方法制胶，不含任何染料。
4. 样品染色：向分析样品中加入SYBR GreenⅠ工作液和载样缓冲液，室温放置10分钟，使SYBR GreenⅠ与样品中DNA充分结合。SYBR GreenⅠ工作液加入量为总上样量的1/10。
5. DNA Marker染色：将5μL DNA Marker和1μLSYBR GreenⅠ工作液混匀，室温放置5分钟，使SYBR GreenⅠ与DNA充分结合。
6. 上样、电泳：按常规操作。
SYBR Green I后染方法
1. 按照常规方法进行电泳。
2. 用PH 7.0 - 8.5 的缓冲液（如：TAE，TBE 或 TE），按照10000：1的比例稀释SYBR GreenⅠ浓缩液，混匀，制成染色溶液。
3. 将染色溶液倒入合适的聚丙烯容器中，放入凝胶，用铝箔等盖住容器使染料避光。室温振荡染色10-30分钟，染色时间因凝胶浓度和厚度而定。聚丙烯酰胺凝胶直接在玻璃平皿上染色，将配好的工作溶液轻轻地倒在胶板上，让工作液均
匀地覆盖整个胶板，并染色30分钟。玻璃平皿必须预先经过硅烷化溶液处理（避免染料吸附在玻璃表面上）。
4. 用蓝盾TM观测。蓝光可透过玻璃，观测聚丙烯酰胺凝胶时，可直接将托有凝胶的玻璃平皿放入蓝盾TM内观测。
SYBR Green I使用注意事项
1. 在&SYBR GreenⅠ预染色方法&中，电泳时间不要超过2小时，否则SYBR GreenⅠ会从DNA上分离出来，会产生弥散状条带。
2. 在常规用酒精沉淀核酸的过程中，SYBR Green I 可以全部从双链核酸上去掉。
3. 如果想对用 SYBR Green I 染过的胶进行 Southern blots，建议在预杂化和杂化溶液中加入 0.1%- 0.3% 的SDS。
4. 在紫外照射透视下，与双链 DNA 接合的 SYBR Green I 呈现绿色荧光。如果胶中含有单链 DNA 则颜色为橘黄而不是绿色。
5. SYBR Green对玻璃和非聚丙烯材料具有一定亲合力。建议在稀释、贮存、染色等使用过程中用聚丙烯类容器。
Sybr Green I染料法操作过程
囊腔组织经液氮速冻后，放入-70℃冰箱保存备用。Real-time PCR法检测EMMPRIN的mRNA含量。
1.1组织总RNA提取：
（1）从液氮中取出组织，用已处理过的剪刀剪取约100mg组织块，加入1ml Trizol试剂，转移至匀浆器中，将匀浆器置于冰水上充分研磨，转移研磨好的匀浆液至无RNA酶/无DNA酶的1.5ml离心管中，室温下静置5min。
（2）加入0.2ml氯仿，颠倒混匀10次充分混匀，室温下静置2-5min，4℃状态下进行离心，离心速度为12000r/min，离心时间10min；
（3）小心吸取上层水相溶液至另一无RNA酶/无DNA酶的1.5ml离心管中，小心吸取上层水相，勿碰及或吸走中间层，否则要重新离心再吸取（可吸取约0.4-0.5 ml）。
（4）加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温下静止15min，4℃状态下进行离心，离心速度为12000r/min，离心时间15min。小心弃上清，沿管壁加入1ml 75%乙醇
（DEPC水配置,预冷），室温下静置1min，4℃状态下离心，速度7500r/min，离心时间5min；小心倒掉上清，再4℃状态下离心，速度3500r/min，时间离心1min；离心后用10μl枪头小心吸去残余液体，最后用30μlDEPC-H2O溶解RNA。
（5）提取的总RNA经紫外分光光度计测定，提取物浓度OD 260/280比值在
1.8-2.0之间。
1.2逆转录反应：
用上述细胞中提取的2μg总RNA在下述20μl反应体系中逆转录成cDNA,该反应体系组成如下：5×RT-Buffer 4μl, oligd(T) 2.5μmol/L, dNTPs 5mmol/L, RNA酶抑制剂（RNAsin) 20U。首先70?C预变性5min，然后加入逆转录酶MMLV 200U， 再于42?C孵育1h，72?C加热10min灭活逆转录酶。
1.3 Real-time PCR 反应：
1.3.1 方法学确认 根据引物相关信息PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并且对其纯化，假设纯化所得DNA浓度为a×10x，对其做10倍梯度稀释7次，稀释浓度依次为a×10x-1、a×10x-2、a×10x-3、a×10x-4、a×10x-5、a×10x-6、a×10x-7选择合适稀释品作为标准品模板。
1.3.2 取上述逆转录反应产物于20μl反应体系中进行PCR反应。PCR引物由上海之江生物科技有限公司合成。
PrimerSequence (5′to 3′)Length（bp）
GAPDH Forward primer5'-GTCGGTGTGAACGGATTT-3'276
GAPDH Reverse primer5'-ACTCCACGACGTACTCAGC-3'
EMMPRINForward primer5’- TGGCCTTCACGTTCCTGAGT -3’215
EMMPRINReverse primer5’ - GTCATCTGCATCCACCGTGT-3’
反应体系组成如下：10×Buffer（2μl）、dNTP 10 mmol /L(0.4μl)、MgCl2 25mmol/L (1.6μl)、5U TaqDNA多聚酶(0.3μl)、模板2μl、上、下游特异引物各0.25μl、去离子水16.2μl。
按下述热循环参数运行：GAPDH内参照基因；预变性：94×2min；变性：94×2s，退火56×15s，延伸72×15S（采光） 共30个循环。EMMPRIN基因；预变性：94×2min；变性：94×2s，退火58×15s，延伸72×12s （采光）共35个循环。以SLAN软件分析并计算目的基因EMMPRIN与GAPDH的Ct值。
2 实验结果
2.1内参照基因、目的基因琼脂糖凝胶电泳结果：随机选择3份标本PCR扩增产物就爱阅读网友整理上传,为您提供最全的知识大全,期待您的分享，转载请注明出处。
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