微量液体稀释法 试验步骤 1. 采用96孔U型板每排1～10孔依次加入不同浓度待测药物工作液100 μl ，第1孔为最高浓度第10孔为最低浓度。 2. 在1～10孔加入100μl菌工作液第11孔中加入100 μl无菌不含药物的培养基和100 μl菌工作液，作为生长对照；12孔仅加入无菌不含药物培养基作阴性对照 3. 培养板置于35℃孵育。根霉在培养21～26小时后镰刀菌、曲霉和孢子丝菌在46~50小时，波氏假阿什利菌70～74小时后读取结果 微量液体稀释法 结果判读 结果判读以生长对照孔作为标准，将生长情況进行评分 0：完全透明清澈或无生长； 1：少量生长，大致相当于生长对照孔的25％ 2：生长明显减少相当于生长对照孔50％ 3：生长轻度减少，相当于生长对照孔75％ 4：无明显生长抑制与生长对照一致 微量液体稀释法 结果判读 1. 两性霉素B 终点易判断，以评分为0的最低浓度为MIC 2. 氟胞嘧啶和唑类药物 以评分为2的最低浓度作为MIC 3. 伊曲康唑及其他三唑类 一般终点容易判断以评分为0的最低浓度作为MIC。如出现终点判断困难提示該菌在临床中可能耐药。 微量液体稀释法 结果判定：目前MIC与菌株耐药情况的关系尚不清楚 1. 两性霉素B：多数条件致病丝状菌的MIC值为0.5~2.0μg/mL。但某些菌株如土曲霉、局限枝顶孢霉、尖端赛多孢子菌和多育赛多孢子菌等MIC可达2.0~16 μg/mL 临床治疗提示，曲霉MIC≥2.0 μg/mL时可导致两性霉素B治疗失败。 2. 氟胞嘧啶：除少数曲霉属和暗色孢科以外多数丝状真菌不敏感，MIC>64 μg/mL 微量液体稀释法 结果判定 3. 氟康唑：除少数双相真菌和皮肤癣菌外，多数丝状真菌不敏感MIC>64μg/mL。 4. 酮康唑：丝状真菌MIC波动于0.0313~16 μg/mL 但目前尚缺乏MIC值与疗效关系的资料 5. 伊曲康唑和新三唑类：初步的资料显示当MIC>8 μg/mL時，提示临床该菌对伊曲康唑耐药新三唑类药物尚缺乏MIC值与临床疗效间关系的资料。 试管液体稀释法 操作与微量液体稀释法相似将培養体系置于试管中，接种菌量约为0.4×104～5×104cfu/mL35℃培养后观察生长情况。结果判读和判定同微量液体稀释法 液基稀释法 优点：敏感，操作简便 缺点：适用范围有限，仅适用于产孢丰富的丝状真菌 而对产孢较少的真菌则较难进行。 丝状真菌的其他药物敏感试验方法还包括琼脂扩散法、E试验法等其操作步骤均可参照酵母样菌方法进行。目前丝状真菌的药物敏感试验仍没有一个广被接受的标准方法对各种方法得到的MIC值尚没有充分的临床疗效资料与之对应；同时，丝状真菌药物敏感试验中接种菌量确定仍是目前存在的主要问题尚需进行进一步的试验对各种方法进行再评价。 小 结 抗真菌药物敏感试验方法很多NCCLS采用的液体稀释法，尤其微量液体稀释法简便易行，结果敏感洏受到大多数专业工作者的欢迎。 微量液体稀释法有其局限性细菌药物敏感试验显示，液体稀释法相对于传统的琼脂稀释法重复性差哃时，由于缺乏临床疗效和药敏结果间的关系资料对各种药敏试验方法仍无法作出客观评价。 对于丝状真菌来说目前尚无一种广被接受的药敏试验方法，如菌量确定的方法等 琼脂，溶于1000mL蒸馏水中高压灭菌15min，备用 琼脂稀释法 菌液的制备 受试菌在SDA中35℃ 培养24小时（念珠菌属）或48小时（新生隐球菌） 取直径约5mm菌落，混悬于5mL灭菌的生理盐水中涡旋混匀15秒，采用分光光度计在530nm处调整菌悬液至0.5个麦氏单位浊喥，相当于1×

抗菌药物对预防或治疗动物疾病發挥了巨大的作用但随着抗菌药物在兽医临床的广泛使用，尤其为了防治疾病常常以亚剂量水平的药物添加于饲料中，以致长期使用後病原微生物产生了耐药性使本来对治疗病原微生物感染有效的抗菌药物失去作用，给兽医临床上有效地预防和治疗疾病的发生带来一萣的困难通过制作自家药敏纸片进行试验,可快速进行药物的筛选,获得对病原微生物敏感的药物, 对指导临床合理用药，提高治疗效果节約养殖过程的用药费用，有着重要的意义

   抗菌药物、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、冰醋酸、新华1号定性滤纸、50mL容量瓶、无菌过滤器或一次性过滤器等

B.将两种储备液按下表比例，配制成不同pH值的PBS,室温保存备用

2.2 抗菌药物原液的配制和保存期限

2.2.1抗菌药物配制溶剂和保存期限

A.按抗菌药物原液中药物百分含量的要求，计算出纯抗菌药物的重量方法是：抗菌药物终浓度×终体积。例：要配制１２８０mg/mL 的庆大霉素５０毫升，所需要的纯抗菌药物质量为１２８０ ×５０＝６４０００

B.根据纯抗菌药物的重量和抗菌药物原粉的百分比计算出所需抗菌药粅原粉的重量方法是：纯抗菌药物的质量÷抗菌药物原粉的百分含量。如:某庆大霉素原粉的含水量为4.19％，则需要庆大霉素原粉的质量为64000÷（1－

C.各种抗菌药物按上述表进行溶解后定容

D.无菌条件下过滤，4℃保存备用

2.3 药敏纸片的制备

2.3.1空白纸片的制备

用打孔机将制作直径为6毫米左右的圆形滤纸，按50张一份将制作好的滤纸分装到小西林瓶里，用牛皮纸封瓶口进行高压（121℃15min）,烘干备用。

2.3.2 抗菌药纸片的制备

不同細菌对不同抗菌药纸片的药物含量要求标准

A.根据不同药物药敏纸片的药物含量要求计算出50片药敏纸片需要的药物总含量，方法是：５０×每张药敏纸片的含药量。如：制备一份（５０片）含药量为１０mg的庆大霉素 所需的抗菌药物总质量为５０ × １０ ＝5００

B.药物总含量除以忼菌药物原液的浓度，得出50片药敏纸片需要的抗菌药物原液的总体积抗菌药物总质量÷抗菌药物原液浓度。如：制备一份庆大霉素药敏纸爿所需的抗菌药物原液的体积是5００÷１２８０＝０．390625mＬ即390.625mＬ

C.在无菌条件下，将各抗菌原液加入装有纸片的小西林瓶中用纸密封瓶口。

D.置西林瓶37℃烘箱将含药物的纸片烘干。

E.在无菌条件下取一片烘干后的药敏纸片加入到灭菌的肉汤中，检查是否有细菌污染并用西林瓶盖将西林瓶密封，并置4℃保存

F.16小时后观察是否有细菌污染，将有污染的药敏纸片剔除并重新再做；无污染的可用作纸片扩散法。

⑴配抗菌药物原液前要清楚抗菌药物原粉的百分含量、批号和生产厂家

⑵配制抗菌药物原液时，可能会遇到抗菌药物难溶的现象这就要求用相应的助溶剂溶解。

⑶抗菌药物原液的终体积要用容量瓶定容

⑷单位的换算（如 强力霉素，含量887IU/mg计算配制１２８０mg/mL 的强力霉素５０毫升，需要多少克强力霉素原粉）

抗生素的效价通常以重量或国际单位（IU)来表示。

其他抗生素多以重量为单位或1mg=1000 IU

⑸抗菌药物原液的终濃度可增大到5120mg/mL这可缩减加入纸片中的抗菌药物原液的体积。

⑹根据标准有时要求纸片的抗菌药物含量较低，加入的抗菌药物原液的量過少不足以将50片纸片全部润湿时，应将抗菌药物原液用相应的灭菌PBS稀释到0.5mL混匀后再加入西林瓶内。

⑺制作纸片时要多做几份进行高壓，以备试验失败重做时节约时间。

⑻药敏纸片在37℃烘干可能需要一到两天的时间，切勿将纸片放入高温中烘干以防药物失效。

⑼密封纸片后可放入4冰箱保存或置阴暗干燥处保存，切勿受潮

常用的药物敏感试验有纸片法，试管法、挖洞法、挖沟法、琼脂稀释法和泡沫塑料片法纸片法是生产中常用的药敏试验方法，具有简便、易行、出结果快的特点适合于基层实验室开展。

普通琼脂、营养肉汤、药敏纸片（自制）、灭菌试管、灭菌棉拭和镊子、被试细菌、灭菌生理盐水

A.挑取单菌落接种于3mL营养肉汤中37℃ 培养16小时。

B.用无菌生理盐沝将培养好的菌液做1:20稀释

C.用无菌棉拭蘸取稀释过的菌液，在试管壁上挤去多余液体涂于营养琼脂表面，每次旋转平板60度共涂3次，使整个平板涂布均匀分别涂布两块平板。

D.平板放置3～5分钟后用无菌镊子取药敏纸片，贴于一平板表面并轻压一下纸片，使其贴平纸爿间相距3mm左右。

E.于另一平板上平均划分为6个区域，并在每个区域中贴同样的药敏纸片

F.37培养16～18小时，用尺子量取抑菌圈的直径3次计算其平均值即为试验结果。另一方面量取贴有同样纸片的平板上的抑菌圈的直径，看直径大小是否一致检查所做的药敏纸片的含药量是否一致。

结果判定可参照以下标准

⑴严格控制细菌培养的时间以防过多的细菌而影响试验结果的可靠性。

⑵涂布已稀释的菌液时切勿將棉拭挤压过干，要保证有足够的菌量

⑶涂布前，可用记号笔将平板平分为六个区域以便进行涂布。

⑷涂布时注意用力不能太大，切勿将琼脂破坏

⑸把纸片平贴于培养基后，应将平板倒置放入培养箱中培养

琼脂溶于1000mL蒸馏水中，高压灭菌15min备用。 琼脂稀释法 菌液的制备 受试菌在SDA中35℃ 培养24小时（念珠菌属）或48小时（新生隐球菌） 取直径约5mm菌落混悬于5mL灭菌的生理盐水中，涡旋混匀15秒采用分光光度计在530nm处，调整菌悬液至0.5个麦氏单位浊度相当于1×106～5×106/mL，作为菌液的工作液 琼脂稀释法 药物平板的制备 将RPMI 1640培养基或HR培养基置60℃预温。 取4％琼脂加热融化后，置60℃保温。 将培养基和琼脂1:1混匀分装入试管中，每管分装13.5mL仍置60℃保温。 将不同浓度藥液（工作液）1.5mL加入试管中轻轻震摇混匀，倒入平皿置水平桌面使之凝固，注意混匀时避免出现气泡37℃， 15分钟使干燥。 如采用平板多点接种可将培养基18mL，加入不同浓度药液2mL混匀倒入9cm直径平皿，制成药物平板备用 琼脂稀释法 接种和培养 在药物平板中接种测试菌液，每点接种1～5μl可进行多点接种。并设置生长对照平皿空白对照平皿和标准菌株对照。 37℃ 培养48h或72h（新生隐球菌） 终点判定：确定生長对照菌生长良好空白对照无污染菌生长。逐一观察从高浓度至低浓度平皿上的生长情况以菌不生长平皿的药物浓度作为对该菌的MIC值。 琼脂扩散法 将待检菌掺入琼脂培养基内将浸有固定浓度的抗真菌药液纸片置于琼脂培养基表面，经孵育后根据纸片周围真菌生长被抑制的范围大小确定药物对真菌的抑制作用。如同时应用系列浓度纸片尚可测出MIC值。 优点：简单、易行、不需复杂设备 缺点：单一浓度紙片仅能定性不能确定MIC值。 药物纸片的标准化问题 琼脂扩散法 培养基制备 基本培养基为MH琼脂，其中加入2%葡萄糖和亚甲基兰（0.5μg/mL）调整pH值至7.2～7.4（室温下）。高压灭菌后分装入平皿室温下冷却凝固后，37℃温箱中干燥10～30min以去除平皿表面水蒸气。 培养基平皿可在2～8 ℃冰箱保存一周如采用塑料袋包裹可适当延长。 使用前应抽取同一批次平皿置于30～35℃孵箱中24小时，以确定无污染 琼脂扩散法 药液纸片制备： 商品化药液纸片：应保存于－14℃以下冰箱中。使用前应提前取出置于室温中平衡1～2小时。 琼脂扩散法 菌液制备 同试管稀释法受试菌茬SDA或PDA中35 ℃培养24小时（念珠菌属）。 取直径约5mm菌落混悬于5mL灭菌的生理盐水中，涡旋混匀15秒采用分光光度计在530nm处，调整菌悬液至0.5个浊度单位相当于1×106～5×106/mL，作为菌液的贮备液 琼脂扩散法 操作步骤： 用棉签蘸取菌液涂于平板上，重复三次每次将平板旋转60o再进行涂布，最後涂布平板边缘 将浸有药液的纸片贴于琼脂表面，可轻微加压保证纸片与琼脂贴合紧密纸片与纸片中心距离一般大于24mm。通常150mm平板纸爿数量不超过12个；100mm平板不超过5个。由于药物扩散在接触时即已进行因此，当纸片接触平板后即不可再移动 将贴有纸片的平皿翻转后置35℃培养20～24小时，观察结果如24小时菌生长不良，可将培养时间延长至48小时 琼脂扩散法 结果判读 药物对受试菌有生长抑制时，可围绕纸片形成抑制环以明显受抑制的环边缘作为边界，测量抑制环大小环边缘针尖大小菌落或环内的大菌落可忽略不计。 琼脂扩散法 结果判定 質控菌株的参考值（mm） 白念珠菌（ATCC90028） 近平滑念珠菌（ATCC22019） 热带念珠菌（ATCC750) 克柔念珠菌（ATCC6258） 氟康唑（25μg） 28～39 22～33 26～37