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最近要做电转染，查了一些资料，看到说是质粒的量和细胞数量比例也是影响转染效率的一个比较大的因素，是不是说质粒加多了也不好呢？还有就是普通的高糖DMEM可否直接用作电转染呢？亲们，谢谢啊！
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电转染的原理是通过高压在细胞膜上瞬间打孔，使质粒穿膜而入。这种方法电压是最重要的因素，否则细胞都开花了，像是嘣的爆米花。质粒量的多少我记得比脂质体转染要多，加太多也没用。主要是电压要摸索好。直接在DMEM中就行。
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电转原理楼上的已经说了 我说一下我的经验吧，先声明一下我用的是ES细胞和线性化质粒一起做的电转，首先你要选择处于指数生长期的细胞，为了保持电转后的细胞存活率，第二，细胞和质粒的比例我用过30ug-80ug：106-107都行，细胞与质粒比是影响电转率的重要因素，但不是影响电转后成功与否的最重要因素，细胞或质粒少一点就是阳性克隆少一点，筛选任务重一点，最重要的因素是电转的条件，而电转条件中最重要的因素是电转仪参数的设定，脉冲时间过长细胞直接大部分死亡，细胞质物质外流，到时候整个培养皿都会很黏稠，细胞根本无法生长，这个情况我遇到过几次，再就是电转缓冲液离子浓度，太低太高都不行。
给你附上一篇应其龙教授的文献 参考吧: v' Y6 E! }: g7 w4 `1 g
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把胚胎干细胞板块顶起！顶起！狂顶起！
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* c! T$ ?$ y9 Z; L3 e# W6 F
电压一般现在的电转都是用200V，所以200V可以用做参考数字
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电转染很方便的说，好久好久没做过，就当复习了~~
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我用的是小鼠ES，电转时细胞2000万，质粒25ug，230V，500uF
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回复 6 ^! O8 f% Y* n& B! g+ O7 \
) q* R% h5 T2 [+ A# j6 `7 ~
电转染仪都有配套的试剂盒的，哪能随便用培养基呢，就是脂质体转染还要用“双无”培养基呢，我们实验室的两个品牌的都是有专门试剂盒的，不过听上海的同学说，他们实验室买了一个不用试剂盒的电转染仪好像是日本产的，莫非楼上将的就是这个？
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我们实验室买的是invitrogen出的电转仪，有配套的试剂盒，挺方便的
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做最好的自己！
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最近看了一些这方面的资料，感觉不同的细胞差异太大了- c* _: l& ]. l* ?) G" P- O
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电转化方案
&&这是本人早前做酵母电转化实验的收集的一些材料,主要内容是本人的实验方案与选用仪器的一些基本知识.
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摘要 : 说到转染，Invitrogen认第二，没人敢认第一。这么多年来，Invitrogen一直保持着转染市场的领先地位，而L2K(Lipofectamine 2000)对于做转染的人来说也几乎是无人不晓。当然，Invitrogen并没有躺在功劳簿上睡大觉，为顺应新的研究趋势，它在近几年推出了一系列新产品。如今，除了L2K这张王牌，Invitrogen手上的好牌还不少呢。
说到转染，认第二，没人敢认第一。这么多年来，Invitrogen一直保持着转染市场的领先地位，而L2K(Lipofectamine 2000)对于做转染的人来说也几乎是无人不晓。当然，Invitrogen并没有躺在功劳簿上睡大觉，为顺应新的研究趋势，它在近几年推出了一系列新产品。如今，除了L2K这张王牌，Invitrogen手上的好牌还不少呢。
效率与温和之间的最佳平衡&&Lipofectamine& LTX
强壮的细胞系自不必说，L2K便是很好的选择。但对于某些对敏感的细胞系，L2K的毒性也是无法回避的问题。于是，Invitrogen推出了毒性较低的Lipofectamine& LTX。这也意味着在获得高转染效率和高蛋白表达的同时，无需担心转染后细胞的活力。
当然，转染效率也是大家首要考量的因素，特别是在研究原代细胞、神经细胞和干细胞这些难对付的细胞时。当然，Invitrogen也考虑到了。PLUS& 试剂就是一个秘密武器，让大家在必要时候出手。Lipofectamine& LTX与PLUS& 试剂配合使用，可以完成难转染的细胞和原代细胞的成功转染，包括人类脐带动脉细胞(HUVEC)、RAW267.3 巨噬细胞、神经元细胞及人类。
转染过程也非常简单，无需去除转染复合物，也无需在转染后更换培养基。只需将、Lipofectamine& LTX及PLUS&试剂加入细胞中，24小时之后，即可分析基因表达情况。
当然，还有一点需要特别注明，Lipofectamine& LTX试剂不能用于小分子RNA的转染，这一点与L2K可不同。因此，在选择与RNA的共转染试剂时，还须选择L2K。
还有一个好消息!以往，Invitrogen的转染试剂只有0.75 ml/1 ml的包装。对于某些不经常做转染，或者只想试一下的客户来说，这个包装太大了，于是他们便改投了Fu的怀抱。Invitrogen当然也意识到了这个问题，不久前推出了0.1 ml的Lipofectamine& LTX & PLUS小包装，价格约为528元。常规的1 ml包装则为4800元。
高效转染RNA&&Lipofectamine& MAX
从最初的siRNA到如今的miRNA，随着小分子RNA研究的持续升温，研究人员也急需一种高效的RNA转染试剂。于是，Invitrogen推出了Lipofectamine& RNAiMAX转染试剂。它是一款RNAi特异的阳离子脂质体试剂，可以高效地将小分子RNA导入多种细胞类型。
Lipofectamine& RNAiMAX 转染试剂可以在10倍的浓度范围内获得最大的干扰效果以及极佳的细胞存活率，这个特点使得Lipofectamine& RNAMAX的转染条件极易优化，以便在实验中使用最低的siRNA浓度，从而降低细胞毒性。尽管Lipofectamine& RNAiMAX的说明书建议以10nM siRNA 作为优化干扰效果的起始浓度，但是仅用1nM siRNA 也可以获得较好的靶基因干扰效果。不过，这款试剂只能用于小RNA的转染，不能用于共转染。如果需要共转染，只能借助经典的Lipo 2000。
操作流程(顺式转染)：用Opti-MEM分别稀释RNA分子和Lipofectamine RNAiMAX，将两者混合，室温下孵育10-20分钟。加入培养细胞中，在37&C孵育24-48小时。
Lipofectamine& RNAiMAX的价格约为：4315元/0.75 ml，7410元/1.5 ml。最新推出的0.1 ml小包装价格为738元。虽然目录价看上去贵一些，但实际用量较省(24孔板的每孔建议用量为1 &l)，因此综合来看性价比较高。
如何对付百毒不侵的细胞&&Neon转染系统
就普通的细胞系而言，传统的转染试剂大多都能实现高效的转染。然而，有些细胞&百毒不侵&，比如干细胞或原代细胞，你还真拿它没办法。无论怎么优化，转染试剂就是不灵。这时，不妨换个思路，试试电穿孔吧。
Life Technologies公司在2009年推出了一种新一代的电穿孔仪&&Neon&转染系统。它可将核酸(包括质粒DNA和siRNA)高效导入几乎任意一种动物细胞内，包括难以转染的原代细胞、干细胞和造血系统来源的细胞，同时保持高的细胞活性。
新颖的转染室
大家可能注意到，Neon系统中没有带传统的电转杯。确实，这就是它的独特之处。Neon系统用一个特殊的移液器吸头取代了传统的电转杯。移液器吸头内使用24K镀金电极，可形成更为均匀的电场，同时最大限度地减少温度升高和pH值变化幅度，在确保细胞高效转染的同时，也更为温和，保证细胞存活率更高。
装有镀金电极的Neon移液器吸头(右)与普通电转杯(左)的比较。研究表明，与普通电转杯相比，狭长形移液器吸头可产生更为均匀的电场，从而提高细胞存活率和转染效率。
实践证明，Neon系统能够对多种难以转染的细胞进行高效转染，包括原代星形胶质细胞、原代树突状细胞、Jurkat、小鼠胚胎干细胞等。多种细胞类型可获得超过75%的转染效率。觉得摸索电转条件无从下手?别担心，在转染前，你只需登录Neon的网页(/neon)，就能找到细胞特异的实验条件，无需反复优化，轻轻松松提高转染效率和细胞活性。另外Life Tech还有一个专门供Neon客户分享他们的实验结果及经验的网站Neon Protocol Exchange(/index.jspa)，在这里有很多成功案例，供你参考。你也可以与大家分享你的成功案例。
有时，细胞很珍贵，若每次转染所需的细胞量较少，那么你就能开展更多更复杂的实验。Neon系统带有两种吸头：10 &l和100 &l，让您可根据实验要求灵活选择，而不像传统电穿孔仪那样只能转染固定量的细胞。使用Neon系统，每次最少可转染2&104个细胞，最多可转染2&107个细胞。当然，这并非绝对。若你的细胞更少或更多，也可一试，据Life Tech的专家介绍，有一位客户曾成功转染了5000个原代毛囊细胞。
由于省掉了电转杯，转染过程也更为简化：只需将细胞和核酸吸入Neon移液器吸头中，再插入到移液器吸头架上，并按&Start&即可。转染过后，直接将细胞加入培养容器中。既没有繁琐的移液，也不需要清洗电转杯。而且，通用的试剂盒适用于所有细胞类型，不用购买多个试剂盒，也无需鉴定最佳缓冲液。当然，一次性使用的24K金电极吸头成本不低。因多次使用会导致金包被变薄，改变吸头的电导率，所以每个吸头最多只能使用两次。
一直是经典&&Lipofectamine& 2000
之前曾详细介绍了Lipofectamine& 2000这个王牌产品，这里不再赘述，感兴趣的同学请看.
作者：青岚 点击：次
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&&电转化注意事项
电转化注意事项
一、&&制备感受态的菌液收集时间：
1、准确测定OD值：OD在1.2～1.5之间。
1） 为了准确测定OD值，建议将菌液稀释不同浓度测定（1、2、4、8、16倍稀释，看其OD值是否呈线性关系）。每个倍数做3－5个重复，应该可以大致推断OD值是否准确！菌液看上去浑浊，但OD值不高，很可能OD稀释倍数不够！
2） OD值是否测准也可以这样估算：OD600为40左右时，菌体湿重（6000rpm离心5min）约0.95g/10ml。高密度发酵时菌体湿重将相应下降。
2、75ml的菌，经18h左右的培养，最后sorbital洗涤完毕后，50ml离心管里所剩菌体特别浓，需要1ml sorbitol才可溶解为糊状。正常培养的OD在1.2～1.5之间的500ml菌液，收集的感受态也用1ml稀释的，没那么粘稠。可以看看降低培养温度（27摄氏度）或缩短培养时间（12h）。
3、甚至不用转接,直接挑单克隆在50－100mlYPD中摇过夜，效果也很好
二、制备感受态的菌液量
如果只转一个样品，50ml就够了，一般50ml的培养液如果OD值正常的话够做10管感受态的，其他的按比例缩小。用大试管摇5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受态，每一步的离心时间30秒就行。整个流程时间短，制备好的感受态用来做转化的效率很高。
山梨醇离心，洗涤的过程之后的重悬的时候注意浓度，不要过于粘稠和稀释。
三、感受态的保存
感受态细胞做好后由于电转化杯还没有处理好等原因，在冰上放几个小时再做可能有一定的影响，尽量马上制备马上转化。如果感受态细胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分装，-70 或 -80 摄氏度保存。
另附：酵母GS115点种分离纯化
接种GS115于5ml YPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布 YPD平板，30℃培养48 小时，用 YNB基本培养基和含His的补充培养基作点种分离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在基本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。
四、电转化注意点：
1、感受态做好后，最后一次吸出sorbital时，不是直接倒调的，而是用毛细管轻吸出来的，这样可能使剩下的感受态纯净些。
2、最后用毛细管取出100ul出来，加入质粒，混匀！（怕量不够，吸得很多，电转时效果反而不好。 ）
3、电转杯清洁处理:一般先冲洗，洗净；然后浸泡在75%的乙醇中；使用前我们都是放在超净台上，开启紫外，边吹风晾干，边进行紫外照射。电转杯的新包装或重复使用可能对转化率有一定的影响。
4、电击的时候，电压数以及电击时间可以摸索一下，适当增加电压或者延长电击时间都可以。电击条件比如1.5kv，放电4.8～5.5ms。电击所有过程都要尽量在冰上进行，电击时间可以减少一点，设置为5ms左右，电击之后马上加入预冷的山梨醇溶液，转移至EP管，30度静止培养1h。如果菌体悬液浓度比较大的时候，在制备感受态的时候要留心一下操作中的问题了。
5、电击之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度摇床低速培养1h，再涂板。
6、注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。
7、转化后1ml用sorbitol重悬的细胞悬液不能全部涂在一块板子上，按标准程序制作的感受态一般3块左右可能比较合适，以干燥后看见一薄层淡淡的白色为宜。转化子会在白色的薄层上长出圆韵、饱满的大菌落的。
五、转化试剂和培养基的正确准备方法
1、MD板子提前几天做好，放在冰箱里，涂板的时候吸收效果会好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些积层，反而不利于生长。
2、YNB42度水浴一会，然后过滤除菌，YNB是加到培养基里面的，去离子水pH偏低，建议直接用蒸馏水就可以（关系不是太大）。
3、山梨醇，以及无菌去离子水均是冰冻，存放在4度冰箱中
4、一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ul ddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT处理细胞，转化效率很高，可以试试。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。
5个电转化方案
方法一：高效
1.收集菌体
取1mlGS115过夜培养物(OD约6-10) 分装到1.5ml EP管中，4℃、10000g 离心1min，弃上清，沉淀用无菌水(4℃)洗涤，同样条件下离心，弃上清。
2.菌体处理
加入1ml处理液，室温下放置20min。
0.6M sorbitol
10mM TrisHCl(pH7.5)
3.离心，弃上清，加入1ml 1M sorbitol ，离心，弃上清，
4.用1M sorbitol洗涤二次，到最终体积约为80μl.（菌体太多可适当弃去部分）
5.加入10μl.经过BglⅡ酶切处理的工程质粒，混匀后转入 电击杯中，冰浴5min.
6.电转. 1.5kv，25μF，200Ω条件下进行电转。
7.电击后立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出后于30℃培养2h。
8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin，涂布的量分别为100、200微升，剩余的经离心处理后全部涂在一个平板上)
有一点要注意的是处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。
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扫描下载送金币细胞电转染(电转,电阻,电容) - 细胞实验 - 生物秀
标题: 细胞电转染(电转,电阻,电容)
摘要: [细胞电转染(电转,电阻,电容)] 我最近要做细胞的电转染,查文献找电转的条件,有几篇说用1 2kV,25uF,电阻最大,用0 2cm的电转杯;有的说270V,960uF,电阻最大,用0 4cm电转杯,为什么电压差那么大呢?电容和电压有什么关系呢? 麻烦告诉我一下,谢谢! 关键词:[电转 电阻 电容]……
我最近要做细胞的电转染,查文献找电转的条件,有几篇说用1.2kV,25uF,电阻最大,用0.2cm的电转杯;有的说270V,960uF,电阻最大,用0.4cm电转杯,为什么电压差那么大呢?电容和电压有什么关系呢? 麻烦告诉我一下,谢谢!
回复和电转buffer有关系，如果用PBS之类的离子型buffer，电压就要很高，电容也很高，才能达到电转时间在10ms左右。
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