蛋白质组学
&蛋白质非标记定量技术（label-free）是通过液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，无需使用昂贵的稳定同位素标签做内部标准，只需分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，比较不同样品中相应肽段的信号强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。与iTRAQ技术相比，Label-free的技术优势就在于蛋白质不需要昂贵的同位素标签进行标记，所需样品总量少，耗费低。Label-free技术可用于高通量的biaomarker筛选、蛋白质相互作用、蛋白质翻译后修饰等方面的定量比较分析。
无需标记，操作简单；
所需样本量少，可对微量样本进行分析，不受样本数量限制；
可重复性高，对实验操作稳定性、重复性要求高，至少做三次技术重复或生物重复；
深度覆盖检测动态范围可以达到 8 个数量级以上，提高了低丰度蛋白质的检测效率；
动物组织≥1 mg, 植物组织≥10 mg，细胞≥106个、体液（具体样品信息请咨询我司技术人员）
蛋白提取物：≥300 μg
蛋白质组学分析揭示了辣椒细胞质雄性不育中线粒体的强烈参与&&
文章题目：Proteomic analysis reveals strong mitochondrial involvement in cytoplasmic male sterility of pepper (Capsicum annuum L.)
发表杂志：Journal of Proteomics
见刊时间：2017.08
样本与实验方法
样本：辣椒花蕾
实验方法：Label free
这是一篇很典型的应用label-free蛋白质组学方法研究花粉发育和雄性不育相关分子机制，共定性定量了324个差异表达蛋白，组织学实验表明花粉中绒毡层细胞的程序化凋亡是雄性不育的最重要的原因。蛋白质组学的生物信息分析结果表明参与花粉外壁形成、丙酮酸代谢、三羧酸循环、线粒体的电子传输及氧化应激反应都可能和细胞败育有关。我们的研究为研究辣椒育种提供了研究的基础。
直肠癌蛋白质组学分型
通过分析95例大肠蛋白质组，一共鉴定到 7526个蛋白质（FDR&2.64%）。基于鉴定到的蛋白质相对定量信息，将本来通过基因型分为3个型的95例样品，更加细分为5个亚型，其中一个具有不良的预后，这样更加有利于精准医疗的参考。
Zhang, B., et al. (2014) Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer. Nature 513, 382-387.
更新中……
Q1：Label Free有哪些技术特点？&
A：对液相色谱串联质谱的稳定性和重复性要求较高；无需昂贵的同位素标签作内部标准，实验耗费低；对样本的操作也最少，从而使其最接近原始状态，并且不受样品条件的限制，克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷。
Q2：iTRAQ和Label Free各有哪些优缺点？&
A：（1）iTRAQ优点：1. 不受样品来源制约，几乎可对各种样品进行标记；2.通量高，可同时标记 2-8 个样本；3.可信度高，标记试剂的报告离子的相对分子质量较低，质谱在低分子量区的定性和定量较为准确；4.可进行翻译后修饰分析。
&&&&&& 缺点：1.iTRAQ几乎可以与样品中的所有蛋白质相结合，容易受到污染蛋白的影响；2.试剂昂贵，操作繁琐。
&&&&&&&&&&&& （2）Lable Free优点：1.样品需求量低；2.操作简便，不受样品的来源与通道数目的限制；3.单次实验可鉴定和定量更多的蛋白质。
&&&&&& 缺点：1.在提取离子信号强度之前，需要对原始数据进行预处理，比较复杂；2. 准确性低，依赖质谱稳定性，在蛋白丰度差距较大时，无标的区分效率较好。全国免费热线:
蛋白质组学
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Label-free
&非标记定量蛋白质组学(Label-free)技术是指不对样本进行标记，样本酶解产物直接进行质谱大规模鉴定，根据峰面积或肽段总次数对肽段或蛋白进行相对定量分析的技术，该技术无需昂贵的同位素标签做内标，提高了低丰度蛋白质的检测效率和蛋白质定量的准确性，广受科研工作者的推崇。
Maxquant软件进行非标记定量的原理
技术路线和方法：
该服务方案是从蛋白的提取到结果分析一整套全面解决方案，客户只需要提供足够的样本就可以及时获得科学结果。我们也可以针对客户的实际情况量身定做方案，客户也可以选取其中几项服务。我们将竭诚为客户解决问题。
首先您跟我们沟通您的实验目的与实验设计，或者让我们专业的技术人员根据您的实验目的帮助您设计实验。然后提供样品（可以是组织，细胞或血液），我们为您完成所有的实验操作，并提供完整的实验报告和数据分析报告。特别的，在项目结束后6个月的时间内我们提供一次免费报告修回和7×24h的问题答疑服务。根据您的需要，我们为您推荐最合适的实验方案。
蛋白质组学平台
Nano Aquity UPLC system+Q Exactive Mass spectrometer
Waters + Thermo
Triple TOF(TM)5600
血清样品量要求：500ul/例，一定避免反复冻融；
血液样品量要求：5ml以上；
尿液样品量要求：50ml以上；
其他体液（唾液，羊水，脑脊液等）：5ml以上，保证不能溶血。
动物组织样品量要求：湿重不少于100mg；
植物组织和菌体样品量要求：湿重不少于2g。
样品量要求：5*106。
样品量要求：浓度不低于1mg/ml，蛋白量不少于500ug。
注意：如果送样为溶液， 则溶液中一般不要有SDS、CHAPS、Triton X-100、NP40及吐温 20、40等系列的去污剂。盐浓度小于50mM。
其他种类的样品在收集之前请联系公司销售工程师。
基本数据分析
Part01：数据预处理
Part02：差异蛋白筛选
Part03：层次聚类分析
Part04：PCA分析
Part05：差异蛋白GO分类
Part06：差异蛋白pathway分析
Part07：差异蛋白互作网络构建
高级数据分析
Part8：多组学数据关联分析（具备多组学数据）当前位置 >
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> 蛋白质非标记定量技术（label free）
生物研发服务
蛋白质定量技术
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参考报价：
&& 蛋白质非标记定量技术（label free），通过液质联用技术对蛋白质肽段进行质谱分析，无需昂贵的同位&素标签做内部标准，只需分析大规模鉴定蛋白时所产生的质谱数据, 比较不同样本上相应肽段的强度，从而对肽段对应的蛋白质进行相对定量。
1、对液相色谱串联质谱的稳定性和重复性要求较高
2、无需昂贵的同位素标签做内部标准，实验耗费低
3、对样本的操作也最少，从而使其最接近原始状态，并且不受样品条件的限制，克服了标记定量技术在对多个样本进行定量方面的缺陷。
& &&上海敏芯信息科技有限公司成立于2006年10月，是国内知名的生物信息学服务提供商。随着业务扩展，公司已经发展成为国内第一家专业提供系统生物学服务的高科技企业，提供包括基因组学、转录组学、蛋白质组学、代谢组学相关的实验设计、实验检测、数据分析、结果验证及论文修改的全面解决方案。公司已获得国家及上海市中小企业创新基金、上海市科技创新行动计划、上海市大学生创业基金、上海市专利试点企业、上海市技术成果转化认证、上海市杨浦区人才资助资金等多项国家及省部级奖励。
具体业务包括：
-基因芯片：表达谱芯片、miRNA芯片、SNP芯片、甲基化芯片、Exon芯片、Tilling芯片、lncRNA芯片等实验及数据分析
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-蛋白质组学：蛋白质芯片（SELDI）、细胞因子芯片、ITRAQ、Shotgun Proteomics、DIGE-2D等
-&代谢组学：液质联用（LC-MS）、气质联用（GC-MS）及核磁共振（NMR）的实验及数据分析
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【蛋白研究系列专题】-5|用实例说话，帮您读懂定量蛋白质组学
上期分享的蛋白组学内容，是不是有些小伙伴还绕在云里雾里呀？这次，小编用实例说话，帮您梳理清楚。
Label-free定量
Label-free定量，顾名思义就是不需要对比较样本做特定标记处理，只需要比较特定肽段/蛋白在不同样品间的色谱质谱响应信号便可得到样品间蛋白表达量的变化，通常用于分析大规模蛋白鉴定和定量时所产生的质谱数据。
Label-free技术又可分为基于谱图数（Spectra Count，简称SC）和基于肽段母离子强度（或色谱离子流的峰面积即XIC）两种方法，后者更准确，使用更广泛。
无需标记，操作简单；
不受比较样品数限制；
对实验操作稳定性、重复性要求高；
准确性较标记定量差；
要求至少做三次技术重复或生物重复。
适合大样本量的定量比较；
对无法用标记定量实现的实验设计，易用label-free技术；
题目：Label-free global serum proteomic profiling reveals novel celecoxib-modulated proteins in familial adenomatous polyposis patients（利用Label-free定量技术进行家族性腺瘤息肉病患者血清的全蛋白质组分析，寻找Celecoxib调控蛋白）
期刊：Cancer genomics proteomics
主要技术：Label-free定量
文章摘要：Celecoxib是一种环氧合酶选择性抑制剂，能够对患有预防家族性腺瘤性息肉病（FAP)和散发性大肠癌的病人进行防治。为了识别其具体的作用机制，本文采用多维色谱分离方法结合电喷雾串联质谱，使用Label-free定量技术，比较经Celecoxib处理前、后血清样品的蛋白质组表达量差异。发现了83个可能为Celecoxib响应的表达量显著差异蛋白。通过Western blotting方法，在FAP病人和结肠直肠癌细胞系中进一步确认了一些Celecoxib调控蛋白，为进一步进行Celecoxib作用机制的大规模临床试验奠定了基础。
文献来源：
iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation，同重同位素标签标记的相对和绝对定量)技术也是目前定量蛋白质组学中应用最广泛的技术。
iTRAQ试剂分为报告基团、平衡基团和肽反应基团。报告基团共有8种（113、114、115、116、117、118、119、121 Da)。肽反应基团能与肽链N端及赖氨酸侧链发生共价链接，从而将报告基团和平衡基团标记在肽段上；平衡部分质量分别为192~184，与报告部分相加正好为305。
在一级质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。在二级质谱中，iTRAQ试剂中的平衡基团发生中性丢失，信号离子表现为不同质荷比(113~121) 的峰，根据波峰的高度及面积，可以得到同一蛋白在不同样本中的表达差异；同时，肽段的MS/MS结果结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类。
灵敏度高：可检测出较低丰度蛋白，胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等；
分离能力强：可分离出酸/碱性蛋白，小于10K或大于200K的蛋白、难溶性蛋白；
高通量：可同时对8个样本进行分析，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析；
结果可靠准确：定性与定量同步进行，同时得出鉴定和定量结果。
自动化程度高：液质连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。
适用于任何类型的样本；
一次最多能标记8个样本；
题目：A tumour suppressor network relying on the polyamine-hypusine axis（一种基于多胺Hypusine轴（Polyamine-hypusine axis）的新型肿瘤抑制网络）
期刊：Nature
主要技术：iTRAQ定量
文章摘要：为寻找淋巴瘤的抑癌基因，首先通过筛选短发夹文库的方法，识别出一些抑制后会引起小鼠淋巴瘤模型肿瘤扩增的基因。然后采用定量技术对两个有意义的淋巴瘤抑癌基因&&和的表达调控进行研究，发现这两个基因都与是一种独特的氨基酸，由一种高保守途径产生的多胺代谢产物相关。通过进一步的二次筛选，确定了多胺轴的新型抑癌基因网络，这一网络能调控细胞凋亡。
文献来源：
SILAC（Stable Isotope Labeling Strategies,稳定同位素标记技术）为全面、系统地定性和定量分析复杂哺乳动物细胞蛋白质组提供了有效的方案。
SILAC的基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(中性或重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经5-6个倍增周期后，稳定同位素标记的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定，根据一级质谱图中两个同位素型肽段的面积比较进行相对定量，属于体内代谢标记法。
高效性：SILAC是体内标记技术，标记效率可高达100%；
定量精确，线性范围广，降低由于样品制备、实验操作和仪器设备造成的实验误差，定量重复性好；
体内代谢标记与SDS-PAGE或色谱分离技术相结合，兼容疏水性蛋白和偏碱性蛋白，不受蛋白性质限制；
由于该技术属于体内标记，标记效果稳定，其标记效率不受裂解液的影响，不仅适合于进行全细胞蛋白的分析，还适合于膜蛋白的鉴定和定量；
与化学标记相比，SILAC方法蛋白需要量明显减少，通常每个样品只需要几十微克的蛋白量；
活体标记，更接近样品真实状态；
相容性：可以对多种在DMEM或RPMI 1640培养基中能够培养的细胞或细菌中表达的蛋白进行标记。
只适用于活体培养的细胞，对于生物医学研究中常用的组织样品、体液样品等无法分析。
题目：Proteome-wide Mapping of Cholesterol-Interacting Proteins in Mammalian Cells（采用甾醇探针结合SILAC定量技术在哺乳动物细胞中分析胆固醇-蛋白质相互作用）
期刊：Nat Methods
主要技术：SILAC定量
文章摘要：胆固醇是细胞膜的重要结构成分，也是前体的信号分子，在很大程度上通过与蛋白质的特异性相互作用调控参与发挥其作用。本文采用可点击的光敏甾醇探针结合蛋白质组定量技术直接在活体细胞中全面解析了胆固醇蛋白相互作用。最终确定了超过个胆固醇结合蛋白，包括受体、通道蛋白和涉及许多已建立和之前未报告相互作用的酶。新发现的蛋白质相互作用中最突出的是调节糖、甘油脂和胆固醇本身以及参与囊泡运输和蛋白质糖基化和降解蛋白质的酶。这些蛋白指向关键节点的生化途径，说明甾醇浓度和其他代谢物的控制可能和蛋白定位以及修饰高度相关。
文献来源：
SWATH（Sequential Window Acquisition of all Theoretical Mass Spectra）是瑞士苏黎世联邦理工学院的Ruedi Aebersold 博士及其团队与AB-SCIEX于2012年联合推出的一项全新的质谱采集模式技术，是 MS/MSALL技术的一种扩展。它将扫描范围划分为以25 Dalton为间隔的一系列区间，通过超高速扫描来获得扫描范围内全部离子的所有碎片信息。
灵敏度高：SWATH技术继承了MRM的数据采集模式，结合高分辨率的AB sciex Triple TOF-plus，具有与MRM相当的灵敏度；
可重现性高：重复样品间的定量相关性可达0.99以上；
线性动态范围广：定量范围可跨越4个数量级；
通量大：一次实验可检测到2000种以上蛋白并定量。
最好检测细菌等复杂度较低的样品；
可以和MRM技术联合使用发现生物标志物；
可以和TAP技术联合使用鉴定相互作用蛋白。
题目：SWATH-and iTRAQ-based quantitative proteomic analyses reveal an overexpression and biological relevance of CD109 in advanced NSCLC (利用SWATH和iTRAQ定量技术揭示CD109在晚期非小细胞肺癌的过表达和生物相关性)
期刊：Journal of proteomics
主要技术：SWATH、iTRAQ
文章摘要：文章采用和定量技术，对癌细胞高转移和低转移非小细胞肺癌细胞系中蛋白的表达量变化（分别与正常状态比较）进行了分析。分别在细胞系分泌蛋白组和非小细胞肺癌血清中找到个和个存在显著差异的蛋白。研究者发现，在这些差异蛋白中，在高度转移的细胞系分泌蛋白组和癌症晚期患者组都有较高的表达量，检测也得到相同的结论。另外，和正常肺细胞比较，在肺癌细胞中也高度表达。研究者还发现，敲出蛋白会影响细胞的生物功能，如抑制细胞生长、影响细胞循坏阶段等。这些现象表明，在的进程中扮演着重要角色，很有可能是肺癌发病一个关键的生物标志物。
文献来源：Zhang F, Lin H, Gu A, Li J, Liu L, Yu T, Cui Y, Deng W, Yan M, Li J et al: SWATH-and iTRAQ-based quantitative proteomic analyses reveal an overexpression and biological relevance of CD109 in advanced NSCLC. Journal of proteomics -136
小编提醒：更多精彩内容，下期不见不散～～～
相关自主发布如何选择iTRAQ或者Label free
大家在选择iTRAQ和Label free做蛋白组时候，都会考虑如何选择，是iTRAQ还是Label free。他们有什么区别，我该如何选择。
同位素标记和非标记技术比较：
Non label free
Label free
样本标记同位素
样本非标记
样本量限制，ICAT(2), iTRAQ(8)等
样本无限制
在大样本过程中，难于跟踪蛋白丰度
易跟踪蛋白丰度
多数肽段难于识别
能够识别大多数肽段
难于识别和定量低丰度蛋白
能够鉴别低丰度肽段
需提前进行二级质谱蛋白鉴定
可以鉴定差异后再进行二级质谱蛋白鉴定
实验重现性高
实验重现性低
就以上信息，可能仍旧不能判断用哪种技术更能适合自己的实验。
以下通过一些文献分析来研究哪个技术更好。
在革兰氏阳性菌methylocella silvestris中同时用1D-PAGE, iTRAQ和Label free技术研究了蛋白组。
从以上结果可以看出，Label-free相比iTRAQ核Gel-based方法能够检测到更多的蛋白。
从以上结果，可以看出，Label free相比于其他两种方法，检测速度更快，分析速度更快，需要的蛋白量更少，同时检测蛋白和蛋白的覆盖率更高。
美国圣路易斯社区大学丹佛植物科学中心的同时用iTRAQ和Label free研究了莱茵衣藻的蛋白组学。
在技术重复(A)和生物学重复(B)中，Label-free均能检测到更多的蛋白。
Label free比iTRAQ具有更好的灵敏度(precision)，但是精确度（Accuracy)稍差一些。
苏黎世大学的Silvio Hemmi团队同时用iTRAQ和Label-free技术研究了人腺病毒的蛋白组。
研究通过iTRAQ和Label free所获得差异蛋白，并通过western blot验证，验证发现，Label free较iTRAQ具有更好的准确性。
参考文献：
1.Patel, V.J., et al.,A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. J Proteome Res, ): p. 3752-9.
2.Wang, H., S. Alvarez, and L.M. Hicks, Comprehensive comparison of iTRAQ and label-free LC-based quantitative proteomics approaches using two Chlamydomonas reinhardtii strains of interest for biofuels engineering. J Proteome Res, ): p. 487-501.
3.Trinh, H.V., et al., iTRAQ-Based and Label-Free Proteomics Approaches for Studies of Human Adenovirus Infections. Int J Proteomics, : p. 581862.