lentiCRISPR v2
载体基本信息
载体质粒图谱和多克隆位点信息
载体质粒图谱pdf版和相关资料下载
载体应用举例
Copyright ©
BIOFENG. 生物风 版权所有 Powered by Biofeng您好！欢迎光临汉尹生物-Hanyinbt&
CRISPR/Cas9基因敲除质粒构建服务
摘要： CRISPR/Cas9是一种最新的靶向基因敲除技术，能够强有力的作用于基因组的分子生物学工具。
★&服务简介& & Cas9蛋白的CDS长达4kb，克隆难度和包毒难度都相对大，将Cas9基因高效导入细胞是应用Cas9/CRISPR系统进行基因敲除的难点之一，极大地限制可供选择的将基因导入细胞的方法。并且在用CRISPR/Cas9系统进行基因敲除时，还需要同时转入识别靶点的gRNA，筛选阳性细胞的抗性基因或荧光基因，用同源重组法进行基因敲除，还需要导入同源重组模板。如此多的基因共同表达，很难得到较高的基因编辑效率，造成后续的阳性克隆筛选和检测工作难度大。&& & 汉尹生物独创性研发出慢病毒Cas9表达体系。该体系采用慢病毒体系先在细胞中稳定表达Cas9蛋白，构建稳定表达Cas9蛋白的细胞系，再在该细胞系的基础上导入gRNA和基因敲除实验中用到的其它原件。该体系采用慢病毒体系先在细胞中稳定表达Cas9蛋白，构建稳定表达Cas9蛋白的细胞系，再在该细胞系的基础上导入gRNA和基因敲除实验中用到的其它原件用于特异性基因敲除。★&服务描述& & CRISPR/Cas9是一种最新的靶向基因敲除技术，能够强有力的作用于基因组的分子生物学工具。该技术现已证明能够在多种哺乳动物细胞，植物细胞，酵母中进行靶向基因敲除和定点编辑。传统的CRISPR/Cas9系统需要分别转录出tracrRNA（trans-activating RNA）和crRNA (CRISPR RNA)，然后这两者通过碱基配对形成tracrRNA:crRNA二元复合体指导Cas9蛋白剪切特定位点的双链DNA（图1）。我公司采用新型的单链引导RNA(single guide RNA,sgRNA)可以模拟tracrRNA:crRNA二元复合体,能够直接与Cas9核酸酶构建在同一质粒上，表达后指导基因组DNA的切割（图2）。& & &图1：传统的CRISPR/Cas9系统&&&&&&& &&图2：单质粒CRISPR/Cas9系统★&服务特点& & 1.适用于在同一个细胞系中需要进行多个基因敲除的实验；& & 2.基因敲除效率比直接质粒转染更高；& & 3.提供多种不同荧光和抗性标记的慢病毒表达载体，更易筛选到基因敲除成功细胞；& & 4.接受cas9蛋白稳定表达不同细胞系定制。★&服务内容& & &提供哺乳动物的Cas9质粒构建服务；★&汉尹优势& & 1：1个质粒即可完成基因敲除实验；& & 2：只需两周即可完成质粒构建；& & 3：可以同时针对靶基因的多个位点进行剪切；★&客户所得& & 1：符合客户要求的重组质粒（约2ug）和甘油菌（约200ul）；& & 2：完整的电子版实验报告（包括实验材料，步骤，载体图谱等）；& & 3：完整的测序报告；
浏览 (2516) |
(0) | 评分(0) | 支持(0)
| 发布人：
将本文加入收藏夹
[分子生物学平台]
[RNAi平台]
[RNAi平台]
[RNAi平台]
[动物实验平台]
扫描二维码
关注汉尹生物官方微信平台及时了解最新动态及优惠活动每周都有送出小礼品
全国免费电话：400-606-4882工作时间：周一至周五 8:30 ~17:30周六、周日 请拨打：
完成身份信息认证购物即有双倍 积分奖励
赶紧来扫一扫吧&&&&
欢迎来电垂询
传真：021-
?&载体质粒
&&&& （技术支持）
?&支原体清除
（客户服务）
服务QQ： （客服服务）
?&报告基因质粒&
服务QQ：（技术支持）
| & |&& |&
|& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& (C)
汉尹生物科技（上海）有限公司
ICP备 &浙B2-
Error: Fold (./) is not writableCRISPRCas9敲除PES1基因质粒构建_百度文库
两大类热门资源免费畅读
续费一年阅读会员，立省24元！
CRISPRCas9敲除PES1基因质粒构建
上传于||暂无简介
阅读已结束，如果下载本文需要使用1下载券
想免费下载本文？
定制HR最喜欢的简历
下载文档到电脑，查找使用更方便
还剩4页未读，继续阅读
定制HR最喜欢的简历
你可能喜欢新功能、新界面、新体验，扫描即可下载生物谷APP!
>> CRISPR精品操作指南：如何精确有效完成实验！
CRISPR精品操作指南：如何精确有效完成实验！
来源：生物通
生物学家们总是沉迷于对基因组修修补补，而其中一种近期红得发紫的技术就是 CRISPR。自2012年CRISPR/Cas 首次作为一种基因组编辑工具登台以来，关于这种技术的论文数量就大幅增加，最好的证明之一就是2015年两位科学家由于在CRISPR基因组编辑技术方面的重要贡献而获得“科学突破奖”，其中一位获奖者：Jennifer Doudna 最近在范德堡大学进行客座演讲，主会场和分会场都挤满了人，从中可以窥见这一技术的火热程度。
CRISPR全称为clustered regularly interspersed short palindromic repeats，是源于细菌及古细菌中的一种后天免疫系统，它可利用靶位点特异性的RNA指导Cas蛋白对靶位点序列进行修饰。直到近年，科学家们才开始利用这一系统在活体动物基因组中生成靶向突变，删除原有的基因或插入新基因。
这一技术发展迅速，就在去年，研究人员已经发现了利用CRISPR/Cas 治愈小鼠中一种罕见肝脏疾病的方法，并且科学家们也发现可以通过这种方法切除人类免疫细胞中HIV病毒插入的基因，阻止HIV进入血液干细胞。其原因可能在于这种方法比其它基于核酸酶的编辑方法操作简便，研究人员跟着指南操作，进行一轮PCR就能基本完成CRISPR实验了。
但CRISPR/Cas系统也存在自身的一些缺陷，比如进入细胞后，有可能在非目标位点进行酶切，从而导致脱靶，这对于临床应用来说是一大败笔。
我们需要更加精确和有效的CRISPR工具，研究人员也正在研究如何避免这类情况的发生，开发更好的预测编辑工具，或者研发能将CRISPR元件更有效传递到细胞内的方式，以下是The Scientist杂志汇总的新进展。
癌症研究的启示
研究者：康奈尔大学遗传学教授John Schimenti
项目：利用 CRISPR/Cas9 研发癌症和减数分裂小鼠模型
CRISPR/Cas9系统是通过在基因组上造成切口来完成编辑工作，这些切口可以通过两种途径修复，一种是由非同源性末端接合(Non-homologous end joining， NHEJ) 过程进行粘合，这种方法有效但容易出错；另外一种方法就是加入包含精确目标突变的DNA人工片段，利用同源指导修复（homology-directed repair，HDR，编者译）完成。
Schimenti 说，“问题在于这两个过程是竞争完成的。前者NHEJ会由于实验小鼠出现非目标突变受到干扰，”他们希望能找到一种HDR途径新方法完成有效，且更精确的编辑，
为了解决这一问题，研究人员尝试针对过去的果蝇胚胎基因组编辑实验改进 HDR/NHEJ 比例，他们通过遗传手段抑制了NHEJ途径中的一个分子：DNA连接酶IV，碰巧正好有这么一个小分子抑制剂，SCR7能抑制这种酶的作用（这种小分子在之后的实验中被证明能作为癌症治疗分子）。
Schimenti研究组在小鼠胚胎中改变了一个基因的两个碱基，结果证明加入SCR7能将HDR：NHEJ比率从之前的1：10调整为1：2.5，这一研究成果公布在今年的Genetics杂志上，标题为A Mouse Geneticist’s Practical Guide to CRISPR Applications。[]
如何操作：
只要在Cas9 和合成的DNA 被注入到你的单细胞受精卵之后，在培养基中添加 SCR7就可以了。一些其他的研究组，如范德堡大学的Douglas Mortlock也在尝试进行这一实验。Schimenti实验室常会在实验中加入这种物质，因为目前看来SCR7并不会造成什么伤害，不过“这种小分子确实会影响其它基因，所以还是需要进行对比实验，”他说。
注意事项：
培养基中加入了SCR7（50 μ M）的受精卵生存率更高，但是在two-cell阶段，SCR7 会影响细胞进入囊胚期，其原因尚不清楚。但Schimenti表示这应该不成问题，因为在那之前就可以将其转入到雌性小鼠中了。
成本：从Xcessbio公司可以买到SCR7，价格为129 美元/2 mg（当地价格）。
人体细胞中的可诱导CRISPR
研究者：纪念斯隆凯特琳癌症中心干细胞生物学中心的发育生物学家Danwei Huangfu
研究项目：利用人类胚胎干细胞了解胰腺发育过程中特殊基因的作用和相互影响 CRISPR/Cas工具的一大挑战就是将这一系统中的元件传输到细胞内，通常这是通过电穿孔完成，但是将 CRISPR/Cas系统插入到人类干细胞中的这一过程，效率非常低，Huangfu表示，要完成一个单一突变传送，需 要一个月的时间。
Huangfu的项目要求删除一个或多个基因的两个拷贝，这也就意味着多轮靶定，她需要一个效率更高的系统。
要解决这个问题，最困难的一步是将大体积的Cas9 基因传入到细胞内，为此Huangfu研究组构建了一种已经整 合了Cas9元件的细胞系：首先他们采用了一种相似的技术TALEN，这种技术与CRISPR技术的不同之处在于，前者采用的是DNA结合位点，后者才有的是导向RNAs（An iCRISPR platform for rapid， multiplexable， and inducible genome editing in human pluripotent stem cells）。[]
“通过TALENs，我们将 Cas9 整合到了人类干细胞上的一个非常特殊的位点，这一位点不易发生沉默效应。”
研究人员还设计了能在药物多西环素存在的条件下表达 Cas9 的细胞。这种方法被称为iCRISPR，研究人员能 利用iCRISPR在分化过程中不同时间点里打开基因组编辑。（注意不要将iCRISPR与CRISPRi弄混淆了，后者与RNAi相似，能可逆性的阻止转录）
iCRISPR技术能将CRISPR/Cas操作主要步骤缩减成一个：用导向RNA转染细胞，导向RNA要小得多，也更容易进 入细胞。“我们惊讶的发现（iCRISPR）作用非常好，”Huangfu说，利用这一技术，她的研究组在一个月的时 间里完成了12个基因的突变。
如何操作：
Huangfu研究组公布了这一技术的详细步骤（The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells），如果已经有了一些人类干细胞基因靶向的实验经验，研究人员可以从Addgene 公 司购买质粒，自己构建iCas9 表达的细胞。如果材料齐全，那么一到两个月时间就能构建出 iCas9 细胞，再用接下来的一两个月时间完成基因组编辑细胞系。 如果不想从头制作 iCas9 细胞，那么可以联系SKI Stem Cell Research Facility。[]
注意事项：
虽然Huangfu研究组目前还未发现明显的脱靶效应，但是这一研究组采用了两种措施来避免潜在的脱靶（类似 于RNAi实验）：恢复实验（rescue experiments，生物通译）和用两个不同的 CRISPRs 靶向相同基因。
成本：Addgene质粒成本为$65（当地价格），iCas9 细胞首次构建需要$600，SKI购买需要400美元。
新传送方式
研究者：哈佛大学化学与化学生物学教授David Liu
项目：在小鼠模型中寻找治疗遗传性耳聋的方法
基因组编辑蛋白需要进入靶向细胞核中完成任务，但是 CRISPR/Cas9和其它所有大分子一样，传递是一个主 要问题。
而且如果 CRISPR/Cas9 系统是作为DNA质粒传递进入的话，Cas9 核酸酶作用会增强，不仅会切断靶向基因， 而且还会影响其周围的基因，导致脱靶编辑。
为了解决这一问题，Liu等人模拟了科学家们将DNA和RNA一类的核酸传送至细胞中去的方式。这一系统依赖于 称作为阳离子脂质的正电荷分子，其能够结合负电荷核酸形成脂质体。脂质体一旦形成，其可通过至少两种方 式将内容物传递到细胞中。在某些情况下，脂质体有可能与细胞膜融合释放它的货物。此外，脂质体还可能与 核内体膜融合释放出内容物。
“我们有一个非常简单的想法，即将研究人员用来传送DNA和RNA的商业化阳离子脂质用于传送蛋白质。这次我 们没有采用超正电荷蛋白，而是利用了超负电荷蛋白，其类似于核酸处于高度的负电荷状态。利用阳离子脂质 来传送与高度负电荷分子结合的蛋白质，相比于采用正电荷蛋白质或肽来传送蛋白质其效力提高了近1000 倍，”Liu说。
最终实验证实了利用这一新系统来传送基因组编辑蛋白质，至少与传送编码基因组编辑蛋白的DNA所观察到的 最好结果一样高效。而且传送蛋白比传送DNA的基因组编辑特异性要高得多。
传送DNA之后，在长时间内难以控制编码蛋白的表达量。DNA传送与期望的基因组编辑结果之间总是无法一致。在基因组编辑中，其任务是修复一个或两个拷贝的基因。而在基因组编辑蛋白完成这一任务后，你会想让它消 失，因为在此之后它所做的就是不希望发生并有可能是有害的事情。
如何操作：
操作人员可以仔细阅读这篇论文的补充信息 (Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo）。Liu表示，“我们尽可能详细的描述了 细节内容，我们希望很多实验室都能从中获益。”这些补充信息也描述了研究组如何调整多个变量，优化Cas9 传递的过程，对于有经验的分子生物学家来说，实验过程也相对简单易于理解。[]
注意事项：
研究组还表示这一方法也可以传送其它大分子，如Cre重组酶和TALENs，Liu实验室正在尝试其它的蛋白。
构建自己的 Cas9 蛋白成本约为300 美元（当地价格）。而每个新的导向RNA 成本约 50 美元（包括人力和物力），另外还有转录和纯化试剂盒500 美元（当地价格）。
如何消除脱靶效应
研究者：佐治亚理工学院生物医学工程教授Gang Bao
研究项目：基因靶向治疗单基因疾病
对于导向RNA来说，比如20个碱基的长度就能很好的与其基因组中靶向序列进行匹配，但是这种长度也能与错配碱基结合，造成脱靶效应。
近期大量基于网站的分析工具都可以用于寻找脱靶序列，但是目前的运算法则会遗漏两种出现在导向RNA和结合DNA之间长度差异以外的非特异性结合。举例来说，即使RNA导向配对序列要比靶向DNA长一到两个碱基，这两者依然能配对结合，但是会产生一个“RNA凸起（RNA bulge，编者译）”。相反，如果DNA序列比导向RNA序列稍微长一点，就会产生一个“DNA凸起”。
事实上，去年Bao研究组就发现凸起变量的脱靶结合会导致非目标基因组编辑（CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences）。“对于所有这些研究，我们都十分担心特异性的问题，”Bao说。[]
为了能找到潜在可能的脱靶效应，Bao研究组研发了一种称为COSMID的工具，这种工具配合其它CRISPR工具可以帮助研究人员设计出一种最小化非特异性Cas9剪切的RNA。如果研究人员已经构建了导向RNA，那么这种工具还可以帮助他们发现基因组中潜在的脱靶位点。
如何操作：
在COSMID网站 （crispr.bme.gatech.edu） 上，研究人员可以从列表中挑选目标基因组，然后输入你的导向序列，以及筛选最佳设计的相关参数。或者也可以利用引物设计框来严重潜在的脱靶位点。
注意事项：
COSMID与其他 CRISPR 设计工具一样， 不仅会识别出潜在的脱靶位点，也会根据其相关度进行排序。“这种排序本身并不是那么精确，”Bao说，由于许多其它的因素也会影响概率分布，因此脱靶序列预测需要通过实验进行验证。
同时范德堡大学的Mortlock也表示还可以利用这一工具预测特异性项目的范围，比如说，如果你想要从一种细胞系中除去一种蛋白产物，那么就可能无法太关注另一个基因突变，反过来也是一样，如果实验目的是某种特殊表型相关的突变，那么就要检查一下脱靶的情况。（生物谷）
温馨提示：87%用户都在上阅读，扫描立刻下载! 天天精彩！
...（全文约6903字）
旗下网站： |
Copyright&2001- 版权所有 不得转载.