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定点突变时,怎样知道DPN1处理完全了?
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消化后的和消化前的做电泳,模板条带消失
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PCR定点突变应用实例
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（责任编辑：钊振国）关于定点突变(定点突变,突变,引物,突变位点) - DNA技术 - 生物秀
标题: 关于定点突变(定点突变,突变,引物,突变位点)
摘要: [关于定点突变(定点突变,突变,引物,突变位点)] 我正做定点突变，遇到了一个非常奇怪的现象，我的采用引物引入突变位点的，引物里就包含突变位点，但我测序回来，发现我引入的位点没有突变，很奇怪，是不是这段序列太保守的原因呢。我是用Pfu酶扩的，模版浓度也很低，怎么可能不突变呢？我已经测了两个菌了，都没有突变。怎么办？？？？？？？？ 关键词:[定点突变 突变 引物 突变位点 序列 位点 测序]……
我正做定点突变，遇到了一个非常奇怪的现象，我的采用引物引入突变位点的，引物里就包含突变位点，但我测序回来，发现我引入的位点没有突变，很奇怪，是不是这段序列太保守的原因呢。我是用Pfu酶扩的，模版浓度也很低，怎么可能不突变呢？我已经测了两个菌了，都没有突变。怎么办？？？？？？？？
回复1) 不幸没有挑到突变的菌落2）引物合成有问题，合成的时候没有突变引入，尽管你设计了3）其他原因还没有想出来回复我看了我的引物，没有问题的，在博亚合成的，也应该没有问题的，我就怕是序列保守性的问题，不知道有没有这个可能呢？回复呵呵，你既然选择了定点突变，并且是在引物中引入突变，干吗使用pfu高保真酶。还是看看pfu酶的介绍吧：“ Pfu DNA聚合酶(Pfu DNA Polymerase，Pfu)是从高温嗜热菌Pyrococcus furiosis分离出的高保真（High Fidelity）耐高温DNA聚合酶。Pfu酶能纠正DNA扩增（PCR）过程中产生的错误，而传统的Taq DNA 聚合酶(Taq DNA Polymerase，Taq)，Tth DNA聚合酶及它们的变体如AmpliTaq，KlenTaq等都不能。高温DNA聚合酶Vent、DeepVent、Tli、Pwo、Pfu、UlTma等都具有校正功能（Proof reading），但Pfu酶是迄今发现的所有高温DNA聚合酶中在扩增DNA时出错率（error rate）最低的。它比Taq及变体低近10倍，比Vent和Pwo低2-4倍。Pfu酶的超常纠错特性是由该酶本身的性质决定的， Pfu酶来源于高温嗜热菌Pyrococcus furiosis。分子量为90KD；PCR产物为平端，无3"端的单个dA；有3"?5"外切核酸酶活性（高保真）；无5"→3"外切核酸酶活性。”你是陷入矛盾之中了，又想错配又要高保真。假设你引入的突变在3"附近就不排除给切掉的可能性呀，呵呵，即使你使用pfu,其pcr引物中定点诱变的成功率至多在0.1－50％，还是想办法筛选一下，如果片断不长，换个普通的酶试试看看。或许更好呀。祝试验顺利回复建议使用Takara LA Taq,其效率优于其他同类产品,保真性能强,而且可以在产物3端加一个A,可直接克隆到T-Vector中.我就是用的这个,挑了一个克隆拿去测序,结果就是对的.回复换个公司合成引物试试，我现在博亚的工作很失望。回复呵呵，你既然选择了定点突变，并且是在引物中引入突变，干吗使用pfu高保真酶。还是看看pfu酶的介绍吧：“ Pfu DNA聚合酶(Pfu DNA Polymerase，Pfu)是从高温嗜热菌Pyrococcus furiosis分离出的高保真（High Fidelity）耐高温DNA聚合酶。Pfu酶能纠正DNA扩增（PCR）过程中产生的错误，而传统的Taq DNA 聚合酶(Taq DNA Polymerase，Taq)，Tth DNA聚合酶及它们的变体如AmpliTaq，KlenTaq等都不能。高温DNA聚合酶Vent、DeepVent、Tli、Pwo、Pfu、UlTma等都具有校正功能（Proof reading），但Pfu酶是迄今发现的所有高温DNA聚合酶中在扩增DNA时出错率（error rate）最低的。它比Taq及变体低近10倍，比Vent和Pwo低2-4倍。Pfu酶的超常纠错特性是由该酶本身的性质决定的， Pfu酶来源于高温嗜热菌Pyrococcus furiosis。分子量为90KD；PCR产物为平端，无3"端的单个dA；有3"?5"外切核酸酶活性（高保真）；无5"→3"外切核酸酶活性。”你是陷入矛盾之中了，又想错配又要高保真。假设你引入的突变在3"附近就不排除给切掉的可能性呀，呵呵，即使你使用pfu,其pcr引物中定点诱变的成功率至多在0.1－50％，还是想办法筛选一下，如果片断不长，换个普通的酶试试看看。或许更好呀。祝试验顺利我觉得分析的不对呀回复不知道你的模版用的是cdna还是质粒，如果是质粒的话，那么扩增完后是否是跑胶回收的？有没有可能你挑出的菌中还是你原来的质粒？回复用invitrogene Pfuturbo! 此酶做定点突变非常好用，我用过六次都没问题的回复我认为用PFU本身没有问题我就用PFU做OVERLAP PCR，做单点突变，结果是成功的不如详细讲讲你的PCR以及其后的设计过程，尤其是引物的设计，可能问题出在这里边回复呵呵，你既然选择了定点突变，并且是在引物中引入突变，干吗使用pfu高保真酶。还是看看pfu酶的介绍吧：“ Pfu DNA聚合酶(Pfu DNA Polymerase，Pfu)是从高温嗜热菌Pyrococcus furiosis分离出的高保真（High Fidelity）耐高温DNA聚合酶。。。。。。。。。。。。。。呵呵，我有话说！关于这个问题我很有兴趣。首先，楼主是在引物中引入了突变，那么在第一轮扩增的时候引物和模板结合，pfu酶并没有参与，只是在引物的3"端继续延伸的时候参与其中。也就是说，在这一步之后，pfu才发挥了高保真性能。在后来的扩增中，理论上是以扩增的产物为模板继续扩增（当然也有以原始模板为模板的扩增，但是原始模板没有竞争性！），并进行指数增长。所以，pfu的高保真与突变的引入无关。欢迎继续讨论！回复没想到这个帖子沉了！请高手出来讨论一下关于点突变与pfu的问题。我和实验室几个人讨论的结果都不一致。回复我们是比较保守的方法，先要性质与原来的有所差异是变强了或者变弱了，总之是先做20来个转化子，找性质有差异的再送测序，没有问题！回复可以肯定的一点是，我们也是用的Takara的pfu.回复如果是利用引物搭桥的方法来做点突变的，最好中间的两条引物中都有突变位点。引物是固定的，Pfu无法把它更改掉。有可能你在替换原有序列是没有做干净引起的。最好用空载体进行克隆。成功可能性大。回复我用的是USE方法对质粒做点突变，即删除单个限制酶切位点方法。很久了都不成功。体外突变的产物未经酶切、直接转化BMH71-18菌，转化效率很低，板子上只有几个菌落，而转化的阳性对照表明细菌感受态是可以的；我还没乙醇抽提再试一下转化。分子克隆第三版13章信息栏里说，把删除的酶切位点设计在BamH1、Bgl2 ，由于未知的原因会突变不成功，谁有经验？大家做突变时，用PCR介导的方法要用几天？P出来的杂带多吗？十分感谢：）回复呵呵，我有话说！关于这个问题我很有兴趣。首先，楼主是在引物中引入了突变，那么在第一轮扩增的时候引物和模板结合，pfu酶并没有参与，只是在引物的3"端继续延伸的时候参与其中。也就是说，在这一步之后，pfu才发挥了高保真性能。在后来的扩增中，理论上是以扩增的产物为模板继续扩增（当然也有以原始模板为模板的扩增，但是原始模板没有竞争性！），并进行指数增长。所以，pfu的高保真与突变的引入无关。欢迎继续讨论！我也是这个意思。虽然我没有做过突变。但是觉得说Pfu会消除掉有意设计的突变似乎不合逻辑回复不知道你是用什么方法做的定点突变，详细一点回更有利于大家提建议回复其pcr引物中定点诱变的成功率至多在0.1－50％.pfu所具有的高保真性，在PCR引物中引入的定点突变，好像起不到保证其诱变的作用，只能在后续的合成中保证其高保真性。在体内的DNA合成中，如果存在硷基的错配，外切酶活性仍然可以把其切除。我认为如果在第一轮不能引入突变就很麻烦，再有PFU不会单纯的结合在引物以后的序列，必然会和部分引物结合，PFU对于其结合和合成的硷基还是有识别作用的，其有3‘－5’的外切酶活性保证了其高保真活性，分子学试验是逐渐探索的过程。欢迎讨论和高手总结。回复与luster888 站友商榷: 一般定点突变的引物设计都不会把突变放在3"端,而通常都是放在整个引物序列的中间.在突变位点的两端都要有至少10个的保护碱基,来保证整个引物与模版匹配的正确性。另,突变并不是由于酶的错配而引入的,而是由于引物设计和模版的差异引入的.所以,如果要保证除了你要引入突变位点,其他位点都没有错误的话，必须要用高保真的酶.关于irenedeng站友的问题: 我不知道你是用哪种方法做的定点突变，不过如果有OVERLAP PCR的话，很可能是由于模板质量不高引起的.做这种实验至少要保证模版中的超螺旋含量要超过80%,不然如果你作为模版的质粒有很多随片的话，他们都会成为引物，和模版结合，PCR出来的产物就有许多都是不带突变的了. 一点建议,供你参考。希望实验顺利。回复我刚做完定点突变,用了2个月的时间,体会是细心的操作和运气的结合.我先后做了三次,每次的引物,PFU酶,和实验方案都没有改变。我觉得PFU与突变没有关系，因为PFU的纠错能力体现在3‘末端，而引物中设计的突变位点一般在中间，远离3’端。每次的PCR产物跑胶回收，平端连到用SMAL1酶切的PUC中，转化DH5A中，有的用DPN1酶切PCR产物，去除含未突变的模板，保留扩增的PCR产物。之所以说是运气的问题，因为前两次送3个测序显示未成功，而最后一次送的3个全部突变成功！回复／。。。。。。。因为PFU的纠错能力体现在3‘末端，而引物中设计的突变位点一般在中间，远离3’端。。。。。。。。。做过PCR的人都不会把突变设计到引物的3‘端，太。。。。。。。了回复对于此问题我可能没有深入的考虑，但是即使用PFU，其引物定点引入突变的成功率，也是达不到100%的。回复我认为你应多选几个克隆，一般突变效率都不会太高回复下面是TaKaRa MutanBEST Kit定点突变试剂盒的说明（还有附图）。本制品是应用PCR技术进行定点变异操作的试剂盒。其原理是利用导入变异点的引物进行PCR反应后，对PCR产物进行末端平滑及5"磷酸(P)化处理，再用高效连接试剂Ligation Solution I 进行自身连接（环化反应)，然后转化、克隆、提取变异体DNA。请问，PCR定点突变一般采用的都是末端不加A的聚合酶吧？合成的引物也是5‘端含有P，既然这样，为什么在PCR后要末端平滑和加P呢？如果是为了防止在PCR反应中有些片段延伸不够完全而造成实际上的粘末端，以及温度切换造成少量引物末端p丢失，那么是不是理论上末端平滑及5"磷酸(P)化省略掉，也是可以获得突变体的？谢谢 回复另外，请问，不用试剂盒，自己用Pfu做点突变，好不好做？需要注意那些关键点？回复现在发布重要消息：
我们博雅公司在12月3号已经成为美国invitrogene生物公司的一个成员了，所以以后，博雅就是invitrogene，希望以后多多合作！回复请问，PCR定点突变一般采用的都是末端不加A的聚合酶吧？合成的引物也是5‘端含有P，既然这样，为什么在PCR后要末端平滑和加P呢？如果是为了防止在PCR反应中有些片段延伸不够完全而造成实际上的粘末端，以及温度切换造成少量引物末端p丢失，那么是不是理论上末端平滑及5"磷酸(P)化省略掉，也是可以获得突变体的？1) 像这种突变的时候PCR绕着在体转一圈的突变方式，由于序列比较长一定要高保真的，一般末端是没有A的。否则会在扩增的过程中产生很多非特异的突变！2)但是以重叠延伸PCR的方式进行突变的时候，由于扩增的序列相对比较短，可以采用一般的Taq（当然也要保证所扩增的这段距离内要保真了），也就是末端加A的。 回复3)一般引物合成好像没有5‘端磷酸化的。合成完了以后5’也是OH。4）我认为TaKaRa的这种突变策略之所以要平滑化，可能是它可以在任何限制性位点不方便的地方进行突变。而正是限制性位点不方便，形成平末端后就可以连接。5）如果载体有合适的酶切位点当然可以在引物的末端引入相应的酶切位点，这样在引入预定设计的突变的同时，也不会引入不必要的碱基。既然平滑化了，那么磷酸化以后后续的连接当然很简单了。回复我刚做完定点突变,没出现你这样的问题.我想你的问题有可能是引物合成的有问题吧.在合成突变引物时,突变位点不能太靠近引物的5‘端或3‘端,突变位点最好在引物的中间.另外重复测序可以送不同的公司,有时测序也会出错.回复我前一段时间在博雅合成的一对突变引物,就有一条在我突变的基础上有多出一个突变了的碱基,所以要他们给从新合成的.我不知道楼主是怎么看引物合成是否正确的.只有测徐了才知道呀.overlap法,做点突变引物可以把突变点设在中间也可以在5"端,我都时过,3"短还没做过,我觉得可能会影响到引物和膜版的结合,影响延伸.pfu不会影响突变的,因为突变点开始的时候在引物上,与pfu没关系.为什么突变效率会小于1,我因为可以等于1呀?pcr产物要胶回收,就可以除去质粒膜版的干扰.
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