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结核杆菌的三种实验方法的应用评估
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摘要：目的 比较痰涂片法、荧光定量PCR法和结核抗体检测法对结核病的诊断意义。方法 选取2014年7月～10月在我院诊疗疑似或确诊患者172例，进行涂片抗酸染色、荧光（PCR）检测和采集血样进行结核抗体检测。结果 172例检样中，抗酸染色痰液标本阳性例只有20例阳性率为11.6%。荧光PCR法阳性率55例，阳性率31.2%，结核抗体阳性例为87例；阳性率为50.6%。结论 三种方法中，以结核抗体阳性率最高，荧光PCR法次之，抗酸染色法阳性率最低，如果三种方法联合运用，相互佐证，可提高准确性。 中国论文网 /1/view-7413738.htm 关键词：结核杆菌；检测方法 结核杆菌又称分枝杆菌，是引发结核病的病原菌，可能对全身的各大器官造成侵害，临床中以肺结核最为常见。结核杆菌细胞含有大量分枝菌酸，染色后能抵抗强脱色剂盐酸乙醇的脱色，故又称抗酸杆菌，结核杆菌是引起结核病的病原菌，可侵犯全身器官，但以肺结核为多见。结核病至今仍为重要的传染病，近年来，因艾滋病、吸毒等社会原因及免疫制剂的应用，其发病呈上升趋势。鉴定结核杆菌的方法有很多[1]。本研究应用痰涂片染色法、PCR-荧光法、结核分枝杆菌抗体检测，对172例标本同时进行比较和评价。 1资料与方法 1.1一般资料 收集自2014年7月～10月在我院诊疗疑似或确诊的患者标本172例。所有患者均通过痰涂片抗酸结核杆菌检验、胸部X线片、临床表现以及结核菌素试验等诊断为肺结核。涂片法和荧光PCR为痰标本。嘱患者留取晨痰2～5ml（结核患者需停抗结核药3d）。结核抗体检测则采静脉血2ml。 1.2方法 1.2.1涂片染色镜检 是临床常用的简易快速的检查方法：取痰或其他已外理好的标本0.1ml，于载玻片上均匀涂抹成2cm×2.5cm椭圆形范围，以自然干燥和火焰固定后，进行抗酸染色，采用珠海贝索生物技术有限公司的结核染色液。染色步骤：①石碳酸复红溶液染色20min；②5%盐酸酒精脱色3min；③亚甲基蓝溶液染色30S。 1.2.2 PCR-荧光法采用实时荧光定量PCR法 试剂：试剂盒为中山大学达安基因公司产品。 方法：①取患者咳出的深部痰，痰液中加入4倍体积4 %NaOH液化痰液，30 min后吸1.5 ml置EP内。②在金属浴内100℃（3～5 min）12000 r/min，弃上清液。③加入生理盐水约1.5 ml混匀振荡，离心弃上清液。④重复洗涤1次。⑤加入40 ml DNA提取液在金属浴100℃ 10 min。⑥12000 r/min离心5 min标本处理完毕。⑦离心取上清2 ul至PCR反应管内，反应管置定量PCR扩增仪内，按以下条件进行扩增：93℃ -2 min预变性，93℃ 45 s-55℃ 60S 10个循环，93℃ 30 s-55℃ 45S 30个循环。扩增过程中仪器实时检测荧光强度并分析增长曲线，根据Ct计算出样本中DNA含量（基因拷贝数/ml）。阳性判断标准为：增长曲线呈S型，最强荧光值增高20单位以上。 1.2.3结核分枝杆菌抗体检测（胶体金法） 结核分杆菌抗体检测：细菌在体内生长繁殖产生的代谢产物，刺激机体免疫系统产生特异性抗体，包括IgA、IgE、IgM、IgG，检测这些抗体可帮助诊断分枝杆菌感染。将结核分枝杆菌特异性膜蛋白抗原分离纯化，点样并固化在硝酸纤维膜上。膜上TB抗原捕获人血清样品中结核分枝杆菌抗体，被捕获的结核IgG抗体可用葡萄球菌A蛋白（SPA）能与IgG特异性结合），形成红色斑点，根据是否出现红色斑点即可判断阴、阳性结果从而判断是否存在结核分枝杆菌抗体。标本要求：必须使用新鲜的血清标本。血浆标本必须用玻璃剥离纤维蛋白，保证血清无混浊沉淀，以免吸入导致反应膜孔阻塞。试剂：上海奥普生物医药有限公司提供的标准操作说明进行。 1.3统计学分析 本研究中应用SPSS17.0的统计学软件对得到的数据资料进行分析处理，阳性结果采用百分比（%）的形式表现，差异比较采用卡方值检验，以P<0.05作为三种检测方法结果具有统计学意义的表现。 2结果 应用涂片染色镜检得到的阳性人数为20例，阳性率为11.6%；应用荧光PCR法得到的阳性人数为55例，阳性率为32.2%；应用胶体金法得到的阳性人数85例，阳性率达到50.6%。分析对比三组之间的结果差异较大，具有统计学意义（P<0.05）。 3讨论 对于肺结核的实验室诊断，痰涂片法是检测抗酸杆菌最普遍使用的方法，具有快速、简便、经济、特异性高，但阳性率低（10%左右）等特点。建立快速准确的结核病原菌鉴定方法对于疾病的早期确诊，发现、治疗十分重要结核分枝杆菌核酸检测（PCR-荧光法）可在1d内完成临床样品处理、核酸提取和荧光PCR检测全过程，具有反应快速、重复性好、灵敏度高等诸多优点。本文检测结果显示，PCR法是随着分子生物学发展而来的检测方式，又称之为聚合酶链反应技术，其中荧光PCR技术具有特异性强、灵敏度高的特点。同时由于是全封闭环境下的反应，不需要进行后处理，很好的避免样本受到污染，且由于操作便捷、规模化和自动化管理更加容易，具有非常广阔的应用前景。传统中认为TB很少存在于外周血液中，但是事实上淋巴组织与血管网都是细胞外液交换重要场所，而致病菌也会通过毛细血管壁进入到血液中，通过荧光PCR技术可以很好的检出，本组中仍然对患者痰液标本进行检测，与传统的涂片法相比较，两者有较好的一致性；在不选择病例的前提下，前者的阳性率比后者高3倍左右。而且定量PCR是在全封闭状态下实现PCR扩增和产物分析，完全杜绝了扩增产生污染而导致假阳性，结果真实可靠[2]我们认为对临床疑似结核病患者，可根据病情选取不同的检样送检、采用荧光定量PCR法检测。其结果可作为结核病的主要诊断依据指标和筛选指标。这样做的最大优势是可准确，快速的帮助临床医师确定诊断，提高诊断的准确率，缩短患者等确诊的时间并及时得到治疗[3]。 抗体检测是一种快速、简单、有较好的敏感性和特异性的结核病辅助手段，且阳性率较高，在未对样本进行选择的情况下，阳性率仍可达到50.6%。而且试剂和样品用量极少，无需仪器设备，简化了繁琐的常规操作过程，同时也减小了因操作引起的误差。该法简便、快速、适应单人份测定，尤其适于基层医院。但是灵敏度稍低，有一定的假阳性和假阴性：特异性稍差：结果判断带有主观性；缺乏有效的质控手段。其灵敏度和敏感性均有待提高[4，5]。 总之，三种方法联合运用，可弥补单独采用一种方法阳性率低的缺点，几种方法之间可相互佐证，从而使准确性得以提高。同时检测也可从不同方面满足临床需要，提高肺结核的诊断水平。 参考文献： [1]周珍文.分枝杆菌的实验室诊断[J].中华检验医学杂志，. [2]李素华，王欢，陈莉.荧光定量PCR检测TB-DNA在各类检样中的阳性率分析[J].西南国防医药，）：752～7533. [3]邹自英，朱冰.结核杆菌的细菌学、分子生物学和免疫生物学检测方法评价[J].四川医学，（5）. [4]张灵霞，庄玉辉，杨华卫.DNA探针杂交检测患者痰标本中结核杆菌研究[J].中国防痨杂志，）：127-129. [5]徐苗，罗永艾，黎友伦，等.重组结核分枝杆菌11000蛋白对结核分枝杆菌感染的鉴别作用[J].中华结核和呼吸杂志，）：762-765.编辑/孙杰
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【摘& 要】目的：探讨肺结核诊断中核酸扩增检测结核杆菌DNA的临床应用价值。方法：选取2013年5月~2015年5月收治于我院的114例肺结核患者作为研究对象，按照随机的原则将其分为观察组和对照组，每组各57例，收集两组患者清晨痰液，其中观察组采用核酸扩增荧光定量聚合酶链反应（PCR）进行检验，对照组采用涂片抗酸杆菌镜检进行检验，比较两组患者的检验结果。结果：观察组患者共检测出阳性52例，阳性率为91.23%；对照组共检测出阳性48例，阳性率为84.21%。观察组患者检测的阳性率、检测的特异性和敏感性均高于对照组，两组相比较P&0.05，差异具统计学意义。结论：肺结核的临床诊断采用荧光定量聚合酶链反应法可有效的提高检测的阳性率，更好的指导临床的治疗，具有重要的临床应用价值。
【关键词】肺结核；荧光定量聚合酶链反应；涂片；
&&&&&&& 肺结核是由结核分枝杆菌所引起的肺部慢性传染性疾病，该病的传染率较高，主要是由于排菌患者排出病菌引起感染，随着社会的发展，肺结核的发病率和死亡率不断升高，严重威胁人们的身体健康和生活质量[1]。肺结核早期的诊断对于治疗具有重要的意义，但是目前诊断肺结核的方法较多，而快速有效的方法却较少，因此有效的肺结核诊断方法至关重要。本文选取2013年5月~2015年5月收治于我院的114例肺结核患者作为研究对象，按照随机的原则将其分为观察组和对照组，分别采用核酸扩增荧光定量聚合酶链反应（PCR）和涂片抗酸杆菌镜检进行检验，效果显著，现将结果报告如下。
&&&&&&& 1& 资料和方法
&&&&&&& 1.1& 一般资料& 选取2013年5月~2015年5月收治于我院的114例肺结核患者作为研究对象，按照随机的原则将其分为观察组和对照组，所有患者均符合中华医学会结核病制定的肺结核诊断标准，并经胸部影像学检查、病理学检查得到确诊。其中观察组57例，男31例，女26例，年龄在20~78岁之间，平均年龄（59.73&8.86）岁；对照组57例，男30例，女27例，年龄在21岁~80岁之间，平均年龄（59.81&8.93）岁。两组患者在性别、年龄等一般资料方面无显著性差异（P&0.05），具有可比性。
&&&&&&& 1.2& 检测方法
&&&&&&& 1.2.1& 检测仪器& 采用美国应用生物系统中国公司生产的核酸扩增实时荧光检测系统ABI&& 7300以及配套的试剂盒，采用OLYMPUS生产的显微镜。
&&&&&&& 1.2.2& 标本采集& 采集两组患者清晨深咳痰液，观察组患者采用PCR诊断试剂盒进行标本的存放，对照组患者则选用无菌的载玻片进行标本的存放，并及时的将标本送入实验室进行检验。
&&&&&&& 1.2.3& 检测方法& 观察组患者采用PCR进行检测，先在痰液中加入4倍体积的浓度为4%的NaOH，摇匀, 并置于室温下放置30min左右，进行液化。液化完成后吸取1ml左右标本并放入离心管中，加入0.5ml浓度为4%的NaOH后放在离心机上进行离心，转速为15000r/min，时间控制在5min。去除上清液，再沉淀部分加入1ml的生理盐水进行混合，然后再放入离心机离心5min，完成后再重复洗涤一次，沉淀后直接加入50l DNA提取液混合均匀后,沸水浴10min后，转至4℃静置6-8小时以保证充分裂解。再次10000 r/min离心5min，去上清液 2l 做 PCR 反应，取单管单人份 PCR 反应管若干，直接加入处理后的样品2l，8 000r/min 离心数秒，按下列条件进行 PCR扩增；93s预变性，然后按93C60s，反应 10 个循环后，按 93C45s，做30个循环，反应终止，最后到 Reporter 窗口下记录仪自动分析计算出 Ct值，即为所测结果。对照组采用涂片抗酸杆菌镜检法进行检验，痰液收集并制成涂片标本后，按照检验的操作规程严格进行操作，并用改良齐-尼氏法抗酸染色、脱色、复染后进行显微镜检测，在显微镜的100个视野中如果发现3~6条即为阳性。
&&&&&&& 1.4& 统计学方法& 采用统计学软件SPSS19.0对本次研究的数据进行统计学分析，计量资料采用（ ）表示，采用t检验，计数资料采用X2检验，以P&0.05表示差异具有统计学意义。
&&&&&&& 2& 结果
&&&&&&& 2.1& 两组患者临床检测的结果& 观察组患者共检测出阳性52例，阳性率为91.23%；对照组共检测出阳性48例，阳性率为84.21%。观察组患者检测的阳性率高于对照组，两组相比较P&0.05，差异具统计学意义。如表1所示。
&&&&&&& 3& 讨论
&&&&&&& 肺结核是临床常见的慢性传染性疾病，其早期的诊断对于治疗有重要的意义，目前主要的诊断方法是细菌学诊断[2]。痰涂片抗酸染色是肺结核诊断的传统方法，虽然该方法简单、易操作，特异性高，但是部分肺结核患者的痰液会出现间歇排菌的情况，且存在大量的非开放性肺结核患者，这些因素会造成检测的准确性下降，因此敏感性较低[3]。
&&&&&&& 近年来，随着医学技术的不断发展，对结核病的研究逐渐转入到基因和分子的层面，而荧光定量聚合酶链反应（PCR）法是通过对病菌的DNA进行检测的新方法，其检测的速度快、特异性强、灵敏度高，尤其是对于痰液中病菌生长缓慢或者病菌难以培养结核杆菌的检测[4]。荧光定量PCR技术将核酸扩增、杂交与光谱技术有机的集合在一起，实现对结核病菌的封闭检测，避免扩增产物或者其他外界因素对检测结果造成的干扰，利用特异性指针实时的对标本进行检测，避免痰液间歇排菌的感染，能够有效的检测肺结核患者痰液的结核杆菌，检测的阳性率较高[5]。
&&&&&&& 本研究中，观察组患者共检测出阳性52例，阳性率为91.23%；对照组共检测出阳性48例，阳性率为84.21%。观察组患者检测的阳性率、检测的特异性和敏感性均高于对照组，两组相比较P&0.05，差异具统计学意义。
&&&&&&& 综上所述，肺结核的临床诊断采用荧光定量聚合酶链反应法可有效的提高检测的阳性率，更好的指导临床的治疗，具有重要的临床应用价值。同时在应用的过程中应该注意操作中的污染造成的假阳性，要尽量进行隔离操作，并使用一次性的用具，避免污染造成的假阳性，提高临床检测的准确率。
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结核/非结核分枝杆菌核酸快速检测方法临床应用价值
【摘要】：目的评价结核/非结核分枝杆菌核酸快速检测方法的临床应用价值。方法应用实时荧光PCR技术对420例标本进行临床试验研究,并与抗酸杆菌涂片和分枝杆菌培养方法对照比较。结果结核分枝杆菌核酸检测灵敏度为48.5%(其中菌阳标本灵敏度为95.8%,菌阴标本灵敏度为14.5%),特异度99.3%,阳性预测值为99.1%,阴性预测值为55.5%;临床试验388例痰标本中检测出1例非结核分枝杆菌核酸阳性,经测序确认,准确率100%;同时对32例非结核分枝杆菌临床分离株进行核酸检测,并经测序确认,准确率100%。结论应用实时荧光PCR技术,能实现在1支管内同时进行结核分枝杆菌/非结核分枝杆菌的核酸检测。该方法具有简单快速、特异性好污染性少的特点。可作为实验室辅助检测结核/非结核分枝杆菌核酸方法之一。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R52【正文快照】：
结核病是由结核分枝杆菌复合群引起的疾病;而非结核分枝杆菌则引起NTM病。由于结核病和NTM病两者在发病、临床表现、影像学、涂片和培养、结核菌素试验、病理学检查等方面均十分相似,临床上很难进行区分诊断,只能从标本中分离出分枝杆菌,作菌种鉴定,才能确诊。而菌种鉴定往往
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结核分支杆菌核酸检测为阴性是否患有肺结核？
状态：就诊前
（1）肺结核病人中约有70%痰检抗酸杆菌阴性。（2）结核感染者中的非结核病患者在使用激素的情况下有可能转变为活动性结核病人。（3）请上传胸部CT片和与结核相关检查（如结核菌素试验、结核抗体等）的结果。
疾病名称：肺部也有结核，背也疼&&
希望得到的帮助：我是住院还是一直吃药就行呢需不需要加药，或改治疗方案
病情描述：2012年患病，肺结核，吃药半年发现右侧淋巴结核，两月后破溃成脓，清理脓，伤口快长好有长了一个脖子左侧和右侧都有小的淋巴，然后喝中药两个月，有明显小以为好转停了中药，西药有吃了近一年，...
疾病名称：肺结核淋巴结核&&
希望得到的帮助：希望医生能让我去找您现场看看--
病情描述：我五六年前肺结核-当时住院期间起淋巴结核-出院后告诉我耐药--犹豫药物反应强烈没吃几个月药就不吃了--2013年又起淋巴结核-吃了一个月药肝损伤停药了治肝就没再吃结核药--今年又起淋巴结核--耐药...
疾病名称：肺结核&&
希望得到的帮助：想让医生帮忙看下我这个情况是不是肺结核
病情描述：男,20岁。2016 十一月七日因咳血去往医院
拍CT怀疑是继发性结核
给予两天消炎
然后服用抗结核药物治疗
十一月 十日出院
回往老家当地结核病中心治疗
医生说给予诊断性治疗一个月
疾病名称：空洞肺结核&&
希望得到的帮助：请医生给我一些治疗上的建议
病情描述：二个月前查出肺部小空洞，医生说是结核。现已抗结核二个月。
疾病名称：陈旧性肺结核&&
希望得到的帮助：帮我分析下我老公是不是低烧，要不要紧？
病情描述：产后发烧CT查出有肺结核，去看了好几个医院专家都诊断陈旧性结核，部分已经钙化。我老公前段时间染上肺炎，快好的时候传给我，经过正规肺炎治疗已经没有症状半个月了，这两天他突然午后低烧37.1...
疾病名称：肺结核&&
希望得到的帮助：想问下突然又想咳嗽问什么
病情描述：吃药两个月二十天！吃药十天好转！所有症状消失！最近两天有点想咳嗽
疾病名称：肺结核，胸膜炎，腹膜炎&&
希望得到的帮助：胸水不吸收怎么办，咳嗽会不会落下病根
病情描述：治疗两个多月，胸水右侧10mm,左侧包裹性25mm、23mm一直不吸收，刚开始治疗几天后不咳嗽了无痰，现在咳嗽加重，发烧，停用利福平后不怎么烧了
曾经治疗情况和效果：
腹部抽过水，没事了，胸腔没...
投诉类型：
投诉说明：（200个汉字以内）
雷建平大夫的信息
难复治结核病人反复发作的急重病人、呼吸系统疑难危重病人、结核性腹膜炎粘连性肠梗阻病人、抗结核药物各型...
雷建平，男，主任医师，教授，原副院长，1970年以来行医46年，从事肺内科（呼吸内科和结核内科）工作33年。...
结核病科可通话专家
全军结核病研究所
河北省胸科医院
长沙市中心医院
沈阳市胸科医院
河北省胸科医院
武汉市结核病防治所
好大夫在线电话咨询服务也谈结核分支杆菌核酸阳性的临床含义--《中华结核和呼吸杂志》2001年10期
也谈结核分支杆菌核酸阳性的临床含义
【摘要】：
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：R52【正文快照】：
依据在局限性肺结核患者外周血中高比例发现结核分支杆菌核酸阳性的事实 ,最近张天民教授[1] 提出了结核性亚临床菌血症概念 ,再次引起了人们对临床标本中结核分支杆菌核酸阳性的生物学和临床含义的关注。自引进聚合酶链反应 (ＰＣＲ)技术作为结核病细菌学分子诊断技术以来已
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