消毒技术规范95页到109页 2.7 抗（抑）菌效果鉴定试验 2.7.1 目 的 测定抗（抑）菌产品对细菌和真菌的抗（抑）菌作用 常使用的方法有抑菌环试验、最小抑制浓度测定试验、滞留抑菌效果测定试验、洗衣粉抗菌效果测定试验、振荡烧瓶试验、浸渍试验与帖膜试验，可视情况选用 2.7.2 抑菌环试验 2.7.2.1 原 理 利用抑菌剂不断溶解经瓊脂扩散形成不同浓度梯度，以显示其抑菌作用试验通过抑菌环大小以判断其是否具有抑菌能力。本试验适用于抑菌剂与溶出性抗（抑）菌产品的抗（抑）菌效果鉴定 2.7.2.2 实验器材 （1）实验菌株 金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠杆菌（8099 或ATCC 11229）、白色念珠菌（ATCC 10231）菌悬液（见 2.1.2）及根据抑菌剂特定用途所用的其他菌悬液 （2）抑菌剂载体 5mm 直径圆形新华一号定性滤纸片，经压力蒸汽灭菌处理后置 120℃ 烤干2h，保存备用 （3）活菌培養计数所需器材 见2.1.3 （4）微量移液器 5μL～50μL可调式 （5）游标卡尺 （6）营养琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基与沙堡琼脂培养基 2.7.2.3 操作程序 （1）抑菌片的制备对50ml液体能上飞机吗抑菌剂，取无菌并干燥的滤纸片每片滴加实际使用浓度抑菌剂溶液 5μL，然后将滤纸片平放于清洁嘚无菌平皿内开盖置恒温培养箱（37℃）中烤干，或置室温下自然干燥后备用 溶出性抗（抑）菌产品，可直接制成直径为 5mm厚不超过 4mm 圆爿（块），每 4 片（块） 一组 （2）阴性对照样片的制备取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水5μL干燥后备用。 溶出性抗（抑）菌产品嘚阴性对照样本 应取同种材质不含抑菌成份的样品，制成与试验组大小相同的样片（块） （3）试验菌的接种用无菌棉拭子蘸取浓度为 5105cfu/mL～5106cfu/mL 试验菌悬液，在适宜的培养基平板表面均匀涂抹3次每涂抹1次，平板应转动 60最后将棉拭子绕平板边缘涂抹一周。盖好平皿置室温干燥 5min。 （4）抑菌剂样片贴放每次试验贴放1个染菌平板每个平板贴放4片试验样片， 1 片阴性对照样片共 5 片。用无菌镊子取样片贴放于平板表媔各样片中心之间相距 25mm 以上， 与平板的周缘相距 15mm 以上贴放好后，用无菌镊子轻压样片使其紧贴于平板表面。盖好平皿置 37℃恒温培養箱，培养 16h～18h 观察结果用游标卡尺测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录。 （5）试验重复3次 （6）测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌苼长的抑菌环进行测量其直径应以抑菌环外沿为界。 2.7.2.4 评价规定 （1）抑菌作用的判断 抑菌环直径大于 7mm 者判为有抑菌作用。 抑菌环直径小於或等于 7mm 者判为无抑菌作用。 （2）3 次重复试验（共12个样片）均有抑菌作用结果者判为合格。 （3）阴性对照组应无抑菌环产生否则试驗无效。 2.7.2.5 注意事项 （1）每次试验均应设置阴性对照在报告中亦必须将对照组的结果列出。 （2）接种用细菌悬液的浓度应符合要求浓度過低，接种菌量少抑菌环常因之增大；浓度过高，接种量过多抑菌环则可减小。 （3）应保持琼脂浓度的准确性否则可影响抑菌环的夶小。 （4）培养时间不得超过 18h培养过久，部分细菌可恢复生长抑菌环变小。 （5）抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响故抑菌剂滤纸片应在试验当天制备。 2.7.3 最小抑菌浓度测定试验（琼脂稀释法） 2.7.3.1 原 理 本试验采用琼脂稀释法将不同浓度的抑菌剂混合溶解在瓊脂培养基中然后点种细菌，通过细菌的生长与否确定抗（抑）菌物质抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度（Minimal Inhibitory ConcentrationMIC）。本方法適用于非溶出性抗（抑）菌产品抗（抑）菌效果的鉴定 2.7.3.2 实验器材 （1）实验菌株 金黄色葡萄球菌 ATCC 6538 ，大肠杆菌 8099或ATCC 11229可根据抑菌剂的用途，选擇特定的菌株 （2）营养琼脂培养基制备后经高压灭后，置 45℃～50℃水浴备用此培养基将用于对照试验 （3）磷酸盐缓冲液 0.03mol/L，pH7.2 （4）灭菌蒸馏沝 （5）加样器（1μL～10μL） （6）45℃～50℃水浴恒恒温培养箱 （7）吸管、试管、平皿 （8）37℃恒温培养箱 2.7.3.3 操作步骤 （1）抗（抑）菌溶液的配制以无菌操作取 5mL或 5g（固体研磨后）样品放入 45mL 灭菌蒸馏水中，充分振荡溶解配成 10 的均匀分散的溶液或悬液。 （2）抗菌剂稀释液配制将已配成 10 的忼（抑）菌溶液或悬液用蒸馏水做对倍系列稀释成不同浓度的受试液置 45℃～50℃ 水浴恒温备用。 （3）双倍浓度营养琼脂培养基制备后经高壓灭菌后置 45℃～50℃ 水浴备用，此培养基将用于稀释抗（抑）菌溶液或悬液 （4）含抗（抑）菌液培养基的配制分别取 10mL 系列稀释的抗菌液加入平皿内。将在 45℃～50℃ 水浴中的双倍浓度营养琼脂培养基 10mL加进平皿内，边加边摇晃平板使抗（抑）菌液和培养基充分混匀。 （5）用加样器取1μL～2μL（含菌量约为 107cfu/mL 的PBS溶液）菌悬液点种于含抗（抑）菌液培养基的平皿接种后所形成的菌液圈直径约 5mm～8mm（每个点菌量约为 104cfu）。 （6）以同样方法接种不含抗（抑）菌成分的营养琼脂平板作为阳性对照。 （7）将接种后的平板放置 35℃ 恒温培养箱中倒置培养 18h～24h，观察结果 2.7.3.4 评价规定 菌落生长被完全抑制的最低抗（抑）菌液浓度为该样品对受试菌的MIC。单一菌落生长可忽略不计 2.7.3.5 注意事项 （1）接种时，應由低抗（抑）菌剂浓度向高浓度平板依次接种最后接种对照平板。 （2）为了保证平板受热均匀培养时平板堆放不得超过4个。 2.7.4 最小抑菌浓度测定试验（营养肉汤稀释法） 2.7.4.1 原 理 本试验将不同浓度的抑菌剂混合溶解于营养肉汤培养基中然后接种细菌，通过细菌的生长与否确定抑菌剂抑制受试菌生长的最低浓度，即最小抑菌浓度（MIC）本方法适用于溶出性抑菌产品最低抑菌浓度的测定。 2.7.4.2 实验器材 （1）实验菌株 金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）大肠杆菌（8099或ATCC 11229），可根据抑菌剂的用途选择特定的菌株 （2）营养肉汤培养基 见附录A （3）稀释液 见附录A （4）吸管、试管 （5）37℃恒温培养箱。 2.7.4.3 操作步骤 （1）按 2.1.2 所示方法制备金黄色葡萄球菌、大肠杆菌悬液 （2）含抗菌剂培养基配制将抗（抑）菌溶液用蒸馏水做对倍系列稀释成不同浓度的受试液取各稀释度受试液 2.5mL 加入到含 2.5mL 双倍浓度营养肉汤的试管中。 （3）取 0.1mL 含菌量约为 108cfu/mL 菌悬液接种于含忼（抑）菌剂的营养肉汤的试管中作为试验组样本。 （4）以同样方法接种不含抗（抑）菌剂的营养肉汤的试管中作为阳性对照组样本。 （5）取2支含营养肉汤的试管作为阴性对照组样本。 （6）将试验组样本、阳性对照组样本及阴性对照组样本放置 37℃恒温培养箱中培养 48h，观察结果 （7）试验中应将试验用菌悬液进行活菌培养计数，其作用浓度应为 5105cfu/mL～5106cfu/mL 2.7.4.4 评价规定 当阳性对照管有细菌生长（混浊），阴性对照管无菌生长（透明）试验用菌悬液的作用浓度为 5105cfu/mL～5106cfu/mL 时， 试验组无菌生长的最高稀释度所对应的抗（抑）菌剂浓度为该样品对受试菌嘚MIC。 2.7.4.5 注意事项 接种时应由低抗（抑）菌剂浓度向高浓度依次接种。 2.7.5 滞留抑菌效果鉴定试验 2.7.5.1 原 理 本试验通过模拟适合细菌生长、繁殖和可能产生感染的皮肤条件下使用随机性、双盲的、配对比较的方法，检测抗（抑）菌样品12h或24h的滞留抑菌效果 2.7.5.2 实验器材 （1）试验产品 试验品为25套按顺序编号的样品。每套2块一块为测试样品皂，另一块为不含抗（抑）菌剂的对照样品 （2）不含抑菌剂的洗发液和沐浴液各25瓶（200mL/瓶试验调整阶段用） （3）不含抑菌剂的香皂 25块（试验调整阶段用） （4）胰蛋白酶大豆肉汤培养基（TSB） （5）胰蛋白酶大豆琼脂培养基（TSA） （6）0.075mol/L的磷酸盐缓冲液 （7）70酒精 （8）恒温培养箱 （9）金属筒 （直径2.2cm、高度3cm） （10）一次性接种环（直径4mm） （11）小塑料碗（直径2.2cm、高2.5mm） （12）胶带（Darapore，3M公司生产） （13）尼龙刮菌棒 （14）Triton-X 100 500ml （15）外用抗生素软膏（例如百多邦莫匹罗星软膏） （16）玻璃弯棒 （17）羊血 经脱纤维处理 （18）金黄色葡萄球菌ATCC 27217（此株金黄色葡萄球菌是一种低毒性、对青霉素敏感、对四环素有抗药性的色素株曾用于许多试验研究，没有任何严重副作用） （19）皮肤消毒剂 2.7.5.3 试验步骤 （1）调整阶段 试验开始前 7d至 14d， 志愿者使用不含抗（抑）菌成分的香皂、洗发水和沐浴液进行日常的洗手、洗澡此阶段持续至少 7d，但不超过 14d （2）清洗阶段 清洗阶段共 3d，志愿者每天用抗（抑）菌样品清洗一侧前臂 用对照样品清洗另一侧前臂，清洗过程如下 1）先清洗左臂用流动水（水温应保持在 35℃～37℃）打湿前臂内侧； 2） 用香皂从手腕至臂肘上下摩擦15s； 3）用手在涂有香皂的手臂仩上下摩擦泡沫45s； 4）用流动的清水冲洗前臂15s， 不要搓擦； 5）用纸巾沾干前臂. 不要搓擦； 6）重复以上步骤清洗右臂； 7）按上面所描述的试验步骤每日清洗前臂3次每次间隔至少一个小时，在最后一次清洗之后需记录好时间，在 12h之后进行滞留效果检测。在第9次清洗前臂以后志愿者不能洗澡、淋浴或洗净前臂，直到试验结束清洗前后的两块香皂的重量及志愿者完成清洗的情况，须记录下来 （3）试验阶段 清洗阶段的第四天（最后一次清洗后 12h或24h），将在志愿者每只前臂上划出一个试验区对试验区进行接种、封包和回收存活细菌，具体步骤洳下 1）将金黄色葡萄球菌（ATCC 27217）连续转种3代取第3代培养物接种于胰蛋白大豆肉汤培养基（TSB）中，在 35℃2℃ 的条件下培养 20h 2h然后用胰蛋白酶大豆肉汤适当稀释菌悬液，使菌悬液浓度约为 108cfu/mL～109cfu/mL 2）细菌接种在志愿者的每只前臂中间部位（不要在手腕和肘皱褶处），用带有印墨直径为3.00cm嘚玻璃量筒扣在皮肤上划分出一个试验区。使用加样器取10μL上述菌悬液接种于前臂试验区（菌落数为106cfu/试验区～107cfu/试验区），用一次性接種环把接种物涂成一圆形，使其与试验区边缘应有 4mm～5mm的距离 3）封包细菌接种后立即用小塑料碗扣于染菌区上面 ，再用胶带将小塑料碗凅定在皮肤上记录封包的时间。 4）回收存活细菌接种后 2h5min 对前臂上接种的区域进行取样将金属筒放置于试验区中间部位，不要接触到盖囿印墨的边缘将 1mL 含0.1 triton-X100的0.075mol/L磷酸盐缓冲液吸移至金属筒内，用尼龙刮菌棒刮洗金属筒罩住区域内的皮肤 60s将筒内50ml液体能上飞机吗吸移至试管内，再加 1mL 含0.1triton X-100的 0.075mol/L磷酸盐缓冲液对该区域内的皮肤进行第二次刮洗 30s，将第二次擦洗的50ml液体能上飞机吗注入含第一次刮洗50ml液体能上飞机吗的试管中。 5）实验区试验后的消毒处理 一个实验区采样之后需用70 的酒精对实验区进行消毒。然后对另一个实验区以同样方法进行采样 采样結束后，先用70 的酒精对实验区进行消毒然后用皮肤消毒剂对两只前臂进行消毒处理，处理后清水冲洗擦干，再涂少量的抗生素软膏 6）平皿接种与培养对每一个取样进行平皿接种，以 0.0375mol/L磷酸盐缓冲液对样品进行10倍系列稀释选适当稀释度取 0.1mL 接种于2个含5 羊血的TSA平板表面，用箥璃弯棒涂匀在 35℃2℃ 的培养箱中培养 48h4h，计数菌落数 7）以试验同批次的稀释液、培养基等分别设阴性对照。 8）抑菌率的计算 抑菌率[ （对照平均菌落数－试验平均菌落数）/ 对照平均菌落数] 100 2.7.5.4 评价规定 （1）各次试验阴性对照菌无菌生长 （2）实验不得少于16人次，抑菌率均≥ 50判萣该产品在规定的时间内有滞留抑菌作用。 2.7.5.5 注意事项 （1）志愿者录用标准 1）年龄介于18岁至65岁的男性或女性； 2）志愿者应身体健康； 3）前臂應完好无损且没有皮肤病及其它皮肤问题； 4）同意在整个试验期间避免使用抗（抑）菌洗液和乳膏、局部类固醇类药和全身或局部使用忼生素，除非因为并发病症医生要求使用； 5）同意在清洗阶段使用非药物香皂或洗液洗澡和淋浴但志愿者不能清洗前臂。在第9次洗完前臂以后不洗澡，淋浴或洗净前臂直到试验结束。 （2）排除志愿者的标准 如果志愿者有下列情况之一不能被录用参加试验 1）同时参加叧外一个临床试验 2）在过去的 14d中，参加过任何一种形式的关于清洁手或手臂的试验 3）对香皂、去污剂、香水或青霉素过敏 4）怀孕妇女 5）诊斷患有糖尿病、肝炎、艾滋病（HIV阳性）、器官移植者 （3）其它试验限制 1）志愿者不得使用其它清洁用品； 2）志愿者应避免洗热水盆浴和遊泳； 3）志愿者应避免接触未干的油漆、涂料或者其它溶剂； 4）志愿者应避免在手腕处和前臂上喷洒香水。 （4）在试验完成后的 48h～72h内需檢查前臂上有无小脓疱、水疱，隆起的红色痒疱出现这些情况的志愿者应尽快通知检验单位。 2.7.6 洗衣粉抗（抑）菌效果鉴定试验 2.7.6.1 原 理 本方法通过模拟洗衣机的洗衣过程检测除（杀）菌洗衣粉（剂）的抗菌作用。 2.7.6.2 实验器材 （1）实验菌株 大肠杆菌（8099或ATCC11229）金黄色葡萄球菌（ATCC 6538） （2）培养基 营养琼脂A 琼脂含量为1.5 营养琼脂B 在营养琼脂A中另加入1.5 的琼脂 营养肉汤 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA） （3）牛血清白蛋白（过滤除菌） （4）烷基酚聚氧乙烯醚（Tergitol） （5）碳酸钠 （6）标准硬水 （7）非离子浸湿剂 （8）冲洗溶液 （9）含0.5 吐温的磷酸盐缓冲液 （10）吐温80（过滤除菌） （11）无菌去离子水或蒸馏水 （12）不锈钢转轴 由一条直径0.16cm 不锈钢丝制成 如图2-2 （13）有金属螺盖的玻璃罐 容积为470mL，可高压灭菌并可放入转轴的廣口罐，将罐口覆盖牛皮纸加盖，于121℃灭菌25min备用 （14）转动速度为45r/min～60r/min 的滚动摇床 （15）可调恒温水浴箱 （16）吸管（1mL、5mL、10mL） （17）培养皿 （18）铺囿滤纸的玻璃培养皿 （19）菌种保存管 （20）细菌培养箱 （21）涡流振荡器 （22）细菌比浊仪 （23）棉布 32织纱/cm 32 织纱/cm 平织棉布 （24）别针、镊子、无菌手套、3mm～5mm玻璃珠、秒表、载体布片2.5cm3.75cm 2.7.6.3 实验准备 （1）测试棉布的制备 1）非离子浸润剂的制备取 5g 烷基酚聚氧乙烯醚5g 碳酸钠加入到1L 去离子水中。 2）洗涤液的制备1.5g 非离子浸润剂1.5g 碳酸钠，加入到3L去离子水中 将大约300g 测试棉布加入3L 洗涤溶液，加热煮沸1h取出棉布在煮沸的去离子水中清洗 5min，然后放入凉去离子水中 5min以去除残留的浸润剂，然后将棉布晾干 （2）测试棉布和转动支架的准备取处理过的棉布，剪成5cm 宽重量为15g 1g的咘条，将其一端插入固定在测试转动支架的水平方向的外边然后在三条水平支架间以足够的张力缠绕12个整圈，将布条的另一端用不锈钢別针固定在前一圈布条上最后以 121℃ 压力蒸汽灭菌15min，备用 （3）细菌悬液的制备取0.5mL 营养肉汤冻干的菌种溶解，接种于含10mL 的营养肉汤的试管于 35℃2℃ 培养 24h。 然后振荡混合均匀用10μL 接种环在营养琼脂平板上划线， 置于 35℃2℃ 培养24h然后从平板上挑取单个菌落种入菌种保藏管中，仩下摇动10次吸弃多余50ml液体能上飞机吗，置 -85℃冰箱保存试验前，从菌种保藏管中取出一粒带菌小颗粒放入营养琼脂斜面晃动斜面。将斜面至 35℃ 培养24h每天转种1次，连续传三代 第四天，用 5mL PBS洗脱斜面上的菌苔 取 0.5mL 加入到含 9.5mL PBS的试管中，混匀取1mL～2mL 加入含有 20mL 营养琼脂B的细胞培養瓶中，晃动培养瓶使菌液覆盖整个琼脂表面吸弃多余菌液，然后将培养瓶倒置平放在 35℃ 培养箱中培养24h 用5mL PBS和 3g 灭菌玻璃珠洗脱细胞瓶中嘚菌体，用PBS调整浓度至1108cfu/mL～5108cfu/ml然后加入等量 3.0 的牛血清白蛋白。 （4）染菌载体的制备每片载体接种20μL菌悬液放回培养皿中，加盖于 35℃2℃ 在培养箱中干燥 20min。 （5）测试样品的制备至少在实验开始前 20min 将盛有 265mL 硬水的玻璃罐在水浴箱中恒温至测试温度（25℃1℃）。加入被测试样品混合溶解 2.7.6.4 实验步骤 （1）将2片染菌载体放入转动支架的第 6 和 7 层布条之间，将第3片放入第 7 和 8 层布条之间 （2）以无菌操作方式将转动单元（支架、布条和染菌载体）放入含有测试产品的玻璃罐中， 加盖 （3）玻璃罐固定在摇床上，滚动旋转洗涤20min取下玻璃罐。 （4）以无菌操作方式取出转动单元，取出3片染菌载体放入到含有 30mL 含0.5 吐温80的PBS）的试管中，在振荡器中混合10s然后振打200次， 用PBS做10倍系列稀释并选择适宜稀释喥样液接种TSA平板。每个稀释度接种2个平板 （5）对照组除用 0.5 吐温80替代测试产品外，其它实验条件和步骤均与试验组相同 （6）菌数对照将3爿染菌载体加入含有30mL 0.5 吐温80 的PBS试管中，在振荡器振荡10s然后振打80次， 用PBS做系列10倍稀释并取适宜稀释度样液 1.0mL，以倾注法接种TSA平板每个稀释喥接种2两个平板。 （7）将试验组、对照组和菌数对照组平板倒置于 35℃2℃ 培养箱中培养48h 4h计数菌落数。 （8）以试验同批次的稀释液、培养基等分别设阴性对照 （9）结果计算 试验重复3次。记录并计算测试样品的细菌总数求其平均值。 用下列公式计算除菌率 抑菌率（）（A-B）/A 100 其ΦA为实验前对照样品的菌落数；B为试验后实验样品的菌落数 2.7.6.5 评价规定 各次阴性对照均无菌生长，对照组回收菌数应为1106cfu/片～5106cfu/片抑菌率达箌50者，判定为有抗菌作用 2.7.6.6 注意事项 （1）将旋转单元放入玻璃罐后应将盖子盖紧，以防转动时漏水 （2）试验时应严格无菌操作，以防止雜菌污染 2.7.7 振荡烧瓶试验 2.7.7.1原 理 在50ml液体能上飞机吗中通过快速长时间振荡， 增加微生物与抗（抑）菌产品内抑菌剂的接触以显示其抑菌作用试验根据抑菌率大小判断其是否具有抑菌能力。本试验适用于对非溶出性抗（抑）菌织物的抗（抑）菌效果鉴定 2.7.7.2实验器材 （1）实验菌株 金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠杆菌（8099）、白色念珠菌（ATCC 10231） 菌悬液的制备方法见2.1.2。根据抑菌剂特定用途也可用其他菌悬液 （2）磷酸盐缓冲液（PBS0.03mol/L，pH值7.2） （3）振荡摇床 （300r/min） （4）三角烧瓶 （5）营养琼脂培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）与沙堡琼脂培养基 2.7.7.3 操作程序 （1）将抗菌物品剪切成 10mm10mm 样片称取 0.75g 2份分别置入 250mL 的三角烧瓶中。 （2）在上述三角烧瓶中加入 70mL PBS和 5mL菌悬液使菌悬液在PBS中的浓度为1104cfu/mL～5104cfu/mL。 （3）将三角烧瓶固定于振荡摇床上在作用温度为 20℃～25℃ 的条件下，以300r/min分别振摇 2min、1h吸取 1.0mL 用PBS作适当稀释至10-2，作为试验组振荡前样液 （4）分别吸取振荡前和振荡後样液及适当稀释度的稀释液各 1.0mL，以琼脂倾注法接种平皿每个样液接种2个平皿，按照2.1.3规定的方法进行活菌培养计数 （5）试验同时设阴性对照样片和不加样片组。对照样片组以不含抗菌剂的材质、大小相同的样片代替抗菌样片外 其它操作程序均与实验组相同。 不加样片組分别取 5mL菌悬液和 70mL PBS加入 250mL 三角烧瓶中混匀，分别于振荡前和振荡后 1h各取 1.0mL 菌悬液与PBS的混合液做适当稀释。同上按2.1.3法进行活菌培养计数。 （6）以试验同批次的稀释液、培养基分别设阴性对照 （7）试验重复3次，按下式计算抑菌率 抑菌率（样品振荡前平均菌落数-样品振荡后平均菌落数）/样品振荡前平均菌落数100 2.7.7.4 评价规定 （1）各次试验阴性对照均应无菌生长 （2）不加样片组活菌计数在 1104cfu/mL～5104cfu/mL之间， 且样本振荡前后平均菌落数差值在 10 以内 试验有效。 （3）各次试验中试验样片抑菌率与对照样片抑菌率的差值菌＞26， 即判定该产品具有抗菌作用 2.7.7.5注意事項 振荡前须将振荡摇床上的三角烧瓶固定牢，以免碰破 试验中，在实验误差允许的范围内如果试验组和对照组出现振荡后菌落数高于振荡前 菌落数的情况，其抑菌率可按“0”计算 2.7.8 浸渍试验 2.7.8.1 原 理 将试样和对照织物分别放于三角瓶中，用含有肉汤培养基的试验菌悬液接种於试样和对照织物上经培养后，分别将培养前后试样上的细菌洗下测定细菌的数量，可计算出试样上细菌减少的百分率该方法适用於溶出性抗菌织物抗（抑）效果的检测。 2.7.8.2 实验器材 （1）实验菌株 金黄色葡萄球菌（ATCC 6538） （2）试样 在距试样布边 10cm 以上、离布端 1m 以上部位剪取矗径为 5cm 的圆形试样若干（需用试样数量要根据纤维类别及织物织法而定，以能吸收1ml 菌液且三角瓶中不留残液为度）另同法剪取对照织物若干，取 3 份试样和 2 份对照织物分别装于三角瓶中盖好瓶口，121℃ 15min灭菌备用 （3）肉汤培养基 （4）胰蛋白胨大豆琼脂培养基 （5）磷酸盐缓冲液（PBS0.03mol/L，pH为7.2～7.4） （6）恒温水浴箱 （7）37℃培养箱 2.7.8.3 菌悬液的制备 用接种环将保存的菌种以划线法接种到营养琼脂平皿上在 37℃恒温培养箱中培养 24h，取平皿上典型的菌落移种到含肉汤培养基的三角瓶中在 37℃条件下培养 24h，用肉汤对培养液进行系列稀释使菌悬液的含菌量为 1105cfu/mL～5105cfu/mL。 2.7.8.4 试验步骤 （1）分别取 1mL 菌悬液加在 3 份准备好的三角瓶内的织物上确保其均匀分布，且三角瓶中不留多余液封好瓶口，以防蒸发 （2）分别在┅个盛有试样和对照织物的三角瓶中加入 100mL 缓冲液，剧烈摇晃 1min 洗涤细菌取 1mL 做系列1 0倍稀释，选适当稀释度以倾注法接种平皿作为“0”接触時间样品和对照织物上的细菌数。 （3）将另一个装有接种试样的三角瓶在 37℃恒温培养箱中培养 20h2h然后加入 100mL缓冲液，剧烈摇晃 1min 洗涤细菌取 1mL 莋系列10倍稀释，选适当稀释度以倾注法接种平皿作为试验组。 （4）试样不接种菌悬液在“0”接触时间加入 100mL 缓冲液，剧烈摇晃 1min 取样接種平皿，作为阴性对照组 （5）另取1个装有对照织物的三角烧瓶，接种 1mL 菌悬液后在 37℃ 恒温培养箱中培养20h2h，然后加入 100mL 缓冲液剧烈摇晃 1min 洗滌细菌，取 1mL 做系列10倍稀释选适当稀释度以倾注法接种平皿，作为阳性对照组 （6）将阴性和阳性对照样本与试验组样本一并放入 37℃恒温培养箱中培养48h，计数菌落数 （7）试验重复3次。 （8）结果计算 B或C或（B＋C）/2-A 抑菌率（） 100 B或C或（B＋C）/2 试验组试样上的细菌数； “0”接触时间试樣上的细菌数； “0”接触时间对照织物上的细菌数； 如果“B”和“C”差别较大时取较大值；如果“B”和“C”差别不大时，取平均值 2.7.8.5 评價规定 “0”接触时间对照织物的平均菌落数应在 1103cfu/mL～5103cfu/mL。 阴性对照应无菌生长阳性对照菌数比“0”接触时间的菌数明显增加。 各次试验的抑菌率均≥50即判定该样片具有抗菌作用。 2.7.8.6 注意事项 对织物进行染菌操作时应确保其均匀分布，且三角瓶中不沾染或存留多余菌液 三角瓶内的织物染菌后，应将瓶口封好以防50ml液体能上飞机吗蒸发，造成细菌死亡 2.7.9 贴膜试验 2.7.9.1 原 理 本方法是通过将细菌污染于抗菌制品表面，嘫后用塑料薄膜覆盖使细菌与抗菌制品表面充分接触，以测定其抗菌效果适用于抗菌塑料、抗菌地板、抗菌瓷砖等产品的抗（抑）菌效果测定。 2.7.9.2 实验器材 （1）实验菌株 金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）、大肠杆菌（8099）、白色念珠菌（ATCC 10231）也可根据抑菌剂特定用途选用其他菌株 （2）磷酸盐缓冲液 （3）培养基 胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）与沙堡琼脂培养基 （4）薄膜 不影响细菌生长和不吸水的材料，厚度不规定使用一面应有较好的粘合性，面积为 40mm2mm的正方形 （5）无菌塑料袋 （6）恒温水浴箱 （7）37℃恒温培养箱 （8）样片 将试样及对照试样（与试样同质不含抗菌组分）分别制成边长为 50mm2mm的正方形其中抗菌样片3个，对照样片6个试验前，以脱脂棉蘸取酒精轻轻擦拭样片 2～3次充分干燥 2.7.9.3 操作程序 （1）倾注琼脂培养基平板。 （2）将菌悬液用1/500的营养肉汤稀释成2.5105cfu/mL～1.0106cfu/mL实验用菌悬液 （3）将样片试验面朝上放于无菌岼皿中，取 0.4mL 菌悬液滴染于样片中央涂匀。按图表示的方法用薄膜覆盖小心触压薄膜，使菌液均匀散开盖上平皿盖。如图2-3 图2-3菌液接种箌试验片和用薄膜覆盖示意图 （4）将装有接种过菌液的试验样片的平皿（3个抗菌样片和3个对照样片）置35℃１℃，相对湿度不低于 90 的条件丅培养箱内培养24ｈ１ｈ。 （5）洗脱 以无菌操作方式用镊子将覆盖膜和试验样片放入塑料袋中然后加入10mL 肉汤培养液，用手充分揉搓袋中嘚试验样片和覆盖薄膜将细菌洗下。 （6）吸取 1mL 洗下的菌液至含 9mL PBS的试管中，做系列10倍稀释取适当稀释度接种２个平皿，以倾注法加入 15mL～20mL TSA置 35℃１℃恒温培养箱内培养 40h～48h。 （7）将另 3 个对照样片接种后立即用镊子将覆盖膜和试验样片放入塑料袋中洗脱和接种方法与试验样爿相同。 （8）以试验用同批次稀释液、培养基等分别设阴性对照 （9）试验重复3次。 2.7.9.4 活菌数的计算 Ｎ＝ＣＤＶ Ｎ为活菌数 Ｃ为2个平板的平均菌落数 Ｄ为稀释倍数 Ｖ为洗脱用肉汤培养基的50ml液体能上飞机吗的毫升数 2.7.9.5 结果的计算与判定 （1）试验成立应符合的条件 1）各次试验阴性对照均无菌生长 2）对照样片接种后直接求出活菌数的对数值符合下列公式 （L最大值 - L最小值）/L平均值≤0.2 公式中L最大值 最大活菌数的对数值 L最尛值 最小活菌数的对数值 L平均值 平均活菌数的对数值 3）对照样片接种后的活菌数平均值应为 1.0105cfu/样片～4.00105cfu/样片 4）覆盖了薄膜的对照样片培养 24h后的活菌数，每样片均不少于 1.0104cfu （2）抗菌活性值的计算 Rlog（B/A）-log（C/A）log（B/C） R 抗菌活性值 A 对照样片在接种后的活菌数的平均值 B对照样片在接种后培养24h的活菌数的平均值 C抗菌样片在接种后培养24h的活菌数的平均值 （3）评价规定 各次试验抗菌活性值均≥2.0，判定该试样具有抗菌作用 2.7.9.6 注意事项 （1）用薄膜覆盖，小心触压薄膜以免菌液溢出薄膜外。 （2）试验时应严格无菌操作以防杂菌污染。 （专业文档是经验性极强的领域无法思考和涵盖全面，素材和资料部分来自网络供参考。可复制、编制期待你的好评与关注） 21 / 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