带gfp荧光蛋白酸碱稳定的蛋白固定后会淬灭吗

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【求助】GFP标记的慢病毒转染的细胞做免疫荧光
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这个帖子发布于2年零174天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
准备开始学习做免疫荧光,问题是我的细胞有一组是转染了GFP标记的。那我荧光的目的蛋白是GFP以外的另外两个蛋白,那这两个目的蛋白的二抗一定要避开绿色吗?
GFP的荧光不会在固定爬片后淬灭吗?
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EGFP标记更清楚一些
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defead EGFP标记更清楚一些 不不,你误会了,我是要把GFP的荧光弄灭,他影响我后面的实验了
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那你重新构建个载体,把荧光标记那一段去掉不举行了吗
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不不,你误会了,我是要把GFP的荧光弄灭,他影响我后面的实验了那可以转染红色的荧光咯
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【求助】细胞转染了GFP固定后还能发荧光吗?
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这个帖子发布于11年零284天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
细胞转染了GFP固定后还能发荧光吗?如果还能发荧光的话,用哪种方法固定比较好啊?
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rainsky edited on
可以,4%多甲即可,一定不能用无水乙醇
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我做过此方面的实验,千万不能固定,荧光会淬灭。正确的方法是用冰冻切片机快速固定,切片,直接在荧光显微镜下观察转染成功的细胞或组织(不能70度烤片)。观察完毕后,再依次染色。
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没关系的,4%多聚甲醛固定没问题的,荧光不会淬灭的。
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我在做间充质干细胞体外分化以及移植,现提供一些GFP资料1.1.GFP和EGFP1.1.1.结构
至今只有水母中的GFP基因被克隆。水母中的GFP由238个氨基酸组成,分子量为27kD。野生型GFP被紫外和蓝光激发后,能发出绿色荧光 [1]。野生型GFP有一些特点,如荧光较弱、易受温度影响、产生荧光过程滞后等。目前,已有多种GFP的突变体问世[2]。这些突变体萤光增强、蛋白折叠效率增加,如目前常用的EGFP,其发光强度比野生型GFP高35倍[3]。1.1.2.特点 GFP最大的特点是不需要底物或辅因子,可对活体检测,因而可对被标记对象进行动态、连续的观察。①体积小 只有Lac Z的1/5,表达无种属限制。②荧光表达稳定 即使是在甲醛或戊二醛固定的标本中,GFP的荧光仍能保持稳定。③不仅可与其它标记物,也可用不同突变体同时进行多种标记。④检测方便 常用荧光显微镜,激光扫描共聚焦显微镜观测。⑤无放大作用 因而很多情况下需要强启动子。1.1.3.应用
①标记基因 由于GFP诸多优点,越来越多的人倾向于用它代替传统的分子标记物。②荧光动物模型 用强启动子让GFP在转基因动物全身表达,就形成了绿色荧光动物模型。这类模型不仅提供有GFP标记的各种细胞、组织、器官,还可做为器官移植实验的动物模型。
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GFP 绿色荧光蛋白的淬灭问题
请问,有虫友知道有什么淬灭剂能淬灭GFP的荧光吗(最好是有机小分子)? 这种荧光团被桶装结构包围住的东西的淬灭感觉是个难事啊!!!
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