western曝光仪器 blot实验都需要哪些仪器

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-12-09 05:46 标签： western仪器
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求做western-blot所需要的所有试剂及仪器
本人课题组是做有机合成的，从来没接触过生物。现在老板想在实验室建立一套western-blot，但不清楚都需要哪些仪器和试剂。在网上看了很多实验步骤和视频，但是都没有特别具体。所以希望各位大侠能提供一个清单，我们购买回来后能立即用于实验。
不吝赐教，非常感谢!
PS:如果能提供相应厂家，更是感激不尽！
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Western-blot 实验原理、实验步骤及试剂选择指南
作者：市场部
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Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的常用的方法之一。本文分别介绍western 的实验原理、实验步骤以及试剂选择指南。 &
实验原理：
Western技术是通过后，经PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验步骤：
1.收集蛋白样品
用适当的裂解液处理贴壁细胞、或组织样品。某些特定组分的蛋白的蛋白抽提，请联系欣博盛为您查询。&&
总蛋白抽提试剂盒
total protein extration
Acitve Motif
核蛋白抽提试剂盒
核蛋白/胞浆蛋白抽提试剂盒
线粒体蛋白/胞浆蛋白抽提试剂盒
收集完蛋白样本后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。&
BCA蛋白定量试剂盒
Acitve Motif
蛋白定量试剂盒
2.1 SDS-PAGE凝胶配置
2.2 样本处理
在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。
2.3 上样与电泳
冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小。
通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
转膜完毕后，立即将蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗掉膜上的转膜液。吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。对于一些背景较高的抗体，4℃封闭过夜。
4. 一抗孵育
吸尽封闭液，加入稀释好的一抗，室温摇床上孵育1小时或者4℃孵育过夜。Western结果通常需要提供内参作为对照。通常选用Tubulin或Actin抗体，进行内参检测。
一抗欣博盛推荐Genetex抗体，GeneTex抗体所含盖的领域从神经学、血液血管学、免疫学、代谢机制、细胞信号传导、干细胞研究、老化、遗传学、感染疾病诊断与研究，乃至于斑马鱼模式动物抗体等，并提供完善的客制化抗体制备服务。目前该公司拥有的抗体总数已逾55,000种，而且每月仍有近百种新型抗体推出。其中，以小鼠单株抗体与兔多株抗体为该公司最具质量与价格优势的产品。网站链接如下：。网站有详细的各个领域的研究资料。
如需订购请联系Genetex全国总代理欣博盛。&
Neobioscience
核蛋白内参抗体
Histone H3.1 antibody
核蛋白内参抗体
Histone H2A.X antibody
膜内参蛋白
NaK ATPase antibody
5. 二抗孵育
吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或者4℃摇床上孵育1小时。SouthernBiotech能够提供多种不同标记的二抗。&
Rabbit IgG antibody (HRP)
抗山羊二抗
抗小鼠二抗
Goat Anti-Mouse IgG(H+L), Rat ads-HRP
Neobioscience
抗小鼠二抗
Neobioscience
6. 蛋白检测
6.1 ECL化学发光，显影，定影
将A和B两种试剂在离心管中等体积混匀；1 min后，将溶液平铺在膜蛋白面，暗室反应2min后去尽残液，包好，放入X-光片夹中。在暗室中显影定影。
6.2 凝胶图像分析
将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图像处理系统分析目的条带和内参条带的净光密度值以及他们的比值。
关注欣博盛新浪微博& & & & & & & & & & &&& & & &&板和盒子，Wes 则可完全用于下一次试验。
& & & & & & & & & & & & & & &图1. 样品预填.&&&&&&&& &&&&&&&&&&&&&&&&图 2. Detection of PI3 Kinase (p110) in 0.2 &g/&L HeLa Lysate.
& & & & &The intra-assay CV across all 25 capillaries is &5%.
Wes 不仅使开展Western blot实验比以往更快，还显著提高了性能。其具有的敏感性至少是第一代 Simple Western 仪器的<span lang="EN-US" style="font-size:10.5font-family:&Arial&,&sans-serif&;color:#倍，还能保证 Simple Western 分析所具备的准确度。Wes 目前不仅在时间方面，还在敏感性方面超越了任何传统的 Western。
参数特点：
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