钟媛（广西壮族自治区柳州市红十字会医院内科 545001)
【中图分类号】R596.1【文献标识码】A【文章编号】（2-03
&&&&&&& Duchenne肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种致死性的X性连锁隐性遗传病，该病主要影响男性，发病率约为1/3500男婴[1]。DMD是最严重和最常见的进行性肌营养不良病，通常患者3～5岁发病,主要表现为全身骨骼肌进行性无力、萎缩和小腿腓肠肌假性肥大,血清肌酸磷酸激酶水平很高,随着病情加重,12～13岁前丧失行走能力,20岁左右死于呼吸衰竭或心力衰竭。该病目前尚无有效的治疗方法，但对本病的探索一直在进行当中，本文主要对本病目前的基因治疗进展进行概述。
&&&&&&& 人类dystrophin基因定位于Xp21.1区域[2],是目前已知最大的基因，其长度2250kb,占全部基因组长度的0.1％，占X染色体全长的1.5％。该基因包括79个外显子和78个内涵子（占基因全长的99.4％），其cDNA全长14kb。Dystrophin蛋白为dystrophin基因编码的蛋白产物，分子量 427 kDa，由3685个氨基酸组成。该蛋白与&－血影蛋白（&－spectrin）和&－辅肌动蛋白（&－actinin）等骨架蛋白在结构上相似，占细胞骨架蛋白的5％和横纹肌总蛋白的0.002％[3，4]。 Dystrophin蛋白分5个功能区域：（1）N端肌动蛋白结合区：与&-actinin蛋白同源，包含第14～240氨基酸，跨越1～8号外显子，与细胞内的肌动蛋白（F－actin）相连接。（2）中央棒状区：包含第253～3040氨基酸，跨越9～63号外显子，由24个三螺旋状重复结构组成，每个结构由109个氨基酸组成，与血影蛋白同源。重复结构被4个富含半胱氨酸的铰链（Hinger,H）结构分隔开。（3）WW功能区：WW功能区是棒状区与半胱氨酸富集区的重叠部分。（4）半胱氨酸富集区：第 氨基酸，跨越64～68号外显子，包含有两个EF手形钙结合基序，可结合钙调蛋白，该区域与抗肌萎缩蛋白聚糖复合体相连。（5）C端区：即羧基端区域，第氨基酸，跨越68～79号外显子，具有种系保守性序列，但可以剪接，其结构与dystrophin相关蛋白utrophin、dystrobrevin同源，与syntrophin 和&-肌营养不良蛋白聚糖相连。上述5个区域的结构和功能不同，受累后产生症状的严重程度亦不一致，N末端和中央棒状区受累可引起轻重不等的 BMD或DMD表型，半胱氨酸富集区和C端前半部的损害则几乎均引起严重的DMD。由dystrophin蛋白的结构可以看出，dystrophin一端与细胞骨架肌动蛋白相连，另一端在半胱氨酸富集区与抗肌萎缩蛋白聚糖相连，并借此与sarcoglycan紧密相连，C端与syntropin、dystrobrevins相连，这样与细胞膜下骨架蛋白和膜外蛋白构成一个整体共同维系细胞膜的稳定，特别是在肌肉收缩和舒张时维系细胞膜的稳定，调节肌纤维的分化，组织突触后膜与乙酰胆碱受体间的相互作用。DMD患者由于基因突变，造成抗肌萎缩蛋白缺失，肌膜失去稳定性，在收缩过程中极易损伤，细胞外钙离子大量进入细胞内，细胞内钙离子浓度升高， 肌纤维变性、坏死。
&&&&&&& 1 Mini-dystrophin和micro-dystrophin
&&&&&&& 基因治疗DMD主要困难在于dystrophin基因巨大, 仅cDNA 就长达14kb, 因此多数治疗载体不能装载。依据对BMD患者dystrophin基因的研究发现, 虽然BMD 患者的dystrophin基因存在大片缺失（第17－48号外显子缺失，占整个dystrophin基因的46％）但是其临床症状轻微, England等[5]从BMD患者基因组中克隆出长为6.3kb的缩短dystrophin,称为mini-dystrophin。Mini-dystrophin基因编码的蛋白产物保存了正常抗肌萎缩蛋白的主要功能。通过敲除中央杆状区的20个血影蛋白样结构, 保留4个血影蛋白样结构, 构建了△R4-R23 基因。对于该基因的功能研究表明, 携带有该基因的转基因鼠骨骼肌和膈肌的肌力均比mdx 鼠好, 达到正常C57小鼠的75%, 并且骨骼肌能够对抗运动损伤[6，7]。Crawford等发现抗肌萎缩蛋白羧基端对于维持该蛋白的功能不是必须的, 因此构建了敲除中央杆状区的20个血影蛋白样结构和大部分羧基端（71-78号外显子）的截短的肌萎缩蛋白基因, 即△R4-R23/△CT, 称为microdystrophin基因, 长度为3.75 Kb, 被认为是治疗DMD 的有前途的候选基因之一, 目前常用的各种治疗载体均能够携带该基因[8]。有关缩短的肌萎缩蛋白基因功能的研究, 为在体外对肌萎缩蛋白基因进行修饰奠定了基础。
&&&&&&& 2 导入功能性dystrophin基因
&&&&&&& 2.1质粒载体：由于dystrophin 基因的长度大于一般病毒载体的克隆容量, 质粒成为导入全长dystrophin cDNA的主要载体。自Wolff[9]裸质粒直接肌肉注射可使肌细胞中有dystrophin表达后，研究者随后进行了大量相关研究以提高质粒转染率，并发现通过电穿孔技术、超声、酵素（透明质酸酶）辅助注射、非离子物理载体携带质粒转染等方法可以提高质粒转染率[10]，其中电穿孔术提高质粒转染后dystrophin基因表达率的作用最为显著，但此法可造成肌肉的严重损害[11]。此外局部注射作用范围有限，因此有学者对DMD模型动物md x鼠采用动脉注射裸质粒的方法，结果发现有1～5％的肌纤维稳定表达dystrophin，且持续6个月。研究同时发现mdx鼠体内出现抗dystrophin抗体，但未发现细胞免疫应答[12,13]。动脉注射裸质粒的方法还被用于除人之外的灵长类动物且获得比鼠更高的转染率。受动物实验结果的鼓舞，质粒介导的基因治疗已用于临床实验。Fardeau等[14]在I期临床试验中, 将人全长dystrophin cDNA 质粒分别导入9位患者桡侧肌肉中, 3周后6位患者的肌纤维中检测到了dystrophin 蛋白表达。虽然表达水平较低, 但并未观察到细胞及体液免疫反应。这些结果提示肌内转染dystrophin 基因表达质粒可使DMD患者获得外源基因的表达。Thyagarajan等[15]将剪接酶与质粒整合，从而使质粒借助剪接酶整合入哺乳动物基因组中，提高转基因的稳定表达时间。Bertoni等[16]应用此技术将携带有dystrophin基因的质粒整合入mdx鼠的基因组中，提高了dystrophin的稳定表达水平和表达时间。但此种方法有引起插入突变的风险。总之质粒是比较安全的基因载体系统, 如能进一步提高转基因长期表达水平, 质粒将在临床试验中越来越多地受到推崇。
&&&&&&& 2.2腺病毒载体：腺病毒载体为一种双链DNA病毒，无包膜。通过与细胞膜结合，借助细胞内饮作用，进入细胞内自主复制，由于活的腺病毒不会引起插入突变，且无致癌性，在基因工程中得到广泛应用。1993年Ragot等[17]构建6.3kb的dystrophin微基因的腺病毒载体，注射mdx小数的肌肉，15天后50％的肌纤维表达dystrophin。但腺病毒载体只能携带小于8kb的外源基因，且基因表达时间短，可引起强烈的细胞免疫。这些都限制了腺病毒载体在DMD治疗中的应用。新构建的依赖辅助病毒的腺病毒载体（helper-dependent adenovirus, HDAd）, 去掉了腺病毒的所有结构基因和包装信号, 仅保留插入末端重复序列, 其克隆容量可达37kb, 能携带全长dystrophin cDNA。将此种HDAd 注射到mdx鼠肌内, 使得30％肌纤维可合成dystrophin蛋白，并纠正治疗肌肉的病理改变, 新生mdx 鼠和老年mdx鼠的肌肉功能得到提高[18，19]。然而,HDAd 仍会引起免疫反应。Jiang等[20]发现, 将dystrophin基因与T 细胞共刺激阻断基因（CTLA4Ig 和CD40Ig）同时注射到mdx 鼠肌肉中, 能有效抑制腺病毒载体引起的体液免疫反应, 并维持dystrophin 基因的持续表达。
&&&&&&& 2.3 腺相关病毒载体：由非病源性的复制缺陷性人类细小病毒改建而来,能整合到宿主细胞染色体中,并稳定存在。AAV具有转染效率高、表达时间长、广泛的细胞和组织定向性等优点。AAV还能有效而稳定地转染成熟及未成熟的细胞, 不引起任何人类疾病。但AAV克隆容量4.7kb, 仅适合作minidystrophin或micro－dystrophin cDNA载体[21]。在mdx鼠局部或全身注射携带micro-dystrophin 基因的AAV载体, 可有效改善肌萎缩症状, 使肌纤维形态学、组织学和膜结构完整性恢复正常[22]。目前大多数AAV为重组AAV2型，在对鼠的研究中AAV2型并不引起任何免疫反应，但将AAV2型载体应用于正常狗和肌营养不良狗中均出现明显的免疫反应[23]。而且自然人群中大约有18～67％的人感染过腺相关病毒，其中大部分人体内存在针对AAV2的抗体[24]。这些成为腺相关病毒临床应用的主要障碍。最近出现的新型AAV载体如AAV6、AAV8、AAV9进一步提高了转染肌肉组织的效率，成为临床基因治疗的希望。
&&&&&&& 2.4 逆转录病毒载体：外源性基因可随逆转录病毒载体进入细胞，与染色体随机整合。1993年Dunckley用逆转录病毒载体构建了一个能表达Dystrophin微小基因的重组体,注射入mdx鼠的骨骼肌中,结果5%～10%的肌纤维细胞摄取了重组体,并表达了Dystrophin ,且持续时间在6 个月以上,但该载体仅能转染分裂期细胞,成熟的骨骼肌细胞则不敏感,且插入基因较小[25]。逆转录病毒载体介导基因治疗严重免疫缺陷病的临床实验中22例患儿中有3例相继患上白血病[26]。研究证实为逆转录病毒随机整合激活原癌基因LMO2所致[27-29]。因此逆转录病毒应谨慎用于DMD的临床治疗。
&&&&&&& 2.5 人类免疫缺陷病毒载体：是很有吸引力的病毒载体，其最大容量为7.0～7.5kb，适合作mini－dystrophin cDNA和micro－dystrophin cDNA的载体，HIV载体能感染肌细胞并高效表达[30]。转入体内的表达率低，但安全性有待进一步研究。
&&&&&&& 3 纠正突变的dystrophin基因
&&&&&&& 3.1 反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide ，AON ）: 是指与单链RNA或DNA互补的一段寡聚核苷酸序列，一般含15～20bp的碱基序列，能与特定的核苷酸序列通过Watson-Crick 作用杂交形成稳定的互补结构[31]。反义寡核苷酸可与mdx鼠的dystrophin 前体mRNA的相应区域结合，抑制或封闭该基因的转录和表达，并跨过突变位点，将上下游内含子进行剪接，跳过突变位置进行转录，使阅读框架得以保留，产生截短的dystrophin蛋白。mdx鼠在dystrophin基因23号外显子有一个无义突变，引起转录的提前终止。最初的研究是在体外培养的mdx鼠肌细胞，以23号外显子的剪接位点为靶点，使用2－O－甲基AON来诱导外显子切除，能够合成近于全长的截短的肌营养不良蛋白[32]。肌肉注射2OMeAON后治疗部位大多数肌纤维可测到近于正常水平dystrophin蛋白持续产生，注射1次AON后dystrophin蛋白水平在2－4周达到最高，12周时仍可检测到表达。并且未引起免疫反应[33]。显然, 基于反义寡核苷酸的基因治疗有明显的优点及体内直接治疗作用, 但此种方法作用时间短，其持续时间与反义寡核苷酸和治疗产生的dystrophin蛋白在组织中的半衰期有关，且只适用于突变位点不在dystrophin 基因重要功能区域的DMD患者。
&&&&&&& 3.2 RNA/DNA嵌合寡核苷酸引发基因修复: 迄今为止，最为成功的基因修复方法是用嵌合体单元（一种单股RNA/DNA寡核苷酸）与一段小的目标序列进行碱基配对并启动修复基因突变[34]。有研究尝试用RNA/DNA嵌合寡核苷酸治疗mdx鼠，其原理是RNA/DNA嵌合寡核苷酸与mdx鼠dystrophin基因中点突变的位置杂交，激活错配修复蛋白，启动宿主细胞的核苷酸错配修复途径，修复dystrophin基因的点突变。并发现这种修复途径可以部分恢复mdx鼠的全长肌营养不良蛋白表达，但能否改善mdx鼠的症状还需进一步研究[35]。
&&&&&&& 4 相关基因的上调表达
&&&&&&& Utrophin是肌营养不良蛋白的同源蛋白，分子量430kd,它的表达与肌营养不良蛋白有一定的互补性。在DMD患者中utrophin的表达正常，若能让utrophin表达增加，或许能补偿肌营养不良蛋白的功能。Wakefield等应用组装utrophin微小基因构建物注入dystrophin/utrophin鼠的肌肉中，30天后注射部位95％的肌纤维出现表达，核中心移位的肌纤维由80％降到12％，肌纤维坏死好转[36]。
也有一些研究人员试图增强一些与肌膜稳定性、肌细胞再生、抗坏死和抗炎症反应等基因的表达，补偿肌营养不良蛋白的缺陷，此类基因包括&7&1整联蛋白,N－乙酰半乳糖胺转移酶、解整合素－金属蛋白酶12、钙蛋白酶抑制蛋白、胰岛素样生长因子－I、一氧化氮合酶、肌抑制素和微集聚蛋白等。这些基因的上调表达一般无害，但少数基因表达量太高会导致组织损伤，因此通过它们的上调表达改善DMD症状还需仔细控制表达的水平及时间[37]。
&&&&&&& DMD的诊断和治疗自dystrophin 基因鉴定以来取得了很大突破和进展, 理想的基因治疗应是：将目的基因有效转染至各个时期的肌细胞，得到高效表达；广泛的分布于所有病损组织，且不引起机体产生免疫反映；细胞毒性反应小；表达时间长；有靶向性，对病损组织以外的部分无负面影响。目前基因治疗手段仍无法完全满足要求，因此寻找有效策略来解决这些问题是目前及今后研究的重要内容。
参 考 文 献
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基因检测中病理标本DNA提取经验总结
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　　随着分子生物技术在临床中开展， 其所覆盖的检测疾病的范围越来越广， 不仅在常规医学检验中，近年来随着临床靶向治疗的普及，病理肿瘤标本的相关基因检测也得到发展。 然而，什么样的病理标本适合做基因检测？ 怎么才能够得到更多更好的 DNA 呢？ 是目前我们病理科开展此项目所面对的问题。 经过我们不断实践，现将几点体会介绍如下。
　　1 标本及时合适的固定是石蜡标本基因检测的关键步骤
　　活组织或脱落细胞应得到及时且合适固定液固定， 一般活组织离体 30 min 内冻存或 10%中性缓冲福尔马林固定，脱落细胞应及时离心，-80℃保存或用棉絮纸包裹，按组织常规处理。 合适固定液及时固定可以大大降低 DNA 的降解，减少基因的片段化，同时避免使用含重金属固定液，如 Bouin液等。 若标本固定不佳，在后期的标本制备过程则无法加于纠正。 临床送检组织标本时间与固定后标本取材时间之差最好统一， 一般为 6~48 h 为好[1,2]. 活检小标本一般为 6~12h, 组织大标本为 6~48h 且按要求剖开固定，保证标本充分固定，有效保护细胞中 DNA 质量，提高 DNA 提取效率，保证检测结果的可靠性。
　　2 足够的肿瘤细胞是石蜡标本基因检测的必备要求
　　足够的肿瘤细胞是基因检测 DNA 提取的基本条件，也是必备要求。 在挑取肿瘤组织蜡块时，应充分地考虑肿瘤细胞数量、 组织类型及避开坏死组织等。 在提取标本 DNA 时一般应首先进行病理评估，了解肿瘤细胞的数量、肿瘤细胞百分比及组织类型， 如达不到病理评估的要求则应终止下游基因检测，符合要求进行下游检测。 实际过程中我们可在切取病理石蜡标本做 DNA 提取时切一张白片用于 HE 染色于判断肿瘤百分比及肿瘤细胞数。 如该标本已行免疫组化检测时不能将用于常规病理诊断的 HE 染色制片中肿瘤细胞分布情况用于病理评估，在切取标本提取 DNA 时再切一张白片用于染色， 以免免疫组化检测后肿瘤细胞数量不足，特别是活检小标本。 肿瘤细胞含量的最小比例应由不同检测方法的敏感度决定， 专家共识认为要求肿瘤细胞数一般要求大于 200 个，且肿瘤细胞应占整张切片所有细胞 10%以上[2]. 实际操作中应尽量刮取肿瘤细胞丰富的区域且避开坏死或红细胞较多的区域用于 DNA 的提取， 可以提取到高质量相关 DNA,特别是测序技术，同时可降低PCR 扩增抑制物的存在。 手术根治标本是我们病理基因检测的最好标本，肿瘤细胞较多、含量比例高。
　　相反，活检小标本一般肿瘤细胞数偏少。 如肿瘤细胞数量不够， 可多切组织切片弥补肿瘤细胞不足，但应保证肿瘤细胞占整张切片所有细胞 10%以上，如肿瘤细胞所占比例小于 10%,组织标本应脱蜡后切除无关细胞已达到要求，这样肿瘤细胞提取相关DNA 质量仍好。 同时应对病理评估结果做好记录，方便与 DNA 提取结果进行比较，累积经验。
　　3 DNA 提取是石蜡标本基因检测的前提条件
　　3.1 标本的选择 一般选择病理组织蜡块保存时间越短越好。 组织标本经过福尔马林固定，可引起组织蛋白与核酸交联反应。 石蜡组织标本保存时间越长，核酸片段化越严重，加剧核酸甲基化修饰，核酸提取质量越差，浓度偏低[3]. 保存时间长的标本切片时应尽量切掉与空气接触的外层组织再切取组织进行 DNA 提取，特别是未行封蜡的组织蜡块。
　　3.2 标本的处理 石蜡标本在进行切片前，应将切片机清洁干净，可用 75%乙醇消毒台面及镊子等。
　　每个标本应选择一个刀口， 严格控制标本间交叉污染。 手术根治标本最好选择 5&m~10&m 切片黏附载玻片上，脱蜡完后用手术刀转移组织，简便、省时； 而活检小标本可以选择 EP 管收集连续切片，管内脱蜡，达到尽可能收集肿瘤细胞。 在进行组织切片时不建议厚度超过 10&m 或低于 5&m,过厚组织切片会增加脱蜡的困难， 也增加细胞酶消化和裂解的难度； 过薄则容易产生 DNA 断裂。
　　如选择 EP 管二甲苯脱蜡时乙醇去除二甲苯后，应晾干方可进入下一步骤， 残存有机溶剂会降低提取率及后续扩增效率。 对于 EP 管脱蜡，应关注 EP管底至少有肉眼可见的样本存在， 以保证足够DNA 用于下游检测。
　　3.3 DNA 的提取 DNA 提取一般情况下应严格按照本实验室的 SOP 文件执行， 然而在实际操作过程中往往要对不同情况进行针对性处理， 才能获得比较满意的结果，笔者归纳如下。
　　3.3.1 酶及裂解 实验中标本消化一般用蛋白酶 K,其浓缩粉末可室温 15~30℃保存， 分装完应放入-20℃保存。 DNA 提取操作中首先温度设定为 56℃蛋白酶 K 的消化及裂解过程， 最佳工作消化时间视标本而定，不同的标本一般不一样[4]. 过量的标本含量将影响酶的消化及裂解效果， 标本含量越多消化及裂解时间应越长， 酶消化完成后应检查酶消化效果， 如还有很明显的组织漂浮物应说明样本加入量偏大应适度延长酶消化时间。 适量加大酶量或延长消化时间有助于加强消化裂解作用[5,6]. 蛋白酶 K 消化一定要满足 DNA 释放完全有效，保证以满足后续实验需要 DNA 的量[7]. 蛋白酶K 消化裂解后进入 90℃灭活， 此阶段裂解液对修饰 DNA 及释放 DNA 进一步发挥作用。
　　3.3.2 DNA 洗涤 DNA 洗涤液使用前按要求加入无水乙醇，使其成为合格的 DNA 洗涤液，否则造成DNA 柱上流失，大大降低其浓度。 DNA 洗涤时将洗涤液静置时间应严格控制， 保证洗涤液与核酸有充分的反应时间，提高标本 DNA 洗涤效果。
　　3.3.3 DNA 洗脱 洗脱液 pH 不合适，将会减少 DNA提取效率，应确保洗脱液 pH 值在 7.0~8.5 之间。 为了提高 DNA 洗脱效率，可在加入洗脱液后在室温静置至少 3min 以上，肿瘤细胞偏少应 5min 以上，再按要求离心。 加入洗脱液量可根据我们病理评估及基因检测要求量的结果适度加减，超过 200&l洗脱体积所得的 DNA 浓度会降低， 但 DNA 总量不会减少。 建议活检小标本 DNA 洗脱液体积应小于 100&l.
　　4 DNA 定量
　　提取的 DNA 应经过定量以保证足够适量的DNA 含量用于下游突变检测。 DNA 提取后应立即进行 DNA 浓度测定，随后存储 DNA 样本。 可利用分光光度计在 260nm 处光密度值和银光染料法DNA 总量检测 ,OD260nm/OD280nm比值可直观判断基因的纯度，一般值为 1.8~2.0 较好，该方法较简便，但无法评估可扩增的 DNA 片段和 PCR 抑制物。若DNA 含量的确不符合检测要求应终止进一步检测，以节约成本和时间。
　　综上所述， 在病理石蜡标本基因检测 DNA 提取中，我们应尽量了解每个步骤的作用以及学会如何控制石蜡标本 DNA 提取的关键点， 这是对石蜡标本基因检测的操作者必备要求，也是如何防止假阳性假阴性结果的出现而采取了质量保证措施，同时也是我们病理科开展基因检测项目前提[8].
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