中国美容医学2012年3月第21卷第3期ChineseJournalofAestheticMedicine.Mar.2012.Vol.21.No.3407
EGFP病毒提取液（本实验室王黔老师提供）；CM-Dil1.4rrEGFP和CM-Dil标记BMSCs
（MolecularrProbes，美国）；碱性磷酸酶染色试剂盒（南京建1.4.1rrEGFP标记BMSCs：成骨诱导后的BMSCs传至P2代，成，南京），Ⅱ型胶原、GFP免疫组织化学一抗和二抗（中杉金达到80%r细胞融合后去除原成骨诱导培养基，加入无胎牛血桥，北京）；多聚甲醛、戊二醛（益利精细化学品，北京）；清的DMEMr5rml，然后在其中加入制备好的病毒液600μl，Quantar200r环境扫描电子显微镜（FEI，捷克）；倒置相差显并加入Lipofectaminer2000以增强感染效率。24h后，弃掉微镜（Olympus，日本）。含病毒的培养基，改用成骨诱导培养基继续培养，荧光显微
1.3rBMSCs的分离培养及鉴定镜下观察转染效率，MTT法检测细胞的增增殖能力。
1.3.1rrBMSCs的分离培养：比格犬以0.12ml/kg的剂量肌注1.4.2rrCM-Dil标记BMSCs：收集P2代BMSCs制成密度为氯胺酮/速眠新（两者2:1混合）麻醉，常规备皮、消毒、铺1.0×107/rml细胞悬液（PBS悬浮），每1ml细胞悬液中加入巾，用骨穿针于髂后上嵴穿入骨髓腔，然后用含有1ml肝素40μlrCM-Dil（1g/L），此时CM-Dil的终浓度为40μM。细胞（50U/ml）的20ml的注射器负压抽取骨髓液4ml，加入4mlr悬液置于37℃，3min，然后冰浴15min，洗涤后按5.0×Hanks液混匀，小心加入含有4mlrFicoll淋巴细胞分离液104/ml的密度接种到培养皿中。24h后，荧光显微镜下观察标的15ml离心管中，2r000r/min离心20min，吸取中间白色云记后的细胞，MTT法检测细胞的增殖能力。
雾状的有核细胞层，DMEM洗涤2次，离心后细胞计数，将细胞1.5rBMSCs接种珊瑚支架植入裸鼠体内及检测
悬液按1.0×106/ml的密度接种直径为10cm的培养皿，置于1.5.1r珊瑚支架制备：选取西沙群岛产致密橙黄滨珊瑚，加37℃、体积分数为5%的CO2培养箱内培养，48h后换液，清除工成体积为5mm×5mm×1mm大小。用5%次氯酸钠溶液浸泡2未贴壁的细胞，7天后细胞克隆达80%融合，胰酶消化，按周，3天换液一次，然后用三蒸水冲洗，煮沸10min×3次，超5.0×104/ml的密度传代。选取第二代细胞备用。声清洗（5次，每次10min）后80℃烘干24h，高温高压灭菌后
1.3.2r三系诱导分化及鉴定：①成骨诱导：成骨诱导培养基备用。
（10-8rM地塞米松、0.01rMrβ-磷酸甘油钠、0.05g/L维生素1.5.2r接种细胞：分别收集EGFP和CM-Dil标记后的BMSCs，
C、10%胎牛血清、1r双抗）培养BMSCsr21天，4%多聚甲醛固以2.0×107/ml的密度接种珊瑚支架，成骨诱导培养基体外定，碱性磷酸酶染色试剂盒染色；体积分数为95%的乙醇固定培养3h、3天、7天，2.5%r戊二醛固定，酒精脱水干燥，扫描电1h，2%茜素红染色；4%r多聚甲醛固定，加入抗骨桥蛋白一抗镜观察材料的孔隙率和接种后细胞-材料的粘附情况。和二抗，免疫荧光检测；②成软骨诱导：成软骨诱导培养基1.5.3r细胞-支架复合物植入裸鼠背部皮下：裸鼠12只，分（10ng/mlrTGF-β1、40ng/r地塞米松、50ng/ml维生素C、10%3组。各组裸鼠右侧背部皮下均植入空白珊瑚支架（每只3胎牛血清、1%r双抗）诱导培养14天，4%r多聚甲醛固定，甲苯块），左侧分别植入体外成骨诱导培养7天的未标记、EGFP标胺蓝、番红O染色；4%多聚甲醛固定，加入抗Ⅱ型胶原一抗和记、CM-Dil标记的细胞-支架复合物。
二抗，免疫细胞化学检测；③成脂诱导：成脂诱导培养基1.5.4r取材：三组分别于术后4周、8周、12周取材，30%r甲（0.5mM③IBMX、10-5rM胰岛素、0.2mM吲哚美辛、10-6rM地塞米酸脱钙，石蜡包埋切片，HE染色，观察其成骨情况；EGFP标记松、10%胎牛血清、1%双抗）诱导培养14天，4%多聚甲醛固定，组通过GFP免疫组织化学示踪植入BMSCs；CM-Dil标记组冰60%异丙醇处理，油红O染色。冻切片DAPI染核，荧光显微镜下观察植入BMSCs的变化。
图111BMSCs三系诱导后鉴定（A、碱性磷酸酶染色；B、茜素红染色；C、番红O染色；D、Ⅱ型胶原免疫组化；E、光镜下观察；F、油红染色。bar1scales=100μm）
万方数据基础研究
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2.1.16分化鉴定：BMSCs原代培养7天，贴壁细胞形态呈长梭形，增殖迅速并生成大量克隆。成骨诱导21天后，碱性磷酸酶染色阳性（图1A），茜素红染色可见成骨分化后钙质沉积（图1C），Ⅱ（图1B）；成软骨诱导14天后，番红O染色阳性
图244细胞标记及增值检测（A、EGFP标记后发出绿色荧光及生长曲
线；B、CM-Dil标记后发出红色荧光及生长曲线。bar4scales=100μm）
图344体外细胞-支架复合物观察
（A、珊瑚支架大体观；B、珊瑚支架电镜扫描；C、细胞-支架复合物培养3天后电镜扫描；D细胞-支架复合物培养7天后电镜扫描；E、EGFP标记细胞-支架复合物培养7天后荧光显微镜下观察；F、CM-Dil标记细胞-支架复合物培养7天后荧光显微镜下观察.4bar4scales4=4100μm）
图444体内复合物取材后组织学观察（HE染色.4bar4scales=100μm）
1.666统计学分析：采用SPSS16.0统计软件包进行分析。MTT法各检测时间点每组读取4孔OD值，数据以±s表示，组间比较采用配对t检验，P&0.05认为有统计学差异。244结果
2.166BMSCs多向分化鉴定及EGFP、CM-Dil标记
型胶原免疫细胞化学可见细胞分泌??型胶原（图1D）；成脂诱导14天后，镜下可见细胞质中大量脂滴出现（图1E），油红O染色阳性（图1F）。
2.1.26标记：EGFP、CM-Dil标记BMSCs624h后，荧光显微镜下计数发现80%6以上的细胞激发出绿色荧光、红色荧光（图2）。MTT法检测结果显示7天细胞增殖进入平台期，EGFP组、CM-Dil组与未标记组的生长曲线基本一致，各个时间点比较无统计学差异（P&0.05），表明标记对细胞增殖活性无明显影响。
2.26体外培养BMSCs-支架复合物：电镜扫描细胞-支架复合物发现，接种3天后细胞已分泌大量基质，逐渐充满整个孔隙。复合物体外培养7天置于荧光倒置显微镜下直接观察，也看到激发出荧光的细胞在支架上黏附生长（图3）。2.36体内植入复合物的组织学观察：各组复合物植入体内4周，材料边缘（珊瑚支架脱钙处理）均出现少量新生骨基质（红染区域），骨基质包围大量新生的类骨质，形态似纤维组织，而空白材料植入后发现纤维组织长入，无骨基质形成；植入8周，随着类骨质的成熟，骨基质的范围逐渐扩大；植入12周，大部分区域成熟骨质已经形成，骨陷窝及其中的骨细胞清晰可见（图4），而空白材料珊瑚支架在体内逐渐降解，被大量纤维组织替代。2.466EGFP、CM-Dil标记BMSCs体内示踪观察：EGFP免疫组织化学发现，4周大量表达GFP的细胞存在于植入的细胞-
支架复合物中，8周逐渐减少，到12周仅能在组织边缘看到少量GFP阳性细胞（图5A）。CM-Dil标记组冰冻切片在荧光显微镜下观察显示植入4周，标记后的BMSCs发出红色荧光，荧光出现在材料边缘区域，植入8周，红色荧光仍然存在，荧光范围比4周明显减少，植入12周，红色荧光进一步减少，只存在于少量细胞集落的边缘区域（图5B）。344讨论
BMSCs来源广泛，取材方便，具有向成骨细胞、软骨细胞、肌腱、韧带、神经细胞、脂肪细胞及骨髓基质等组织细胞分化的潜能，已被广泛应用于细胞和组织工程、干细胞治疗等领域[6-7]。对细胞进行标记示踪是相关研究中必不可少的环节，
图544EGFP免疫组化和CM-Dil荧光显微镜观察（A、B、C：EGFP组；D、E、F：CM-Dil组.4bar4scales4=4100μm）
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&&&&&&& （广西医科大学第一附属医院& 老年内分泌科& 广西南宁& 530021）
&&&&&&& 【摘要】目的& 探讨绿色荧光蛋白作为标记蛋白其荧光强度与胰岛素表达量的相关性。方法& 构建重组质粒prIns1EGFP，转染HIT-T15仓鼠胰岛瘤细胞，随机分为3组，低糖组（LG）、中糖组（MG），高糖组（HG）, 检测基线0小时及葡萄糖刺激后4小时内胰岛素分泌量及单个胰岛&细胞荧光强度。结果& HG组单个胰岛&细胞荧光强度，胰岛素分泌量较LG组明显增强（P＜0.05），在一定葡萄糖浓度范围内，绿色荧光蛋白其荧光强度随着葡萄糖浓度的升高而升高，并与细胞胰岛素分泌量呈明显的正相关，相关系数R为0.896。（P＜0.05）结论&& 绿色荧光蛋白作为分子标记物其荧光强度与胰岛素分泌量有正相关性。
&&&&&&& 【关键词】绿色荧光蛋白& 细胞转染& 相关性& 胰岛素
&&&&&&& 【中图分类号】R39&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 【文献标识码】A&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 【文章编号】（7-02
&&&&&&& 细胞作为生命体结构基本单元，要了解一些生命活动规律，就须以细胞为研究基础，要对单细胞进行分析，可引入荧光标记蛋白。绿色荧光蛋白（GFP）是近年来在生物化学和细胞生物学中应用最广泛的标记蛋白之一[1]，常被用于研究单个细胞的蛋白表达或者转染后基因的表达、调控、细胞分化及蛋白质在生物体内定位和转运等[2]，免疫分析、核酸碱基探针分析，以及分子间第二信使钙离子和cAMP水平的指示,荧光关联谱学、细胞分类选择和细胞系分析，细胞间隙pH变化的检测[3] ，用于研究转染后基因的表达，可通过荧光显微镜观察或流式细胞仪定量检测，可对细胞内绿色荧光蛋白表达水平进行半定量的检测[4]，该方法简单有效。但应用中仍有问题亟待解决，荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难，目前通过检测绿色荧光蛋白的荧光强度来定量检测转染后单个细胞内蛋白质的量仍无明确报道。为进一步探讨绿色荧光蛋白作为标记蛋白其荧光强度与胰岛素表达量的相关性，本实验用重组质粒prIns1EGFP转染HIT-T15细胞后，在荧光显微镜下连续4小时实时监测单个胰岛细胞的荧光强度情况。
材料与方法
&&&&&&& 一、实验材料
&&&&&&& HIT-T15仓鼠胰岛瘤细胞（美国ATCC细胞库），Lipofeltamine 2000 （inventrogen），重组质粒prIns1EGFP，免疫组化试剂盒，1640培养基、胎牛血清（GIBCO公司）；荧光显微镜（Olmpus），恒温灌流系统，二氧化碳恒温细胞培养箱（HERAUESEK Type）；孔板。
&&&&&&& 二、实验方法
&&&&&&& 2.1 瞬时转染& 以细胞密度为1&106/mL种于24孔板内。加入含10%胎牛血清、1mmol/l的L-谷氨酰胺的1640培养基，恒温培养箱中培养24h。转染前2h把孔板中的培养基换成无血清无双抗的基础培养基，将重组质粒prIns1EGFP 2uL和 LipofectaminTM 2000 2 &L分别溶解在 48uL培养基中制成转染液，室温孵育5分钟后混匀，再孵育20min，转染24孔板，6h后换普通培养基，20h可观察荧光。
&&&&&&& 2.2 实验分组：分为三组：低糖组（LG）含糖2.8mmol/L，中糖组（MG）含糖5.6mmol/L，高糖组（HG）含糖16.7mmol/L。
&&&&&&& 2.3 本实验为保证细胞活性，引用恒温灌流系统（Live Cell Microscopy Environmental Control Systems），该设备包含二氧化碳泵，恒温加热皿，加热探头及微量灌流泵等，可保证细胞在37℃, 5％CO2及持续微量的培养基灌流的环境下生存。
&&&&&&& 2.4 荧光强度的测定
&&&&&&& 葡萄糖刺激后，固定视野，用荧光显微镜连续4小时（间隔0.5h拍1张）拍照，用NIS-ELEMENTS Viewer软件分析荧光强度。
&&&&&&& 2.5 胰岛素释放量的测定
&&&&&&& 各组细胞予葡萄糖刺激后间隔1h收集细胞孵育液，-20℃保存。用化学发光试剂盒测定培养液中胰岛素浓度。
&&&&&&& 三、统计学分析
&&&&&&& 用SPSS 16.0软件分析。数据以均数&标准差(x-&s)表示。多组间比较应用多因素方差分析。荧光强度与胰岛素分泌量的相关性分析，两组间均数比较采用SNK，P&0.05为差异有统计学意义。
&&&&&&& 四、结果
&&&&&&& 1、糖刺激后荧光强度测定
&&&&&&& 糖刺激后，低糖组随刺激时间延长，荧光强度无明显改变（P＞0.05）。高糖组较低糖组荧光强度明显增高，差异有统计学意义（P&0.05），高糖组荧光强度随时间延长而逐渐变亮，约在糖刺激后2.5h左右达峰值。
&&&&&&& 2、糖刺激后胰岛素分泌量测定
&&&&&&& 糖刺激后HG组较LG组MG组胰岛素分泌量明显升高，差异有统计学意义（P&0.05）。LG组胰岛素分泌量随时间延长无明显改变（P＞0.05）。
&&&&&&& 3、荧光强度与胰岛素分泌量相关性分析
&&&&&&& 线性相关分析的数据显示，不同浓度的葡萄糖刺激单个胰岛细胞的荧光强度与胰岛素分泌量具有相关性，其相关系数r为0.896，P＜0.05。
&&&&&&& 在体外转染实验中，人们需要了解细胞内蛋白质的表达水平，传统的检测蛋白质的方法操作麻烦，以往对细胞群体研究葡萄糖刺激胰岛素分泌情况，会掩盖了单细胞间的差异不能很好的从单细胞水平来反应蛋白质水平，单细胞分析的引入对与疾病的早期预防和诊断有重要的意义，在临床，细胞生物学及神经生物学等多个领域都有重要意义。本实验构建了重组质粒并转染细胞后, 在恒温灌流系统下，通过EGFP长时间对单个胰岛细胞进行实时观察。
&&&&&&& 本实验目的是测定细胞的荧光强度来反应细胞内胰岛素的表达水平，该方法不依赖大型仪器，能在短时间内大致的反应出胰岛素的分泌量。结果显示，样品的荧光强度与胰岛素浓度有很好的线性关系，说明可以用荧光强度来衡量胰岛素的表达水平，既往对转染后基因表达的研究，可通过荧光显微镜观察或流式细胞仪对细胞内绿色荧光蛋白表达水平进行半定量的检测，但是由于EGFP的荧光强度会受到外界多方面因素的影响，本实验优化了各种可能影响荧光强度的因素。
&&&&&&& Brundstedt等发现高浓度葡萄糖刺激HIT-T15细胞2h后会导致胰岛素mRNA水平明显增加，胰岛素原的合成率将升高10左右。
&&&&&&& Barbara等通过应用胰岛素启动子驱使的绿色荧光蛋白表达质粒进行短期葡萄糖刺激诱导胰岛细胞胰岛素基因转录的研究，发现高糖刺激后胰岛素mRNA水平能在1至2小时升高2到5倍，荧光强度增强2倍左右，本研究表明，重组质粒在胰岛素基因的生物合成研究中意义重大，通过转染技术将其导入胰岛&细胞后，能实现对葡萄糖诱导的胰岛素基因转录的实时监测，即检测荧光蛋白的表达可以间接反映胰岛素的生物合成情况，但因GFP的荧光信号强度为非线性性质，使得定量非常困难，通过荧光强度准确的定量出胰岛素表达量还有待研究。
&&&&&&& 参考文献
&&&&&&& [1] Chalfie M, Kain S. Green fluorescent protein: properties, applications and protocols. New York: Wiley Liss, 1998; 83.
&&&&&&& [2] Heim R, Cubitt AB, Tsien RY. Improved green fluorescence. Nature, 3.
&&&&&&& [3] Herman P S, Helmi R M S, Cristina P B, et al. Use of GFP to study factors involved in the lotus japonicus symbiosis[J]. Current Plant Science and Biotechnology in Agriculture, 9-222.
&&&&&&& [4] Tombolini R.,Unge A.,et al.Flow cytometric and microscope analysis of GFP-tagged Pseudomonas fluorescens bacteria[J].FEMS Mycrobiol.Ecol.,-28.
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浅论一种人硫氧还蛋白基因修饰肝细胞的制备
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　　2 结 果　　2.1 克隆基因的序列　　克隆上的hTrx开放阅读框cDNA基因序列为315 bp(含起始子ATG、不含终止子TAA)，推导氨基酸数104个(不含起始子ATG编码的Met)。另外可见BglⅡ、BamHⅠ识别位点及对框碱基TT。与已知序列比对2个碱基发生改变：第117位C→G、第221位C→T，这可能由于模板来源不同所致，其它碱基完全一致。推导的氨基酸序列，第39位Asn→Lys，第74位Thr→Met，存在活性位点保守序列―Trp―Cys32―Gly―Pro―Cys35―Lys―，以及其外侧3个半胱氨酸Cys残基Cys62，Cys69和Cys73。　　2.2 pLEGFP/hTrx的筛选　　重组质粒经BamHⅠ单酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳见7 172 bp处有一光亮带;BglⅡ、BamHⅠ双酶切后在323 bp、6 849 bp 处各有一光亮带，与理论值完全一致，确定为pLEGFP/hTrx重组载体质粒(图1)。　　2.3 重组逆转录病毒滴度　　本实验最高病毒滴度为2.80 × 106感染数/mL，选择该组进行扩增生产重组逆转录病毒，进行后续实验。　　2.4 重组逆转录病毒感染细胞后hTrx表达和活性　　重组病毒组、空质粒病毒组及无病毒组之间酶反应活性的比较见表1，可见在各个反应剂量重组病毒组酶反应速度均远高于空质粒病毒组和无病毒组 (P = 0.02)，显示有较高的酶反应活性，并有一定的剂量依赖性。该结果与标准品组实验结果相似。提示本实验制备的重组病毒感染真核细胞后，细胞可分泌融合表达的hTrx并具有硫氧还蛋白生物学活性。　　2.5 hTrx基因修饰大鼠肝细胞的制备和活性　　实验制备的hTrx基因修饰大鼠肝细胞有EGFP绿色荧光蛋白表达。免疫组化SABC法检测可见细胞浆内出现棕黄色颗粒的阳性染色，表明hTrx基因修饰大鼠肝细胞可分泌表达白蛋白，细胞功能正常(图2)。　　2.6 hTrx基因修饰大鼠肝细胞抗氧化应激能力　　hTrx作为一种抗氧化剂，具有较强的抗氧化应激能力。打击实验中，MTT比色法检测在12 h和24 h时，hTrx基因修饰组与空病毒组、正常肝细胞组D(650 nm)值比较有统计学意义(P = 0.02)，48 h时差异有明显统计学差异(P = 0.003)，而后两组在任何时间段差异均无统计学意义(P = 0.31，表1)。显示出hTrx基因修饰大鼠肝细胞具有较强的抗氧化应激能力，并可有效增殖，表明hTrx具有明确的肝细胞保护作用。各组生长曲线之间的比较见图3。　　3 讨 论　　肝细胞移植技术已具有较为完备的实验及理论基础，可以治疗多种肝相关疾病，但尚有许多问题有待进一步解决，包括增殖、免疫、养营等。成熟肝细胞为终末分化细胞，分裂增殖能力较差，也不能冷冻保存，移植后增殖缓慢及增殖能力受限。由于移植肝细胞数量的限制以及很难得到满意的增殖，肝功能支持的时间及受损肝实质的替代的程度不甚理想，有研究显示其替代作用一般不超过受体肝脏功能的1%，提高移植肝细胞的增殖指数、防止过多凋亡及氧化应激成为需要重点解决的关键问题之一。促进干细胞向成熟肝细胞定向转化的研究尚需完善，对成熟肝细胞的改造仍有现实的意义。　　hTrx在细胞生存和生长中具有极重要的作用，它的生物学功能包括促进细胞DNA和蛋白质合成、生长因子样作用、抗氧化作用、转录因子调节以及凋亡抑制作用等。我们前期制备出具有生物学活性的rhTrx对原代培养肝细胞的生存生长也显示出具有促进作用。外源性hTrx在体内实验中局部应用较难进入细胞内部，很快代谢使其作用不够持久。本实验将目的基因导入离体肝细胞，从而达到在体内长期表达的目的。　　目前已有多个实验对肝细胞进行体外基因修饰，主要在于增强移植肝细胞的增殖与功能，降低移植后的排斥反应和逆转肝纤维化等。在提高增殖方面，有研究将外源性基因片段整合入肝细胞DNA中，成为所谓“永生化细胞”，并能够加以人为控制[7-8];敲除与抑制细胞增殖密切相关基因的小鼠肝细胞，移植后细胞增殖数量明显增加;将血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)、Bcl-2、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor， HGF) 等基因导入供体肝细胞后移植，肝细胞的存活和再生增加，抗凋亡能力明显增强[10-13]。本实验制备出hTrx基因修饰肝细胞表现出较强的抗氧化应激能力，可缓解细胞损伤并可有效增殖，也进一步表明hTrx具有明确的肝细胞保护和促进增值作用。这种hTrx基因修饰肝细胞可在肝细胞移植和生物人工肝细胞保存方面发挥重要作用。【参考文献】& 　Kondo N， Nakamura H， Masutani H， et al. Redox regulation of human thioredoxin network[J]. Antioxid Redox Signal， 2006， 8(9-10)： .　　Powis G， Montfort WR. Properties and biological activities of thioredoxins [J]. Annu Rev Biophys Biomol Struct， 2001， 30(8)： 421-455.　　李华，汪根树，陈规划，等. 重组人硫氧还蛋白对原代培养肝细胞的影响 [J]. 中华普通外科杂志，2005， 20(12)：803-806.　　Weber A， Groyer-Picard MT， Franco D. Hepatocyte transplantation in animal models[J]. Liver Transpl， 2009， 15(1)： 7-14.　　Kakinuma S， Nakauchi H， Watanabe M. Hepatic stem/progenitor cells and stem-cell transplantation for the treatment of liver disease [J]. Gastroenterol， 2009， 44(3)： 167-172.　　Tao L， Gao E， Hu A， et al. Thioredoxin reduces post-ischemic myocardial apoptosis by reducing oxidative/nitrative stress [J]. Br J Pharmacol， 2006， 149(3)： 311-318.　　Tsuruga Y， Kiyono T， Matsushita M， et al. Establishment of immortalized human hepatocytes by introduction of HPV16 E6/E7 and hTERT as cell sources for liver cell-based therapy[J]. Cell Transplant， 2008， 17(9)： .　　Totsugawa T， Yong C， Rivas-Carrillo JD， et al. Survival of liver failure pigs by transplantation of reversibly immortalized human hepatocytes with Tamoxifen-mediated self-recombination[J]. Hepatology， 2007， 47(1)： 74-82.　　Seppen J， Filali EE， Elferink RO. Small animal models of hepatocyte transplantation [J]. Methods Mol Biol， 2009， 481(8)： 75-82.　　Kosone T， Takagi H， Horiguchi N， et al. Transforming growth factor-alpha accelerates hepatocyte repopulation after hepatocyte transplantation[J]. Gastroenterol Hepatol， 2008， 23(2)： 260-266.　　Wang X， Mani P， Sarkar DP， et al. Ex vivo gene transfer into hepatocytes [J]. Methods Mol Biol， 2009， 481(9)： 117-140.　　Song E， Chen J， Antus B， et al. Adenovirus-mediated Bcl-2 gene transfer inhibits apoptosis and promotes survival of allogeneic transplanted hepatocytes [J].Surgery， 2001， 130(3)： 502-511.&&&2&&&
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