求助rna pull down assay的实验步骤

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-04-01 05:54 标签： rna pull down试剂盒
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【求助】关于pull down 求救
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qiubiaodsg
我最近在做pull down 实验，先用western blot 标记的是被拉的蛋白，结果片子上是一片白板，连作为对照的input（只有被拉的蛋白）都没曝出来，请各位高手知道一下吧，谢谢。本人western 没有问题。
dianaofyezi
如果连对照都没有出来，就首先应该考虑程序流程的问题，无论是否发生了pull down，起码对照应该成立不是么？然后再考虑的是相互作用的蛋白的问题。
if the input is not good, there are several reasons:
1.for the western procedure, check if primary antibodies, secondary antibodies are good, make all buffer and solution freshly and try
2.for the pull down assay, what kind of beads you are using, maybe there isn't good binding for your beads and target protein, if you are using protein A/G agrose, check if the pull down antibodies is ok.
3. make sure the cell lysate you use has enough total protein and relatively high expression of your target protein
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wudihero007
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今日去我院某教授跟门诊，有一位中年女性患者因“反复失眠20余年”来就诊。在此之前我并不知道真正意义上的熊猫眼，不过今日可真的见识到了，特拍了一张照片：
刘某，女，32岁，第一次怀孕，停经已12周。该患者停经的第九周开始出现恶心呕吐，开始时呕吐尚不多，3-5次每天。后来呕吐逐渐加重，7-8次每天，呕不能食，呕出食物及黄胆水。
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lncRNA研究策略之RNA Pull-down实验问答
摘要：长链非编码是一类不编码蛋白的分子长度在以上研究表明具有保守的二级结构可以与蛋白和相互作用参与多种生物学过程的调控随着高通量测序技术的发展越来越多的被注释但是绝大多数的的功能仍然不清楚因此的研究是一片非常广阔的未知领域具有极大的科研价值和意义其中
长链非编码RNA(longnoncodingRNA，lncRNA)是一类不编码蛋白的RNA分子，长度在200bp以上；研究表明，lncRNA具有保守的二级结构，可以与蛋白、DNA和RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控。随着高通量测序技术的发展，越来越多的lncRNA被注释，但是绝大多数的lncRNA的功能仍然不清楚，因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的科研价值和意义。其中RNAPull-down技术为lncRNA生物学功能的验证起到了至关重要的作用。 RNAPull-down结合了体外转录与生物素标记、质谱技术，是研究非编码RNA与蛋白质相互作用的一大利器。由于实验程序较多、RNA的易降解性，加上一些不可预知的变量，因此实验存在一些难度，常常导致实验的失败。对于试验中常常出现的棘手的问题，金开瑞经过实践，总结了一套行之有效的应对方策，现在就和我们一起来看看吧！
1、RNAPull-down拉下蛋白PAGE电泳银染条带颜色浅且模糊？ ①选取的组织或细胞样品其中互作蛋白表达量很低； ②体外转录得到的RNA降解或者不是全长； ③Pull-down实验孵育时间不长。 ④其他 2、PAGE电泳银染背景深？ ①样品杂蛋白太多； ②银染显色时间过长。 ④其他 3、RNAPull-down拉下蛋白银染后看不到互作蛋白： ①选取的RNA序列不对； ②样品中没有表达互作的蛋白质。 ③互作蛋白浓度低，银染图肉眼观察不到差异条带。 ④其他 更多建议： ①lncRNA序列前期验证要完善； ②选择相应蛋白质表达量较高的组织或细胞样品； ③体外转录选择转录质量高的试剂盒，操作过程避免Rnase的污染； ④保证RNAPull-down实验中探针标记以及探针与蛋白的结合充分进行（依据体外转录RNA的量，样品裂解液蛋白浓度）； ⑤尽可能多将洗脱的蛋白电泳（同时可以避免显色时间过长） 好啦，这次就和大家分享这么多啦，如果您在RNAPull-down实验中遇到困惑，可以随时与我们取得联系哦，我们将及时帮您解决！ 最后，祝大家实验顺利！生活愉快！
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谁能告诉我PULL down的详细步骤？
谁能告诉我PULL down的详细步骤？
原作者好像是 彭永德&&曲建
谢谢分享！
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