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【求助】real-time PCR荧光染料法和探针法哪个方法灵敏度比较高？
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有个问题想请教下园内的高手，real-time PCR荧光染料法和探针法哪个方法灵敏度比较高？
不知道邀请谁？试试他们
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哪个灵敏度都很高，看你做什么实验，染料法主要适用于基因芯片、mRNA表达量分析以及siRNA效果确认等定量试验，探针法主要适用于病毒病原体检测、物种鉴定以及基因分型等定性实验。应用领域不一样。但是要是抛开这些实验以外个人认为探针法的灵敏度要高于染料法。毕竟探针法特异性很强，检测更灵敏。
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l风卷残云l 哪个灵敏度都很高，看你做什么实验，染料法主要适用于基因芯片、mRNA表达量分析以及siRNA效果确认等定量试验，探针法主要适用于病毒病原体检测、物种鉴定以及基因分型等定性实验。应用领域不一样。但是要是抛开这些实验以外个人认为探针法的灵敏度要高于染料法。毕竟探针法特异性很强，检测更灵敏。想和楼上讨论下，不知道我的看法是否对，我觉得特异性和灵敏度应该是两个概念，灵敏度针对的是最低检测限，特异性强不一定灵敏度就高。
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两种方法的灵敏度差不多，没有本质区别，能区别的是特异性可能不一样
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探针灵敏度高，必须的
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cnsder 探针灵敏度高，必须的能说下为什么吗
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探针法灵敏度高，我做过用探针法的上下游引物加染料，其结果和探针法的结果对比过探针法灵敏度要高，染料法能检测出来的最低浓度探针法可以再稀释100倍
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wcg129 探针法灵敏度高，我做过用探针法的上下游引物加染料，其结果和探针法的结果对比过探针法灵敏度要高，染料法能检测出来的最低浓度探针法可以再稀释100倍请问您用的是什么染料啊
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biotium的evagreen
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标题: 【原创】开贴讨论：SYBR Green I 的灵敏度 本周推荐讨论贴，请大家积极参与(灵敏度,染料,探针,双链)
摘要: [【原创】开贴讨论：SYBR Green I 的灵敏度 本周推荐讨论贴，请大家积极参与(灵敏度,染料,探针,双链)] 我们实验室的结果证实：SYBR Green I 的灵敏度比的Taqman探针的灵敏度 高 。但我没有找到其原理（原因）。经分析和师兄讨论感觉又一下几点：1、由于一个DNA分子可以与多个染料分子结合，激发的荧光比较多。2、由于染料分子可以和所有双链DNA分子结合（从而特异性不如Taqman探针），但是其灵敏度却有所提高。不知道大家有没有其他的观点可以一块讨论。或者资料可以提供。谢谢 关键词:[灵敏度 探针 染料 双链 特异性 荧光 原理]……
我们实验室的结果证实：SYBR Green I 的灵敏度比的Taqman探针的灵敏度 高 。但我没有找到其原理（原因）。经分析和师兄讨论感觉又一下几点：1、由于一个DNA分子可以与多个染料分子结合，激发的荧光比较多。2、由于染料分子可以和所有双链DNA分子结合（从而特异性不如Taqman探针），但是其灵敏度却有所提高。不知道大家有没有其他的观点可以一块讨论。或者资料可以提供。谢谢
回复好像是这样的但是TAQMAN的特异性很好，只要有荧光产生，就说明有特征产物。SYBR Green I只要是有产物就会发光，特异性不强，就是要比TAQMAN便宜。有M当然用TAQMAN探针好。回复好像是这样的但是TAQMAN的特异性很好，只要有荧光产生，就说明有特征产物。SYBR Green I只要是有产物就会发光，特异性不强，就是要比TAQMAN便宜。有M当然用TAQMAN探针好。我说的是灵敏度。不是特异性。特异性TAQMAN探针确实比SYBR Green I高。我也一直用的是Taqman。现在像用用SYBR Green I了。回复要先明确你的灵敏度的定义。如果你的灵敏度是指通过实验可以测出的最低的拷贝数，在这个前提下SYBR Green法比TaqMan法好的话，是因为TaqMan法在反应时比SYBR Green法多了探针结合，而探针结合的情况及效率都会影响“灵敏度”，如果拷贝数过低，探针结合的几率就小，表征的就是灵敏度不高。另外，一般SYBR Green法在Ct值超过30之后就容易出现非特异性扩增，这时再谈及灵敏度是没有意义的。灵敏度的前提是特异性，从这个角度来说，其实进行低拷贝检测时大家还是大多使用TaqMan法的。像临床检验的HBV试剂盒，都是TaqMan探针法，这样才能很好的测试临界阳性和阴性样本。回复要先明确你的灵敏度的定义。如果你的灵敏度是指通过实验可以测出的最低的拷贝数，在这个前提下SYBR Green法比TaqMan法好的话，是因为TaqMan法在反应时比SYBR Green法多了探针结合，而探针结合的情况及效率都会影响“灵敏度”，如果拷贝数过低，探针结合的几率就小，表征的就是灵敏度不高。另外，一般SYBR Green法在Ct值超过30之后就容易出现非特异性扩增，这时再谈及灵敏度是没有意义的。灵敏度的前提是特异性，从这个角度来说，其实进行低拷贝检测时大家还是大多使用TaqMan法的。像临床检验的HBV试剂盒，都是TaqMan探针法，这样才能很好的测试临界阳性和阴性样本。确实是这样，看自己的实验要求了。毕竟SYBR Green法要比TaqMan法便宜很多。上次看到一篇文章有人把SYBR Green与TaqMan结合起来用的。说是还不错。回复SYBR Green法要求形成引物二聚体的几率小 ,如果经过普通的PCR验证,目的基因和看家基因引物有引物二聚体形成的话,还能不能继续后面定量PCR呢?回复我最近的实验证明比SYBR Green I灵敏度高出十倍， 我是做最低检测限的，就是把一定量的细胞投入到血浆中，然后进行裂解后提取提取DNA,然后再进行其它处理后扩增，发现用Taqman探针所能检测出的最低细胞数量比SYBR Green I低一个数量级，我判断结果就是Taqman探针看有无扩增，而对SYBR Green I同时结合扩增曲线和融解曲线，我想以上老兄说SYBR Green I比Taqman探针灵敏度高是不是只看扩增曲线啊，有时SYBR Green I扩增时的曲线把引物二聚体也算进去了回复huixu wrote:要先明确你的灵敏度的定义。如果你的灵敏度是指通过实验可以测出的最低的拷贝数，在这个前提下SYBR Green法比TaqMan法好的话，是因为TaqMan法在反应时比SYBR Green法多了探针结合，而探针结合的情况及效率都会影响“灵敏度”，如果拷贝数过低，探针结合的几率就小，表征的就是灵敏度不高。另外，一般SYBR Green法在Ct值超过30之后就容易出现非特异性扩增，这时再谈及灵敏度是没有意义的。灵敏度的前提是特异性，从这个角度来说，其实进行低拷贝检测时大家还是大多使用TaqMan法的。像临床检验的HBV试剂盒，都是TaqMan探针法，这样才能很好的测试临界阳性和阴性样本。确实是这样，看自己的实验要求了。毕竟SYBR Green法要比TaqMan法便宜很多。上次看到一篇文章有人把SYBR Green与TaqMan结合起来用的。说是还不错。 请问如何把两个结合起来使用？回复作了近１年的SYBR Green I ，对于认为SYBR Green I 的灵敏度比的Taqman探针的灵敏度高，个人认为值得商榷。SYBR Green I 随机插入双链ＤＮＡ导致其特异性大打折扣，特别是引物二聚体的干扰。模板ＤＮＡ的量变化同样影响其精确度，所以常常导致每次所作结果差异大，批次误差和孔间误差明显。由误差造成的灵敏度增强只是一种假像，任何作过多年的real time pcr研究人员都清楚，若要精确定量首选还是Taqman探针哦！回复用qPCR作相对定量，是要得其准确性，不是灵敏度，不要本末倒置。有时作实验，SYBR GreenI可能是比Taqman信号要好一些，但是是否准确呢？信号是否都是目的扩增产物来得？这些都只得商榷。如果单纯强调灵敏度，现在某些公司改进了一些荧光染料，可以与DNA双链的大沟和小沟都集合，此种染料要比SYBR GreenI还要灵敏。回复我用的是宝的SBYR GREEN，敏感性到10拷贝数，敏感性挺好的，普通PCR 在10*5拷贝数。可是荧光PCR产物跑胶10*2都隐约 有目的带，奇怪！！！回复huixu wrote:上次看到一篇文章有人把SYBR Green与TaqMan结合起来用的。说是还不错。 请问如何把两个结合起来使用？1、他是在一个反应中即加入Taqman探针、又加SYBR Green染料，用Taqman 进行定量，用SYBR Green溶解曲线的Tm值的不同来区别基因型！不过看了些向光的文章发现，用SYBR Green 进行基因型的分析，很多更现在更加灵敏的荧光染料不同，和所用的不同而不同。
我一个师兄用他来区分TM值相差1度的两个片段，好像分不开，不知道是机子太老了（03年BIO-RED的机子），还是SYBR Green I 的荧光强度不够，现在确实又很多荧光染料比SYBR Green I 强很多。2、如果要定量的话，Taqman法肯定要比SYBR Green法要好的多，主要是我做的现在不需要定量，只是用于病害的检测！至于会不会出现假阳性，只有通过溶解曲线进行分析了。回复彬心玉壶
wrote:1、他是在一个反应中即加入Taqman探针、又加SYBR Green染料，用Taqman 进行定量，用SYBR Green溶解曲线的Tm值的不同来区别基因型！不过看了些向光的文章发现，用SYBR Green 进行基因型的分析，很多更现在更加灵敏的荧光染料不同，和所用的不同而不同。我一个师兄用他来区分TM值相差1度的两个片段，好像分不开，不知道是机子太老了（03年BIO-RED的机子），还是SYBR Green I 的荧光强度不够，现在确实又很多荧光染料比SYBR Green I 强很多。2、如果要定量的话，Taqman法肯定要比SYBR Green法要好的多，主要是我做的现在不需要定量，只是用于病害的检测！至于会不会出现假阳性，只有通过溶解曲线进行分析了。 用融解曲线很难区分相差1度的两个片断，有时两个峰会连在一起，出现一个相对较宽的峰。个人并不赞同用融解曲线的方法作为主要的分析手段，用来辅助分析产物的特异性还可以。实验中常常遇到同样的扩增体系，扩增产物也特异，但Tm值相差最多能到1度，这种情况再用Tm值区分两种片断，准确性可想而知！另外，如果按照这种方法做实验，TaqMan探针必定不能选择Fam染料，要尽量选择波长离520nm远一些的染料做探针标记，否则SYBR Green染料的交叉干扰会很厉害，影响定量结果分析。回复SYBR Green I 结合具有非特异性，如果TaqMan 与SYBR Green I 结合起来用，前者的产物也能与SYBR GReen I 结合产生荧光，这样使用TaqMan的作用似乎得不到很好的体现，建议采用双TaqMan 法。回复要说明SYBR Green I 的灵敏度比的Taqman探针的灵敏度高 是要从荧光是如何产生的说起。简单地说，荧光的产生是由于物质受到激发光的激发引起的，但不同的物质由于其结构的不同有的能产生荧光，有的不能；有的荧光效率高，而有的荧光效率低。荧光效率高的则灵敏度就高。荧光的高低除与物质的结构有关外，还与物质所处的环境，如极性、离子强度、温度、pH等有关，有时， 环境因素可以决定该物质的荧光效率。回复我最近做的实验模板量非常低，同时尝试了SYBR 和 Taqman两种方法，发现SYBR比Taqman能低3到4个Ct值，SYBR里面的无模板对照也会有扩增曲线，但其溶解曲线可明显地与目的样品区分开，拿产物跑胶，样品条带正确（300bp）,而无模板的孔只在100以下有一些模糊的带，不知这样可否确定为特异性扩增？还有如果在扩增过程中有二聚体出现并且增大总体的荧光量，这种二聚体会不会在之后的溶解曲线中体现出来（比如在目的产物峰值之前有一个小峰）？Taqman的无模板对照也会有扩增曲线出现，我做了几个不同的基因，有的与目的样品相差几个循环，有的基本一样，因为我的模板量非常低，样品的Ct值也都在30以后，这样就很难区分是否是非特异性扩增了，跑焦也看不出来结果，因为产物只有六七十bp。Taqman探针的特异性到底有多强呢？NTC里面的扩增是污染造成的吗？回复相同模板，PCR扩增条件及引物的条件下，Sybr Green扩增曲线肯定比Taqman的结果更好看（更陡，平台期更高，Ct也更小）如果这算灵敏度高的话。但严谨地说，Ct相对小不一定等于灵敏度高。实际灵敏度高低首先要考虑特异性和稳定性。特异性大家应该都了解，taqman肯定优于sybr green，稳定性是不同样品类型（如血液或粪便）、高低浓度(如10^9和10拷贝) 、不同前处理条件（qiagen抽提和简单加热裂解）下能否得到一致的结果。当然这些也不是所有实验室都需要考虑的，适合自己了够用的就是最好的。楼上"大家都很好" 估计得考虑PCR产物污染（可用UNG解决）和引物探针之间二级结构（只能重新设计引物或探针）的问题。taqman如果要有好的灵敏度，建议先只用引物跑跑syrb green PCR，确认没二聚体了再加探针做taqman PCR。taqman特异性虽然高，它毕竟也还是PCR，二聚体对它的检测灵敏度还是有影响的，尤其是低拷贝时。熔解曲线一般来说是辅助手段，不过如果基于探针（罗氏简单探针、杂交探针和分子信标探针，我们一般说的探针其实是taqman探针做不了熔解曲线）的熔解曲线，通过Tm来判断基因突变或病原体类型的话应该还是可靠性比较高。毕竟探针短，所以单碱基变异的Tm差异就很大。目前用这个方法拿到的诊断盒药证应该也有几个了。这个方法也比楼上有人说混合taqman探针和syrb green的应该差不多了。回复现在用饱和染料比如EVA green 是不是灵敏度更高呢？回复现在用饱和染料比如EVA green 是不是灵敏度更高呢？ 一般来说扩增曲线会更好一些，也算楼主所说的灵敏度更高吧，不过如果这个染料加到饱和程度也还是会略微抑制PCR的，比如不是很漂亮的S型曲线，所以有些eva 的mix 只是较高浓度的EVA而不是完全饱和的，如果做HRM还是对结果有些影响的。自己做个测试就知道了，有些厂家说的根本就不靠谱，剩下的厂家一般不会说假话，但经常不提他们所说的东西都有前提或限制要求的，反正实验数据才靠得住。真正qPCR灵敏度首先看自己的引物设计，接下来taq好不好也有影响，如果引物设计质量不高一般探针法的检测灵敏度要比sybr green及其它染料法好一个数量级左右，具体视情况而定；至于Ct，严格地说不是qPCR灵敏度的评价标准（看起来容易理解的常识往往不是事实），sybr green及其它染料法的Ct一般要比探针法小2-3个循环甚至更多。对于纯粹做qPCR技术或产品的人来说，灵敏度如小于100拷贝的情况下，核酸抽提环节必须得考虑；只是科研中简单用到qPCR的站友，不必考虑前面一句话，除非您做极微量样品的qPCR检测，如CTC之类的。回复非常感谢！回复非常感谢“mediated”的帮助！我做taqman用的mix是有UNG的，引物和探针是直接在公司买的混在一起的，应该也就没办法看引物质量了。我现在觉得可能是有几个引物质量不好，打算换一下试试。用SYBR的话，如果引物设计的好，溶解曲线很好，PCR产物电泳条带正确，测序也正确，是否可以认为和taqman的特异性相当呢？因为我的模板量实在很少，用taqman的话有的基因Ct都接近40了，这样的结果拿出来显得没那么有说服力。如果做预扩增的话，是在第一链加一个poly（A）的尾巴，然后用通用引物扩增，还是用随机引物六聚体就行了？这两种扩增方法会不会产生偏差，也就是改变各个基因在初始模板中的相对含量？
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